KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG Niên khóa: 2011 - 2015 Tháng năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN TẤN ĐỨC NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG KS TRẦN THÙY TRANG Tháng 07 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin cảm ơn ba mẹ sinh thành dạy dỗ nên người, cảm ơn gia đình bên ủng hộ suốt năm qua Cảm ơn thầy, cô môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tận tình bảo truyền thụ cho em tri thức quý báu thời gian em học trường Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh, phòng Công nghệ Vi sinh tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận En xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Tấn Đức chị Trần Thùy Trang tận tình hướng dẫn dìu dắt cho em suốt thời gian qua Cảm ơn tất anh, chị bạn phòng Công nghệ vi sinh nhiệt tình giúp đỡ tạo cho em môi trường làm việc tốt thời gian thực đề tài TÓM TẮT Bệnh thán thư ớt gây nấm Colletotrichum spp nguyên nhân làm giảm nghiêm trọng chất lượng sản lượng ớt Một số biện pháp hóa học kết hợp với phương pháp canh tác đưa chúng lại có ảnh hưởng tiêu cực với môi trường làm giảm chất lượng nông sản có dư lượng thuốc BVTV Các phương pháp sinh học, đặc biệt sử dụng chế đối kháng sinh học xem phương pháp có nhiều tiềm to lớn thân thiện với môi trường Chúng tiến hành phân lập phân lập mẫu nấm Colletotrichum spp từ trái ớt bệnh vườn ớt xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus spp từ mẫu đất vườn ớt huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang Sau phân lập đề tài thu 28 chủng nấm 19 chủng vi khuẩn, kết định danh sinh học phân tử xác định có 28 chủng nấm thuộc loài C acutatum 17 chủng vi khuẩn thuộc loài B subtilis B amyloliquefaciens, chủng vi khuẩn thuộc loài B licheniformis Kết đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi cấy đĩa petri cho thấy chủng vi khuẩn CG9, CG8, CG10, CG5 CG6 thuộc vào nhóm đối kháng mạnh với hiệu đối kháng đạt 60%, kế chủng CG1, CG7, D3, D1, CG4, CG11, D4 BA98 có hiệu đối kháng 50% chủng lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu đối kháng yếu 50% MỤC LỤC Trang DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT FAO: Food and Agriculture Organization BVTV: Bảo vệ thực vật TT CNSH TPHCM : Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh NCBI: National Center for Biotechnology Information DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chất kháng sinh số loài vi khuẩn Bacillus spp 11 Bảng 3.1 Trình tự mồi ITS5 ITS4 26 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR .26 Bảng 3.4 Trình tự mồi 20F 1500R 27 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR .28 Bảng 4.1 Đặc điểm đại thể vi thể chủng nấm Colletotrichum spp 30 Bảng 12 Đặc điểm đại thể vi thể chủng vi khuẩn Bacillus spp .37 Bảng 4.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo chủng nấm phân lập sau ngày .41 Bảng 4.3 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp .46 Bảng 4.4 Kết định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi .49 Bảng 4.5 Kết định danh sinh học phân tử Bacillus spp .50 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Capsicum annuum Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư ớt Hình 2.3 Triệu chứng bệnh thán thư ớt Hình 2.4 Chu kỳ gây bệnh nấm Colletotrichum spp .8 Hình 2.5 Phát sinh loài phân bố chi Bacillus 12 Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu .20 Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B subtilis B licheniformis 23 Hình 3.3 Quy trình định danh nấm Colletotrichum spp sinh học phân tử 25 Hình 3.4 Quy trình định danh vi khuẩn Bacillus spp sinh học phân tử 27 Hình 1.5 Phương pháp đồng nuôi cấy kiểm tra hiệu đối kháng 29 Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư ớt 30 Hình 4.2 Kết số phản ứng sinh hóa thực 47 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR số dòng nấm 48 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR số dòng vi khuẩn Bacillus spp 48 Hình 4.5 Biểu đồ hiệu đối kháng vi khuẩn với nấm 52 Hình 4.6 Đối kháng chủng Bacillus spp với nấm C acutatum 53 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annuum) loại gia vị có nguồn gốc từ lâu đời khoảng 7500 năm trước Công nguyên sớm Có chứng khảo cổ khu vực tây nam Ecuador cho thấy ớt hóa 6000 năm trước Cho đến ngày ớt trồng nhiều nơi giới xuất thường trực bàn cơm người Theo báo cáo FAO năm 2003 ớt xem trồng quan trọng vùng nhiệt đới Diện tích đất trồng ớt giới vào khoảng 1.700.000 cho mục đích lấy tươi khoảng 1.800.000 để làm ớt bột Tổng diện tích 3.729.900 cho tổng sản lượng 20 triệu Tuy nhiên vấn đề giá thời tiết không ổn định vấn đề bệnh hại trồng nguyên nhân quan trọng gây nên nhiều khó khăn cho người trồng ớt Theo Po Po Than, 2008 bệnh thán thư gây loài nấm Colletotrichum spp., bệnh héo xanh gây vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, bệnh khảm gây virus chilli veinal mottle (CVMV) virus khảm dưa chuột (CMV) loại bệnh phá hoại nghiêm trọng ớt Bệnh thán thư có mức gây hại nghiêm trọng làm giảm từ 10 – 80 % sản lượng ớt thu hoạch quốc gia phát triển (Poonpolgul Kumphai, 2007) Ở Việt Nam diện tích trồng ớt vùng chuyên canh ớt vào khoảng 3000 ha, năm cao (1998) lên tới 5700 Theo báo cáo chi cục BVTV TP.HCM năm 2013 diện tích canh tác rau bị bệnh thán thư 178,76 ha, chiếm 15% tổng diện tích thành phố Hồ Chí Minh Do vấn đề đối phó với bệnh thán thư vô quan trọng Hiện vùng trồng ớt phương pháp đối phó chủ yếu phương pháp canh tác luân canh với không thuộc họ cà, tiêu hủy phế phẩm, lên luống, tưới rửa sau mưa, bón vôi vào đất diệ mầm bệnh, xử lí hạt giống trước gieo trồng Tuy có giảm phần dịch bệnh chủ yếu để phòng bệnh lúc ruộng ớt bị bệnh phải sử dụng phương pháp hóa học cách phun số thuốc trừ nấm Amista, Loverice, Melody duo 66, Ringo-L 20SC, Amistar 250SC, Plant 50WP, Antracol 70WP, Polyram 80DF, Daconil 500SC,Score 250EC, 10 22 C3.6 23 C3.7 24 C3.8 25 C3.9 55 26 C4.3 27 C4.9 28 C5.1 29 C5.4 56 Tất chủng nấm phân lập gây bệnh cho ớt điều kiện in vitro sau ngày với triệu chứng giống mẫu bệnh thu thập trước vết bệnh có dạng hình thoi, vết bệnh ẩm ướt, nhũn lõm xuống, vết bệnh có màu cam nâu Một số chủng 1.3, 1.10, 3.2 có mức độ gây bệnh yếu chủng lại 4.1.6 Test sinh hóa định danh chủng Bacillus spp Bảng 4.3 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp T T Chủng Gram 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 BA10 BA88 BA92 BA98 BA99 CG1 CG4 CG5 CG6 CG7 CG8 CG9 CG10 CG11 CG12 D1 D2 D3 D4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bào tử Kỵ khí + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Tinh bột + + + + + + + + + + + + + + + + + + + VP Methyl Red + + + + + + + + + + + + + + + + + + + (+): phản ứng dương tính, (-): phản ứng âm tính 57 - Citrat e + + + + + + + + + + + + + + + + + + + NaCl 6,5 % + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 55oC Catalase + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + A B C - E - D F G - Hình 4.2 Kết số phản ứng sinh hóa thực A: Phản ứng phân giải tinh bột, B: Phản ứng catalase, C: Nhuộm bào tử, D: Phản ứng citrate, E: Phản ứng methyl – red, F: Phát triển kỵ khí, G: Phản ứng VP 58 4.1.7 Định danh phương pháp sinh học phân tử 4.1.7.1 Kết PCR khuếch đại trình tự vùng gen 4.1.7.1.1 Nấm Colletotrichum spp Các chủng nấm ly trích DNA tổng số sau thực PCR khuếch đại vùng gen ITS – rDNA cặp mồi ITS4 ITS5 Leader Kb Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR số dòng nấm Colletotrichum spp Khuếch đại vùng gen ITS – rDNA sử dụng cặp mồi ITS4 ITS5 cho sản phẩm có kích thước khoảng 580 bp, kết phù hợp với kết nghiên cứu Wipornpan cs năm 2005 4.1.7.1.2 Vi khuẩn Bacillus spp Các chủng vi khuẩn khuếch đại vùng gen 16S RNA phương pháp PCR khuần lạc với cặp mồi 20F 1500R Leader Kb Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR số dòng vi khuẩn Bacillus spp Sau phản ứng PCR, sản phẩm điện di cho thấy phản ứng tạo sản phẩm có kích thước khoảng 1500 bp 4.1.7.2 Kết định danh dòng nấm Colletotrichum spp 59 Các sản phẩm PCR sau trình tinh gửi giải trình tự Kết sau chỉnh sữa load lên BLAST NCBI để so sánh với trình tự có sẵn GenBank có kết sau: Bảng 4.4 Kết định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi T T Chủn g C1.1 C1.2 C1.3 C1.4 C1.6 C1.7 C1.9 C1.10 C2.1 10 C2.2 11 C2.3 12 C2.4 13 C2.5 14 C2.6 15 C3.2 16 C3.3 17 C3.4 18 C3.5 19 C3.6 20 C3.7 Chủng tham khảo Accession Identities Loài Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301920.1 566/567 (99%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum AB697047.1 565/566 (99%) Colletotrichum scovillei Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum LC011101.1 579/580 (99%) acutatum Colletotrichum AJ301920.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301920.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum LC011101.1 574/576 (99%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum AJ301921.1 566/566 (100%) acutatum Colletotrichum LC011101.1 580/582 (99%) acutatum 60 21 C3.8 LC011101.1 581/582 (99%) 22 C3.9 AJ301921.1 566/566 (100%) 23 C4.3 AJ301921.1 566/566 (100%) 24 C4.9 LC011101.1 583/584 (99%) 25 C5.1 AJ301921.1 566/566 (100%) 26 C5.4 AJ301921.1 566/566 (100%) Vì sử dụng cặp mồi ITS4 ITS5 có tính Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum chuyên biệt chưa cao, đồng thời sản phẩm tạo có kích thước tương đối ngắn so sánh GenBank hầu hết chủng có trình tự vùng ITS – rDNA khuếch đại cặp mồi ITS4 ITS5 tương tự hay chí trùng khớp với tương tự với trình tự cùa loài C acutatum Trước loài xem loài nhiên với phát triển khoa học người ta xác định loài cụ thể thuộc loài C acutatum Colletotrichum scovillei chủng C2.1 phân lập Vậy kết luận có 27 chủng C acutatum chủng C2.1 C scovillei 4.1.7.3 Kết định danh dòng vi khuẩn Bacillus spp Các sản phẩm PCR sau trình tinh gửi giải trình tự Kết sau chỉnh sữa load lên BLAST NCBI để so sánh với trình tự có sẵn GenBank có kết sau: Bảng 4.5 Kết định danh sinh học phân tử Bacillus spp TT Chủn g BA10 BA88 BA92 BA98 BA99 CG1 CG4 CG6 Accession CP010556.1 GU826165.1 CP010556.1 GU826165.1 KP059106.1 KM892856.1 CP010556.1 GU826165.1 CP009748.1 KJ123715.1 KP059106.1 KJ721204.1 KP729134.1 CP009611.1 CP003838.1 Chủng tham khảo Identities Loài 1473/1478 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1473/1478 (99%) Bacillus subtilis 1471/1475 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1471/1475 (99%) Bacillus subtilis 1153/1180 (98%) Bacillus amyloliquefaciens 1153/1180 (98%) Bacillus subtilis 1476/1477 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1476/1477 (99%) Bacillus subtilis 1414/1420 (99%) Bacillus subtilis 1414/1420 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1448/1450 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1448/1450 (99%) Bacillus subtilis 1435/1447 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 1435/1447 (99%) Bacillus subtilis 1503/1511 (99%) Bacillus amyloliquefaciens 61 10 11 12 13 14 15 16 17 18 DQ444283.1 1504/1513 (99%) Bacillus subtilis KP059106.1 1462/1463 (99%) Bacillus amyloliquefaciens CG7 KJ721204.1 1462/1463 (99%) Bacillus subtilis KP119809.1 1476/1477 (99%) Bacillus amyloliquefaciens CG8 CP009611.1 1476/1477 (99%) Bacillus subtilis CP010556.1 1446/1459 (99%) Bacillus amyloliquefaciens CG9 GU826160.1 1446/1459 (99%) Bacillus subtilis KP119809.1 1478/1479 (99%) Bacillus amyloliquefaciens CG10 CP009611.1 1478/1479 (99%) Bacillus subtilis CP010556.1 1446/1453 (99%) Bacillus amyloliquefaciens CG11 CP009611.1 1446/1453 (99%) Bacillus subtilis AY913755.1 1423/1432 (99%) Bacillus subtilis CG12 EF656455.1 1424/1434 (99%) Bacillus licheniformis CP010556.1 1444/1451 (99%) Bacillus amyloliquefaciens D1 CP009611.1 1444/1451 (99%) Bacillus subtilis AY913755.1 1424/1434 (99%) Bacillus subtilis D2 EF656455.1 1423/1433 (99%) Bacillus licheniformis CP010556.1 1444/1451 (99%) Bacillus amyloliquefaciens D3 CP009611.1 1444/1451 (99%) Bacillus subtilis CP010556.1 1453/1460 (99%) Bacillus amyloliquefaciens D4 CP009611.1 1452/1459 (99%) Bacillus subtilis Hệ thống phân loại Bacillus dựa phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA năm 1990 Theo đó, B subtilis Cohn 1872 loài có quan hệ gần gũi B amyloliquefaciens, B licheniformis, B megaterium, B coagulans, B anthracis, B cereus B thuringensis xếp vào phân nhóm thứ tổng số phân nhóm Phương pháp phân loại truyền thống dựa hình thái tế bào, bào tử đặc tính sinh hóa khả phân tách loài Hơn nữa, hầu hết loài có mức độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA cao (lớn 99%) kết lai DNA - DNA loài với B subtilis nhỏ 70% (Trịnh Thành Trung, 2013) Do sau giải trình tự thử nghiệm sinh hóa trước xác định chủng B subtilis hay B amyloliquefaciens, nhiên loài khác khả tạo enzym (F G Priest, 1987) nên dức theo yêu cầu đề tài không đặc biệt phải tách riêng hai loài Riêng chủng D2 CG12 có khả phát triển 55oC nên xác định B licheniformis Vậy kết luận có 17 chủng B subtilis hay B amyloliquefaciens chủng D2, CG12 B licheniformis 62 4.1.8 Khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn Bacillus spp với nấm Colletotrichum spp điều kiện in vitro Tiến hành đối kháng đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn với nấm C acutatum kết ghi nhận sau Hình 4.5 Biểu đồ hiệu đối kháng chủng vi khuẩn với nấm C acutatum Kết thu sau xử lí cho thấy tất chủng có khả đối kháng với nấm C acutatum nhiên mức độ đối kháng khác theo chủng Trong chủng chủng CG9, CG8, CG10, CG5 CG6 thuộc vào nhóm đối kháng mạnh với hiệu đối kháng đạt 60%, kế chủng CG1, CG4, CG7, D3, D1, CG11, D4 BA98 có hiệu đối kháng 50% chủng lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu đối kháng yếu 63 Hình 4.6 Đối kháng chủng Bacillus spp với nấm C acutatum Ta thấy đồng nuôi cấy chủng Bacillus spp với nấm C acutatum nấm bị ức chế phát triển cách rõ ràng 4.2 Thảo luận Phần em chưa hiểu lắm, viết hết, anh chị để em nghiên cứu thêm nha! 64 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trên sở kết nghiên cứu rút kết luận sau: Phân lập 28 chủng nấm Colletotrichum spp từ mẫu ớt bệnh vườn ớt thuộc ấp Bàu Đưng, xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi Phân lập thu thập 19 chủng vi khuẩn Bacillus spp Sau định danh sinh học phân tử xác định có 28 chủng thuộc loài C acutatum 17 chủng vi khuẩn thuộc loài B subtilis B amyloliquefaciens, chủng thuộc loài B licheniformis Kết đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi cấy đĩa petri cho thấy chủng vi khuẩn phân lập có khả đối kháng với nấm loài C acutatum tương đối tốt, chủng CG9, CG8, CG10, CG5 CG6 thuộc vào nhóm đối kháng mạnh với hiệu đối kháng đạt 60%, kế chủng CG4, CG1, CG7, D3, D1, CG11, D4 BA98 có hiệu đối kháng 50% chủng lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu đối kháng yếu 50% 5.2 Đề nghị Sau hoàn thành đề tài có số đề nghị cải tiến từ đề tài sau: Cần phân lập thêm mẫu nấm bệnh từ vùng địa lí khác để làm phong phú thêm loài nấm Colletotrichum spp Phân lập thêm chủng Bacillus spp môi trường thực vật để phù hợp cho việc tạo chế phẩm dạng phun Thực giải trình tự chủng nấm sử dụng thêm số cặp mồi chuyên biệt dành cho loài Colletotrichum spp Có thể thực thêm thi nghiệm sâu để tách rõ loài B subtilis va B amyloliquefaciens có quan hệ gần gủi với Tiến hành thí nghiệm nhằm tạo chế phẩm ứng dụng thực tế TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng việt 65 Lester W Burgess, Timothy E Knight, Len Tesoriero, Phan Thúy Hiền, Cẩm nang chuẩn đoán bệnh Việt Nam, 2009, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia quy trình phòng trừ bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại ớt đồng ruộng, 2013, QCVN 01- 138 : 2013/BNNPTNT Vũ Triệu Mân, 2007, Bệnh chuyên khoa Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội * Tài liệu tiếng nước Roberts PD, Pernezny K, Kucharek TA Anthracnose caused by Colletotrichum sp on pepper Journal of University of Florida/Institute of Food and Agricultural Sciences 2001 P Montri, P.W.J Taylor, O Mongkolporn, 2009 Pathotypes of Colletotrichum capsici, the causal agent of chili anthracnose in Thailand, Am Phytopathol Soc 93: 17–20 Kok-Gan Chan, Siew-Zhen Tiew and Ching-Ching Ng 2007 Rapid isolation method of soil bacilli and screening of their quorum quenching activity Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, Vol 15 (3) : 153-156 Ken Pernezny and Tim Momol ,2006, Florida Plant Disease Management Guide: Pepper Tong N, Bosland PW 1999 Capsicum tovarii, a new member of the Capsicum complex Euphytica; 109(2):71–72 doi: 10.1023/A:1003421217077 Alcaraz, L.; Moreno-Hagelsieb, G.; Eguiarte, L E.; Souza, V.; Herrera-Estrella, L.; Olmedo, G 2010 Understanding the evolutionary relationships and major traits of Bacillus through comparative genomics BMC Genomics 11: 332 66 10 M Dworkin, The Prokaryotes - Vol 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria Springer Publisher 2006 11 Yong Joon Chung, Mark T Steen, and J Norman Hansen, 1992 The Subtilin Gene of Bacillus subtilis ATCC 6633 Is Encoded in an Operon That Contains a Homolog of the Hemolysin B Transport Protein, Journal of Bacteriology, o 4, 21-9193/92/041417-06$02.00/0, Journal of Bacteriology American Society for Microbiology American 12 Sun H Paik, Anu Chakicherla, and J Norman Hansen, 1998, Identification and Characterization of the Structural and Transporter Genes for, and the Chemical and Biological Properties of Sublancin 168, a Novel Lantibiotic Produced by Bacillus subtilis 168, Journal of Biological Chemistry Vol 273 23134 – 23142 13 Axel G Stöver and Adam Driks, 1999 Regulation of Synthesis of the Bacillus subtilis Transition-Phase, Spore-Associated Antibacterial Protein TasA Journal of Bacteriology No 17 0021-9193/99/$04.00+0 American Society for Microbiology American 14 Dirk Vollenbroich,1 Georg Pauli,2 Muhsin Ozel,2 And Joachim Vater1, 1997 Antimycoplasma Properties and Application in Cell Culture of Surfactin, a Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis Appied and enviromental microbiology No 0099-2240/97/$04.0010 American Society for Microbiology American 15 Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming Tschen, and Shih-Tung Liu, 1999 Functional and Transcriptional Analyses of a Fengycin Synthetase Gene, fenC, from Bacillus subtilis J Bacteriol, 181(16): 5060–5067 American society for microbiology.American 16 Erwin H Duitman, Leendert W Hamoen, Martina Rembold, Gerard Venema, Harald Seitz, Wolfram Saenger, Frank Bernhard, Richard Reinhardt, Manuel Schmidt, Christian Ullrich, Torsten Stein, Frank Leenders, and Joachim Vater, 67 1999 The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid synthase Proc Natl Acad Sci U S A, 9; 96(23): 13294–13299 The National Academy of Sciences 17 Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa, and Kozo Ochi, 2002 Bacilysocin, a Novel Phospholipid Antibiotic Produced by Bacillus subtilis 168 Antimicrob Agents Chemother, 46(2): 315–320 American society for microbiology.American 18 FAO, 2003, FAO Production Yearbook 2001 FAO pusblisher 19 Po Po Than, H Prihastuti, S Phoulivong, P.W.J Tayler, K.D Hyde, 2008, Chilli anthracnose disease caused by Colletotrichum species, J Zhejiang Univ 9: 764–778 20 S Poonpolgul, S Kumphai, 2007, Chilli pepper anthracnose in Thailand, in: First Int Symp Chill Anthracnose, p 23 21 Isaac S Fungal Plant Interaction London: Chapman and Hall Press; 1992 p 115 22 F G Priest, M Goodfellow,L A Shute, and R C W Berkeley,1987 "Bacillus amyloliquefaciens sp nom., nom rev." International Journal of Sytematic Bacteriology GY, p 69-71 23 Gherna R, Pienta P, Cote R: American Type Culture Collection Catalogue of Bacteria and Phages Rockville: American Type Culture Collection;1989 24 Neyra C, Atkinson LA, Olubayi O, Sadasivan L, Zaurov D, Zappi E: Novel microbial technologies for the enhancement of plant growth and biocontrol of fungal diseases in crops Cahiers Opt Méd 1996, 31 : 447-456 68 * Tài liệu từ internet 25 http://www.duoclieu.org/2012/02/ot-capsicum-annuum-l-ho-ca-solanaceae.html 26 http://web.mst.edu/~microbio/BIO221_2009/B_subtilis.html 27 https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_subtilis 28 http://vi.wikipedia.org/wiki/%E1%BB%9At 69 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM... học thành phố Hồ Chí Minh, phòng Công nghệ Vi sinh tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận En xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Tấn Đức chị Trần Thùy Trang tận tình hướng dẫn dìu dắt... ớt hóa 6000 năm trước Cho đến ngày ớt trồng nhiều nơi giới xuất thường trực bàn cơm người Theo báo cáo FAO năm 2003 ớt xem trồng quan trọng vùng nhiệt đới Diện tích đất trồng ớt giới vào khoảng