KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.

CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM

COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH

THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG

Niên khóa: 2011 - 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.

CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM

COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH

THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT

KS TRẦN THÙY TRANG

Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh,phòng Công nghệ Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.

En xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Tấn Đức và chị Trần Thùy Trang đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt cho em trong suốt thời gian qua Cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn phòng Công nghệ vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo cho em môi trường làm việc tốt nhất trong thời gian thực hiện đề tài

TÓM TẮT

Bệnh thán thư trên ớt gây ra bởi nấm Colletotrichum spp là một trong những

nguyên nhân làm giảm nghiêm trọng cả về chất lượng và sản lượng ớt Một số biệnpháp hóa học kết hợp với phương pháp canh tác đã được đưa ra nhưng chúng lại cóảnh hưởng tiêu cực với môi trường cũng như làm giảm chất lượng nông sản do có dưlượng thuốc BVTV Các phương pháp sinh học, đặc biệt là sử dụng cơ chế đối khángsinh học được xem là phương pháp có nhiều tiềm năng to lớn và thân thiện với môitrường

Chúng tôi tiến hành phân lập phân lập các mẫu nấm Colletotrichum spp từ trái

ớt bệnh tại các vườn ớt ở xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi và phân lập các mẫu vi

khuẩn Bacillus spp từ mẫu đất tại các vườn ớt ở huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang.

Sau phân lập đề tài thu được 28 chủng nấm và 19 chủng vi khuẩn, kết quả định

danh bằng sinh học phân tử xác định được có 28 chủng nấm thuộc loài C acutatum và

17 chủng vi khuẩn thuộc loài B subtilis hoặc B amyloliquefaciens, 2 chủng vi khuẩn thuộc loài B licheniformis Kết quả đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi

cấy trên đĩa petri cho thấy các chủng vi khuẩn CG9, CG8, CG10, CG5 và CG6 thuộcvào nhóm đối kháng mạnh nhất với hiệu quả đối kháng đạt trên 60%, kế đó là cácchủng CG1, CG7, D3, D1, CG4, CG11, D4 và BA98 có hiệu quả đối kháng trên 50%

và các chủng còn lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu quả đối kháng yếu dưới 50%

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây ớt (Capsicum annuum) 3

2.2 Bệnh thán thư trên cây ớt 4

2.3 Nấm Colletotrichum spp 7

2.4 Vi khuẩn Bacillus spp .10

2.5 Các nghiên cứu liên quan 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Phân lập Colletotrichum spp 20

3.3.2 Phân lập các chủng Bacillus spp 21

3.3.3 Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh phân lập được 21

3.3.3 Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp 21

3.3.4 Kiểm tra sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp 22

3.3.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 25

3.3.6 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp với nấm Colletotrichum spp trong điều kiện in vitro 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả 31

4.1.1 Kết quả phân lập nấm Colletotrichum spp 31

4.1.2 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp 31

4.1.3 Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp 37

4.1.4 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 38

4.1.5 Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp 41

4.1.6 Thử nghiệm sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp 47

4.1.7 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 49

4.1.8 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp với nấm Colletotrichum spp trong điều kiện in vitro 53

4.2 Thảo luận 54

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh ở một số loài vi khuẩn Bacillus spp 11

Bảng 3.1 Trình tự mồi ITS5 và ITS4 26

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3.4 Trình tự mồi 20F và 1500R 27

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 3.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28

Bảng 4.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp 30

Bảng 12 Đặc điểm đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus spp 37

Bảng 4.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo các chủng nấm đã phân lập sau 7 ngày 41

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp 46

Bảng 4.4 Kết quả định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi 49

Bảng 4.5 Kết quả định danh sinh học phân tử Bacillus spp 50

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Capsicum annuum 3

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt 5

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh thán thư trên lá ớt 5

Hình 2.4 Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp 8

Hình 2.5 Phát sinh loài và phân bố của các chi Bacillus 12

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu 20

Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B subtilis và B licheniformis 23

Hình 3.3 Quy trình định danh nấm Colletotrichum spp bằng sinh học phân tử 25

Hình 3.4 Quy trình định danh vi khuẩn Bacillus spp bằng sinh học phân tử 27

Hình 1.5 Phương pháp đồng nuôi cấy kiểm tra hiệu quả đối kháng 29

Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt 30

Hình 4.2 Kết quả một số phản ứng sinh hóa đã thực hiện 47

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng nấm 48

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng vi khuẩn Bacillus spp 48

Hình 4.5 Biểu đồ hiệu quả đối kháng của vi khuẩn với nấm 52

Hình 4.6 Đối kháng của các chủng Bacillus spp với nấm C acutatum 53

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây ớt (Capsicum annuum) là một loại cây gia vị có nguồn gốc từ rất lâu đời

khoảng 7500 năm trước Công nguyên hoặc sớm hơn Có những bằng chứng khảo cổ ởcác khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước.Cho đến ngày nay thì ớt đã được trồng ở rất nhiều nơi trên thế giới và xuất hiện thườngtrực trên bàn cơm của mọi người Theo báo cáo của FAO năm 2003 cây ớt được xem

là một trong những cây trồng quan trọng ở vùng nhiệt đới Diện tích đất trồng ớt trênthế giới vào khoảng 1.700.000 ha cho mục đích lấy quả tươi và khoảng 1.800.000 ha

để làm ớt bột Tổng diện tích 3.729.900 ha cho tổng sản lượng 20 triệu tấn

Tuy nhiên ngoài vấn đề giá cả và thời tiết không ổn định thì vấn đề bệnh hạicây trồng cũng là một nguyên nhân quan trọng gây nên nhiều khó khăn cho người

trồng ớt Theo Po Po Than, 2008 bệnh thán thư gây ra bởi loài nấm Colletotrichum spp., bệnh héo xanh gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, và bệnh khảm

gây ra bởi virus chilli veinal mottle (CVMV) hoặc virus khảm dưa chuột (CMV) lànhững loại bệnh phá hoại nghiêm trọng nhất ở ớt Bệnh thán thư có mức gây hạinghiêm trọng nhất có thể làm giảm từ 10 – 80 % sản lượng ớt thu hoạch ở các quốc giađang phát triển (Poonpolgul và Kumphai, 2007)

Ở Việt Nam diện tích trồng ớt ở các vùng chuyên canh ớt vào khoảng 3000 ha,năm cao nhất (1998) lên tới 5700 ha Theo báo cáo của chi cục BVTV TP.HCM trongnăm 2013 thì diện tích canh tác rau bị bệnh thán thư là 178,76 ha, chiếm 15% trên tổngdiện tích ở thành phố Hồ Chí Minh

Do đó vấn đề đối phó với bệnh thán thư là vô cùng quan trọng Hiện nay tại cácvùng trồng ớt phương pháp đối phó chủ yếu là phương pháp canh tác như luân canhvới cây không thuộc họ cà, tiêu hủy phế phẩm, lên luống, tưới rửa cây sau mưa, bónvôi vào đất diệ mầm bệnh, xử lí hạt giống trước gieo trồng

Tuy có giảm được một phần nào dịch bệnh những chủ yếu là để phòng bệnhcòn lúc ruộng ớt đã bị bệnh thì phải sử dụng phương pháp hóa học bằng cách phunmột số thuốc trừ nấm như Amista, Loverice, Melody duo 66, Ringo-L 20SC, Amistar

Ridomil 68 WP, Bavistin 68 FL, Carbenzim 50 WP,…có khả năng kiểm soát bệnh hạinhanh.

Nhưng việc sử dụng thuốc không phù hợp có thể để có thể để lại dư lượngthuốc bảo vệ thực vật quá giới hạn trên nông sản gây độc cho sản phẩm, làm giảm uytín và giá trị sản phẩm cũng như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọngđến sự ổn định và bền vững của hệ sinh thái

Trong những năm gần đây xu thế tất yếu trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở ViệtNam nói riêng và trên thế giới nói chung là hướng tới sử dụng các phương pháp sinhhọc thân thiện với môi trường đưa nền nông nghiệp tiến tới nền nông nghiệp hữu cơ.Đặc biệt là việc ứng dụng các vi sinh vật thiên địch trong việc sản xuất các chế phẩmphòng trừ dịch bệnh cây trồng

Một trong những vi sinh vật tiêu biểu được nghiên cứu trong sản xuất chế phẩm

sinh học là Bacillus subtilis và một số chủng khác như B.amyloliquefaciens và B.licheniformis an toàn với người và động vật và có khả năng tổng hợp được nhiều

loại kháng sinh đối kháng được với nấm bệnh và một số vi khuẩn khác đã được nghiêncứu thành công ở nhiều nước trên nhiều đối tượng khác nhau Trên xu thế chung đó

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp.có khả năng đối kháng sinh học với nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây

ớt” nhằm mục đích phát triển loại chế phẩm sinh học phòng bệnh thán thư

Đồng thời đề tài cũng thuộc nhóm các đề tài nghiên cứu ứng dụng Công nghệsinh học vào nông nghiệp, nằm trong chương trình Công nghệ sinh học của thành phố

Hồ Chí Minh giai đoạn 2011 – 2015

1.2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp có khả năng đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum spp nhằm phục vụ cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học

phòng bệnh thán thư trên ớt

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng Bacillus spp.

Nội dung 2: Phân lập và định danh các chủng nấm Colletotrichum spp.

Nội dung 3: Thử nghiệm khả năng đối kháng trong điều kiện in vitro

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây ớt (Capsicum annuum)

2.1.1 Giới thiệu chung

Cây ớt thuộc họ Cà (Solanaceae) chi ớt (Capsicum ) là cây gia vị quan trọng cóxuất xứ từ Mehico, Goatemala và từ trung tâm khởi nguyên Đông Nam Á Cho đếnnay ớt đã được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm vùng nhiệt đới, cậnnhiệt đới và các vùng có khí hậu ôn hòa (Ken Pernezny và Tim Momol ,2006)

Cây ớt (Capsicum annuum) có tên khoa học do chữ Capsa là túi, ý nói quả ớt

giống cái túi, annuum có nghĩa là hàng năm (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Chi Capsicum bao gồm khỏang 20 - 27 loài, 5 loài được thuần hóa và trồng ở

nhiều nơi trên thế giới là C annuum, C baccatum, C chinense, C frutescens, và C pubescens Trong đó C annuum là phổ biến hơn cả (Tong N và Bosland PW, 1999).

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây

ớt

Ớt thuộc loài thân thảo mọc tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phíadưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới Cây có nhiều cành Lá mọc so le, hình thuôn dài,đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1,5 – 2

cm Quả mọc rũ xuống hay quay lên trời, hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài,đầu nhọn Quả chưa chín có màu xanh hoặc tim, quả chín màu vàng hay đỏ Có loại rấtcay, có loại ít cay tùy theo giống và điều kiện canh tác (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hình 2.1 Capsicum annuum

(http://www.kew.org)

Theo Khóa phân loại chi Ớt (Capsicum L.) của Paul G Smith, Capsicum annuum có cánh hoa đồng màu, từ trắng đến xanh vàng sáp (không có đốm hay màu

tương phản khác) Bao phấn xanh tái đến tím Hoa đơn độc (đôi khi 2 hoa trên mắt đầutiên), tràng hoa trắng hoặc trắng lẫn tím, đài hoa tách biệt ở cuối, có răng nhỏ ở mép

Hạt ớt nhỏ dẹp, dạng thận, màu vàng rơm, chiều dài khoảng 3 – 5 mm Câythường cao khoảng 0,5 – 1,5 m Ớt có rễ cọc với nhiều rễ phụ nhưng trong gieo trồngviệc cấy chuyển cây làm rễ bị đứt và phát triển thành một hệ rễ chùm

2.1.3 Giá trị của cây ớt

Giá trị dinh dưỡng: Ớt chứa một loại alkaloid là Capsicain (0,05 – 2%) tập

trung ở biểu bì của giá noãn, là chất gây nên vị cay của ớt và có hàm lượng vitamin Ckhoảng 0,8 – 1% (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngoài ra trong ớt còn có các chất carotenoid,capsorubin, kryptoxanthin, zeaxanthin, lutein, α và β caroten, Capsicosid là mộtsaponin steroid có tác dụng kháng khuẩn, Flavonoid (apiin và luteolin - 7- glucosid),chất đường tới 7% và một số acid hữu cơ như acid citric, acid malic

Giá trị dược liệu: Chất có tác dụng trong ớt là capsaixin, nó có tác dụng gây tại

chỗ trên niêm mạc và trên da cảm giác nóng mạnh, có thể tăng đến cảm giác cháy rát,

nó gây đỏ mà không gây phồng da, là vị thuốc giúp sự tiêu hóa, làm ăn ngon, chóngtiêu

Ớt hoặc capsaixin thường dùng ngoài để làm giảm đau các bệnh đau khớp, đaudây thần kinh, dùng dưới dạng cồn, băng dán hoặc thuốc mỡ, dùng riêng hoặc phốihợp với một số vị khác Ngoài ra, người ta còn dùng lá ớt tươi chữa mụn nhọn, rắn, rếtcắn

2.1.4 Phân bố

Trên thế giới Có nhiều nước trồng ớt như Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Nam

Phi, Tây Ban Nha, Italia, Pháp đặc biệt ở Hungary người ta trồng hàng nghìn hecta,mỗi năm xuất cảng từ 2500 đến 3000 tấn ớt khô

Ở Việt Nam Quỳnh Phụ (Thái Bình) với diện tích 1200 ha, Đại Lộc (QuảngNam), Phù Mỹ (Bình Định), Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc(An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Củ Chi (TP.HCM) và một số tỉnh thành khác

2.2 Bệnh thán thư trên cây ớt

2.2.1 Giới thiệu chung

Vào năm 1992 Isaac cho rằng tên bệnh thán thư (anthracnose) có nguồn từtiếng Hy Lạp có nghĩa ‘coal’, dựa vào việc mô tả đặc điểm vết bệnh có màu tối nhưthan, vết bệnh lõm xuống, chứa các khối bào tử Nhìn chung bệnh thán thư do các loài

Colletotrichum spp gây nên Bệnh thán thư được Halsted (1890) báo cáo lần đầu tại

New Jersey, USA vào năm 1980, Halsted đã mô tả các tác nhân gây ra là

Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum Arx (1957) xem sự phân loại học

đó là tương đương với Colletotrichum gloeosporioides Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra là một trong số những bệnh gây hại nghiêm trọng làm giảm

năng suất từ 10 - 80% Bệnh không chỉ gây hại trên cây ở giai đoạn đang thu hoạchquả mà còn gây hại ở giai đoạn cây non và bảo quả quả sau thu hoạch

Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum spp gây ra bao gồm nấm C acutatum (Simmonds), C capsici (Syd.) Butler và Bisby, C gloeosporioides (Penz.) (Ken Pernezny and Tim Momol ,2006).

Nói chung trong điều kiện thời tiết ấm áp và ẩm ướt, nhiều mưa Nhiệt độkhoảng 27 °C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư(Roberts và cộng sự, 2001)

2.2.2 Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên ớt

Bệnh thán thư gây hại trên thân, lá, quả và hạt nhưng hại chủ yếu trên quả vàogiai đoạn quả chín

Trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó vết bệnh lớn dần tạo thànhcác đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục, vết bệnh phát triển lớn lên và liên kếtnhau làm khô cháy một mảng lá, lá vàng úa và rụng lá hàng loạt (QCVN 01 - 138 :

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư

trên quả ớt Hình 2.3 Triệu chứng bệnh thán thư trên lá ớt

Trên quả chủ yếu xuất hiện ở giai đoạn quả chín Ban đầu là những vết bệnhdạng ngậm nước và sau đó trở nền mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm, sạmlại (có màu nâu vàng hay màu rám nắng) Sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thểlên tới 1 cm đường kính Vết bệnh có thể bao trùm hầu hết bề mặt quả và xuất hiệnnhững tổn thương phức tạp Vết bệnh thường có hình thoi, vòng tròn đồng tâm, lõm,phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh Bề mặtcủa vết bệnh trở nên ẩm ướt, khi nhìn dưới kính lúp soi nổi có thể thấy đĩa cành vớinhững lông gai màu đen Trong một số trường hợp xuất hiện vết bệnh màu nâu màkhông phải là màu da cam và sau đó cũng hình thành những lông cứng khi nhìn dướikính lúp soi nổi Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màutrắng vàng bẩn (QCVN 01 - 138 : 2013/BNNPTNT, 2013, Vũ Triệu Mân, 2007).

Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiện tượng thối ngọn ớt Chồibệnh có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây chết dần hoặc cây bệnh nhẹcho quả ít và chất lượng kém (Vũ Triệu Mân, 2007)

2.2.3 Cơ chế gây nhiễm của nấm bệnh thán thư

Mầm bệnh thán thư thường tồn tại trên phế phẩm cây trồng họ cà hoặc trên vỏhạt và lưu qua nhiều năm Khi gặp điều kiện thuận lợi các mầm bệnh sẽ lây nhiễm vàocác kí chủ thuộc họ cà, gây nên các vết bệnh trên thân, lá, quả Những bào tử mới sinh

ra trong mô bệnh sẽ nảy mầm, hình thành giác bám, rồi hình thành vòi hút xâm nhiễmvào các mô lá quả Sự lây nhiễm thường xảy ra trong suốt mùa mưa ẩm Mưa nhiều vàtưới nước thường xuyên sẽ làm bệnh lây lan nhanh do bào tử được phát tán rộng.(Melanie và Sally, 2004)

2.2.4 Một số biện pháp phòng bệnh thán thư

Chuẩn bị đất trước khi gieo trồng: dọn sạch tàn dư, tiêu hủy cây trồng vụ trước

và cỏ dại, bón vôi bổ sung để nâng pH lên 5,5 – 6,5 để tiêu diệt mầm bệnh trong đất,

bón lót, lên luống

Xử lý hạt giống: ngâm hạt giống trong nước nóng (khoảng 500C) trong 30 phúthoặc sử dụng một số thuốc trừ nấm như KMnO4 (1%) ngâm trong 1 – 2 giờ hoặcKasuran hoà tan 5-7g/1 lít nước, ngâm hạt trong 1 giờ

Phòng trừ bệnh trong quá trình trồng cây: bón phân đầy đủ, cắt bỏ, tiêu hủy cáccành, lá bị bệnh Điều tra định kỳ, khi phát hiện có bệnh cần kịp thời xử lí

Phòng trừ bệnh sau khi thu hoạch: thu gom và tiêu hủy triệt để toàn bộ các bộphận của cây, tiến hành luân canh với cây trồng khác không thuộc họ cà.

2.3 Nấm Colletotrichum spp.

2.3.1 Giới thiệu chung

Nấm Colletotrichum spp được xác định là tác nhân chính gây bệnh thán thư

trên ớt và một số loại cây trồng khác như ngũ cốc, các cây họ đậu, rau cải, cây lâu năm

và cây ăn quả

Theo Pring và các cộng sự, 1995 nhận định nấm Colletotrichum có thể ngủ

đông trên các cây kí chủ khác nhau thuộc họ cà hoặc họ đậu, chúng tồn tại trên các tàn

dư thực vật và các quả bị bỏ lại trên cánh đồng Các loài nấm Colletotrichum sản sinh

ra các hạch nấm nhỏ để tồn tại ở rạng thái ngủ trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặpcác điều kiện bất lợi và có thể sống sót qua nhiều năm

Nấm Colletotrichum được xếp vào giới Fungi, thuộc ngành Ascomycota, lớp

Sordariomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae, giống Colletotrichum

2.3.2 Đặc điểm hình thái nấm

Nấm Colletotrichum spp có đặc điểm là sống nội sinh hay kí sinh bắt buộc, sợi

nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào.Nhiều hạt dầu được sản xuất trong tế bào của hệ sợi nấm, khi trưởng thành sợi nấm trởnên sậm màu và bện xoắn thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng

Colletotrichum spp sinh sản bằng bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong

dạng quả thể là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau cócấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuốngbào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn, kéo dài, đơn bào, dạng liềm,cong, bào tử trong suốt Trên mỗi cụm cuống bào tử là các lông dài cứng, thuôn nhọn,không phân nhánh Đa bào và có cấu trúc như tơ cứng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998)

Sự hình thành số lượng lớn bào tử có thể gây đứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặpđiều kiện thuận lợi mỗi bào tử sẽ mọc một hoặc nhiều ống mầm để hình thành sợinấm Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm hình cầu hoặc không đềugọi là hậu bào tử Nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thờigian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới Trên môi

trường nuôi cấy khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm, khuẩn ty màu trắng đếnhơi nâu, không có vách ngăn (Cao Ngọc Hải, 2012).

Nhiệt độ phát triển thích hợp để nấm nảy mầm và hình thành bào tử là 26

-32oC, tối ưu ở 28oC, nhiệt độ trên 50oC sẽ làm chết bào tử và khuẩn ty, độ ẩm tối ưu là92% (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

2.3.3 Cơ chế gây bệnh của Colletotrichum spp.

Hình 2.4 Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp.

Nấm Colletotrichum spp tồn tại trong tàn dư thực vật, quả, hạt bị bỏ lại trên

cánh đồng khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ xâm nhập vào tế bào chủ bằng nhiều conđường khác nhau như sản xuất một số cấu trúc gây nhiễm vào tế bào chủ: ống mầm,đĩa áp (tạo áp lực), sợi nấm nội bào, sợi nấm sơ cấp, sợi nấm thứ cấp Chúng xâmnhiễm dưới lớp biểu bì của tế bào chủ hoặc trong tế bào Đầu tiên, chúng bám và nảymầm trên bề mặt tế bào chủ, hình thành giác bám có vòi xâm nhiễm tạo áp lực xâmnhập vào tế bào chủ Sau khi xâm nhập, hình thành nên sợi nấm nội bào và sợi nấm sơcấp Từ sợi nấm sơ cấp hình thành nên nhiều sợi nấm thứ cấp Các sợi nấm này đâm

xuyên hoặc len lỏi qua các tế bào, xâm chiếm khắp vùng dưới lớp biểu bì và nhanhchóng lan rộng khắp các mô Các mô bị xâm nhiễm sẽ chết và hình thành các vùnglõm, các vết bệnh sẽ loang dần ra và liên kết với nhau tạo thành các vết bệnh lớn, sau

đó bào tử sẽ được phát tán nhờ gió hay nước mưa làm phát tán bệnh sang các bộ phậnkhác của cây hoặc từ cây này sang cây khác và lặp lại vòng tuần hoàn xâm nhiễm này

2.3.5 Một số loài Colletotrichum spp gây bệnh trên cây ớt.

2.3.5.1 Colletotrichum acutatum

Hình 2.5 Colletotrichum acutatum

Nấm Colletotrichum acutatum lây lan rất nhanh đến nỗi vào thời điểm phát hiện

triệu chứng thì tình trạng bệnh đã rất nghiêm trọng Bệnh thường xuất hiện trên quả vàthỉnh thoảng bị thối cuống lá, với các triệu chứng như tạo vết trũng ngậm nước, sau đó

mở rộng dần và bao phủ hết bề mặt quả trong vòng 2-3 ngày, trên các cơ quan màunâu sẫm sẽ xuất hiện khối bào tử màu hồng Đối với cây trồng khác như cỏ chânngỗng và cần tây, thối ngọn và xoắn lá là triệu chứng chính

Khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy có màu trắng, xanh xám hoặc màu da camnhạt, đôi khi tạo ra sắc tố màu hồng tím đậm Đĩa cành (Conidiomata) thường kémphát triển, với ít hoặc không có lông cứng, đặc biệt là trong nuôi cấy Tế bàoConidiogenous hình trụ, đôi khi phát sinh thành các chùm nhỏ, và tạo bào tử đơn Bào

tử đính có kích thước 8 - 16 mm x 2,5 - 4 mm, hình thoi, thành mỏng, có vách ngăn vàtrong suốt Appressoria rất ít về số lượng có kích thước 6,5 - 11 mm x 4,5 - 7,5 mm,

Hình chùy hoặc tròn và có màu nâu sáng đấn nâu sẫm (Mordue, 1979, Sutton, 1980,Baxter et al.1983 và Gunnell & Gubler,1992).

nấm C gloeosporioides được tìm thấy chiếm 41% trong vỏ hạt, 36% trong nội nhũ

và 2% trong phôi hạt ớt cay Qua quan sát mô tế bào ở cây non cho thấy nấm có khảnăng truyền từ nội nhũ sang trụ dưới lá mầm rồi đến rễ mầm

Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm Ởmột số mẫu phân lập sợi nấm ký sinh chỉ hình thành những chòm liên quan đến sựhình thành quả thể và đôi khi hình thành trên tản nấm non phổ biến hơn so với tản nấmgià Quả thể mở hình thành trên các bộ phận khác nhau của cây trồng, mọc riêng rẽhoặc từng đám hình cầu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85 - 350 µm Bêntrong quả thể có các túi bào tử nằm rải rác, xen kẽ với các sợi nấm vô tính, thường có

8 bào tử túi hình trụ hoặc hình chùy, kích thước 35 - 80 µm x 8 – 14 µm

Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn

về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500 µm, đườngkính 4 - 8 µm, có 1 - 4 vách ngăn

Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ,đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước 9 – 24 µm x 3 - 6 µm Trên môitrường PDA, khối bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh.Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô van hoặc hình quả đấm, kíchthước 6 - 20 µm x 4 - 12 µm.

Tản nấm trên môi trường PDA đầu tiên có màu trắng sau chuyển dần thành màuxám Sợi nấm hình thành mịn, màu trắng đến xám tối trên bề mặt tản nấm Lông gaiđược hình thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp hoặc không có Cụmbào tử màu nâu sẩm đến màu da cam Giác bám và các cấu trúc phụ của chúng hìnhthành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa petri

2.4 Vi khuẩn Bacillus spp.

2.4.1 Giới thiệu chung về Bacillus spp.

Bacillus xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que gồm gần 200 loài các vikhuẩn hình que, Gam dương, hiếu khí thuộc 1 trong 5 chi có khả năng sinh bào tửtrong họ Bacillaceae Theo Bergey, 1994, vi khuẩn Bacillus thuộc giới Bacteria, ngànhFirmicutes, lớp Bacilli, bộ Eubacterriales, họ Bacillaceae, Giống Bacillus.

Hầu hết Vi khuẩn Bacillus là vi sinh vật ưa ấm phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30

- 45oC, tuy nhiên cũng có những loài ưa nóng và một vài loài ưa lạnh Khoảng pH tối

ưu cho Bacillus khá rộng, trong khoảng pH từ 2 – 11

Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử, đây là một trong những đặc điểmquan trọng trong phân lập Khi xử lý mẫu đất ở nhiệt độ cao tuy các tế bào vi khuẩn sẽchết nhưng vẫn còn tồn tại các bào tử nên khi cấy lên đĩa thạch thì sẽ thu được các

khuẩn lạc đa số là của loài Bacillus spp.

Vi khuẩn Bacillus spp có thể tổng hợp được hơn 60 loại kháng sinh như:

subtilin, subtilosin, sublancin, TasA, surfactin, Gramicidin, bacitracin, chlorotetain,mycobacillin, rhizocticins,…Hầu hết việc tạo kháng sinh có liên qua đến quá trình bào

tử hóa, kháng sinh được giải phóng khi tế bào bước vào pha ổn định sau khi chuyểnsang bào tử hóa (Hồ Văn Út Hậu, 2010)

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh ở một số loài vi khuẩn Bacillus spp

a Đối kháng vi khuẩn Gram dương, b Ức chế quá trình tạo sợi, c Kháng sinh phổ

rộng, d Đối kháng nấm, e Đối kháng vi khuẩn Gram âm

Hình 2.5 Phát sinh loài và phân bố của các chi Bacillus (Alcaraz, 2010)

2.4.2 Một số kháng sinh do Bacillus spp tổng hợp

Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm lantibiotic, có tính kháng khuẩn mạnh đối

với vi khuẩn Gram dương như Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci

và clostridia Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấpautoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằngcách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sựdehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệthống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton

Subtilin được tổng hợp trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cânbằng (Yong Joon Chung, 1992).

Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn

Gram âm nhưng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn Gram dương kể cả tế bàodinh dưỡng lẫn bào tử Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bìnhthường trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (Sun H Paik,1998)

TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng

khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tửđược bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào

tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillussubtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (Axel G Stöver, 1999)

Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối kháng mạnh đối

với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động đối với nấm Tácđộng của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp màng lipid kép đồngthời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (DirkVollenbroich,1997)

Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm Fengycin

được tổng hợp nhiều trong phag tăng trưởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăngtrưởng, fengycin vẫn được duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định trong phagcân bằng (Tsuey-Pin Lin,1999)

Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin Các lipopeptide

thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động rất hạn chế với vikhuẩn (Erwin H Duitman,1999)

Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng

hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đó thì giảm dần Bacilysocin là kháng sinh có bảnchất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis Cấu trúc củabacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol Bacilysocinđược tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu củaBacillus subtilis Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin được thựchiện bởi enzyme lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (NorimasaTamehiro,2002)

2.4.3 Một số loài Bacillus spp.

2.4.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là một trực khuẩn Gram dương, thường được tìm thấy trong đất Ban đầu nó được đặt tên là "Vibrio subtilis" khi nó được phát hiện vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg Vào năm 1872 được đổi tên thành "Bacillus subtilis" bởi

Ferdinand Cohn

Bacillus subtilis có mặt ở khắp mọi nơi: không khí, đất và xác bã thực vật Bacillus subtilis cũng có thể được tìm thấy trong cơ thể con người, chủ yếu trên da

hoặc trong đường ruột

Đặc điểm hình thái, sinh sản

B subtilis là trực khuẩn có dạng que nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước

0,5 – 0,8 œm x 1,8 – 3 œm, tế bào vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, chúng có

khả năng di động vì có nhiều tiên mao Khuẩn lạc B subtilis trên môi trường TSA có

dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 5 mm và bề mặt sẽ trở nênnhăn nheo sau 1 – 4 ngày

B subtilis phát triển theo hình thức phân đôi hoặc nảy chồi do sự nứt của bào tử

được hình thành trong điều kiện khắc nghiệt giúp chúng tồn tại trong môi trường đếnkhi điều kiện trở nên thuận lợi Nội bào tử nằm giữa tế bào sinh dưỡng hoặc lệch tâmvới kích thước từ 0,8 – 1,8 œm Có cấu tạo gồm 3 phần: áo bào tử, vỏ bào tử và lõi bào

tử Áo ào tử có cấu tạo từ protein sừng không thấm nước, có khả năng chống chịu vớicác điều kiện bất lợi như lyzozyme, protease, các tia bức xạ Còn vỏ bào tử cấu tạo chủyếu từ peptodoglycan và chứa nhiều calcium dipicolinate giúp bảo vệ lõi bào tử

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

B subtilis là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 25 - 37 độ C và pH

thích hợp trong khoảng 7 – 7,4 Nồng độ muối là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000)

B subtilis có khả năng lên men không sinh hơi các loại đường như maltose,

glucose, saccharose, xylose, mannitol Đồng thời có khả năng phân giải tinh bột,nitrate và làm tan chảy gelatin

Tính đối kháng của B subtilis

B subtilis đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh khác cũng như với đồng loại

(Khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng) chủ yếu theo hai con đường cạnh trnh dinh

Trong môi trường khi có mặt B subtilis và các vi sinh vật khác do chúng có tốc

độ phát triển nhanh hơn (24 giờ) nên chúng sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡngtrong môi trường cũng như chiếm phần lớn không gian sống, đồng thời cũng tiết ramột số loại kháng sinh làm ức chế, kìm hãm thậm chí giết chết các vi sinh vật kháccạnh tranh với nó nhằm tìm kiếm thêm nguồn dinh dưỡng kéo dài thời gian sống(Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1967)

2.4.3.2 Vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens

Bacillus Amyloliquefaciens được phát hiện bởi nhà khoa học Nhật Bản Fukumoto năm 1943 Tuy nhiên cái tên "Bacillus Amyloliquefaciens" đã không xuất

hiện trên Approved Lists of Bacterial Names và chưa được công bố hợp lệ vào ngày 1tháng 1 1980; do đó, nó không có chỗ đứng trong danh mục vi khuẩn

"Bacillus amyloliquefaciens" có vai trò quan trọng trong ngành sản xuất

enzyme amylase và protease trên thê giới Mối quan hệ chặt chẽ giữa nó với Bacillus subtilis từ lâu đã được công nhận, và các sinh vật này đã được phân vào phân loài là

“B subtilis subsp amyloliquefuciens "hoặc đã được bao gồm trong B subtilis là một

dạng biến thể có thể sản xuất với số lượng dồi dào của các enzyme ngoại bào

B Amyloliquefaciens có kiểu hình rất giống với B subtilis do đó chúng

không thể phân biệt hoàn toàn nếu chỉ dựa trên cơ sở các phương pháp kiểm tra cổ

điển Vì lý do này mà B Amyloliquefaciens đã không được xem như là một loài riêng

biệt trên Approved Lists Tuy nhiên, sau này có một số bằng chứng cho thấy rằng tên

"B amyloliquefuciens nên được khôi phục "B amyloliquefaciens " và B subtilis có thể

được phân biệt bằng cách sử dụng một số kỹ thuật Hơn nữa, có một nhu cầu cho tên

này trong ngành công nghiệp enzyme để tránh nhầm lẫn với B subtilis, là có sự khác

biệt trong trao đổi chất và tiết ra các enzym khác nhau (F G Priest, 1987)

DNA từ chủng "B amyloliquefaciens '' có 5% tương đồng với DNA từ các chủng B subtilis, B licheniformis, và B pumilus Hầu hết các nhà nghiên cứu đồng ý

rằng các chủng trong vòng một loài nên có ít nhất 50 - 60% DNA tương đồng Như

vậy, mặc dù "B amyloliquefaciens "có liên quan đến B subtilis nhưng trên cơ sở dữ

liệu di truyền phân tử, mức độ tương đồng DNA là không đủ cao cho hai nhóm sinhvật này được coi là một loài duy nhất (F G Priest, 1987)

Đặc điểm hình thái

Các mô tả về "B amyloliquefaciens "được đưa ra dưới đây dựa trên các dữ liệu

của Welker và Campbell và Gordon và cộng sự

B amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0,7 - 0,9 œm x

1,8 - 3,0 œm, tế bào thường hình thành chuỗi và di động, với lông roi, bào tử hình oval(0,6 - 0,8œ và 1,0 - 1,4 œm) ở trung tâm hoặc gần trung tâm tế bào trong túi bào tử màkhông bị phình, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 - 40°C

Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa

B amyloliquefaciens không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 15°C hoặc trên 50°C,

có khả năng phân giải Casein, elastin, gelatin, tinh bột, tributyrin, Tween 20, Tween

40, và Tween 60, nhưng không thể phân giải adenine, cellulose, guanine,hypoxanthine, pectin, testosterone, tyrosine, và xanthine, (chỉ có một tỷ lệ nhỏ cácchủng có khả năng phân hủy DNA.) có khả năng tạo acetoin và phosphatase, chuyểnhóa nitrate thành nitrit, esculin và arbutin bị thủy phân, citrate được sử dụng như mộtnguồn carbon duy nhất, và tăng trưởng xảy ra với nồng độ 5% NaCl, và cho hầu hếtcác chủng là 10% NaCl

2.4.3.3 Vi khuẩn Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram dương , hình que, ưa nhiệt, yếm khí

tùy nghi, phân bố rộng rãi như một sinh vật hoại sinh trong môi trường

Các nhiễm sắc thể của B licheniformis có một vùng rộng lớn tương tự như Bacillus subtilis và Bacillus halodurans Có khoảng 80% các trình tự mã hóa của B licheniformis có chứa trong B subtilis, nó được coi là một phần của nhóm subtilis Nhưng, mặc dù tương tự như B subtilis, chúng khác nhau về số lượng và vị trí của

prophages, yếu tố chuyển vị, các enzyme ngoại bào, và operon đường trao đổi chất thứ

cấp Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phân loại B licheniformis có liên quan chặt chẽ đến B subtilis và Bacillus amyloliquefaciens trên cơ sở so sánh 16S rDNA và 16S-23S

của chuỗi nucleotide

Đặc điểm chung

Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của Bacillus licheniformis khoảng 50°C, tuy nhiên

nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là 37°C

Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt là trong

đất, Bacillus licheniformis có khả năng tạo bào tử Những bào tử này có thể chịu nhiệt,

chịu lạnh, bức xạ, và các áp lực môi trường khác cho đến khi gặp những điều kiệnthuận lợi, các bào tử sẽ nảy mầm trở thành những tế bào sinh dưỡng.

B licheniformis cũng có khả năng sử dụng amino và imino nitơ từ arginine,

asparagine và glutamine qua arginine deiminase, arginase, asparaginase và hoạt độngglutaminase

Một số ứng dụng của Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis được sử dụng để sản xuất các enzym, kháng sinh, và các

chất chuyển hóa nhỏ trong công nghiệp

Đặc biệt chủng B licheniformis để sản xuất thuốc kháng sinh peptide như

bacitracin và proticin, thêm vào một số hóa chất đặc biệt chẳng hạn như acid citric,inosine, acid inosinic và acid poly-γ-glutamic (Gherna R,1989)

Các nhà khoa học cũng đã ứng dụng B licheniformis lên men lông vũ để sản

xuất thức ăn giá rẻ nhằm bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi

Một số chùng B licheniformis phân lập được sử dụng trong đối kháng sinh học

có thể giảm thiểu những ảnh hưởng của nấm gây bệnh trên cây ngô, cỏ và các loại rau(Neyra C, 1996)

2.5 Các nghiên cứu liên quan

Nghiên cứu của Yoo và cộng sự năm 2007 đã chứng minh chủng Bacillus subtilis YJH-051 có khả năng kháng lại nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh

thán thư trên cây ớt

Chủng Bacillus subtilis cũng được chứng minh có hiệu quả trong đối kháng Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên ớt với khả năng ức chế nấm

Các chủng Bacillus subtilis 174 và Bacillus fortis 162 được dùng với nồng độ

103 CFU/ml cho thấy khả năng đối kháng kiểm soát bệnh lên tới 81,39% và 53,75%(Waheed Akram và Tehmina Anjum, 2011)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 09/2014 đến 06/2015 tại phòng Công nghệ Vi sinh,Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh

Đĩa petri, ống nghiệm, và một số dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản.Kính hiển vi quang học, nồi hấp khử trùng, tủ cấy, tủ lạnh, microwave

Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử

Máy PCR, bồn điện di, tủ âm 20oC, bồn ủ nhiệt, pipet các loại, tube các loại

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường TSA, TSB, Simmons citrate, PDA, Starch Agar, Water Agar, VP,

TE, Lysis buffer, Agarose, Dream Taq

3.2.3 Vật liệu thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn Bacillus spp được phân lập từ các mẫu đất tại huyện Chợ

Gạo, Tiền Giang

Các chủng nấm bệnh Colletotrichum spp được phân lập từ các vườn ớt thuộc

huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh

Ớt tươi hái tại vườn ớt thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ ChíMinh

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập Colletotrichum spp.

Phương pháp phân lập nấm Colletotrichum spp từ mẫu bệnh tham khảo theo

Lester W Burgess, 2009, Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam:

Thu mẫu ớt có có biểu hiện bệnh thán thư

Rửa sạch với nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác

Khử trùng bề mặt quả bằng ethanol 70% bằng cách nhúng nhanh quả ớt vàoethanol 70% trong 5 giây, rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vôtrùng

Dùng dao cấy đã khử trùng cắt những miếng nhỏ (2 x 2 mm) từ phần ranh giớigiữa mô khỏe và mô bệnh

Phân lậ

p cá

c chủn

g v

i khuẩn

Bac illus sp

p t

ừ cá

c mẫu đất

Phân lậ

p cá

c chủn

g n

ấm

Collet otr ich

Quan sá

t hìn

h t

Địn

h dan

h sin

h h

ọc phân tửKiể

m t

ra khả năn

g g

ây bện

Địn

h dan

h sin

h h

ọc ph

ân

tử

Đố

i khán

g in

vitr

o t

rên đ

ĩa petri

Tuyể

n chọn cá

c chủn

g B

aci llus

spp

Cấy lên môi trường PDA hoặc water agar (WA) chứa chloramphenicol 100ppm.

Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28oC

Sau 24 – 48 giờ, các tản nấm phát triển từ những miếng cấy Lựa chọn những

khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chủng Colletotrichum spp ở giai đoạn đầu là

khuẩn lạc có màu ửng hồng ở tâm, sợi nấm phát triển sát dưới thạch agar, không bungsợi tơ lên như các dòng nấm khác

Cấy truyền những khuẩn lạc đặc trưng (cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môitrường PDA để tạo dòng thuần

Khi nuôi từ ngày thứ 4 trở lên, khuẩn lạc nấm ban đầu có màu trắng, sẽ xuấthiện một số vết đen ở mặt dưới thạch, đây là dấu hiệu đặc trưng cho các loài

Hấp huyền phù ở 80oC trong 10 phút để loại phần lớn các dòng vi khuẩn gây

bệnh không tạo được bào tử chịu nhiệt Các loài Bacillus spp như B subtilis, B amyloliquefaciens tạo bào tử có khả năng chịu nhiệt cao.

Pha loãng theo các nồng độ 10-2, 10-4, 10-6 nhằm sàng lọc các khuẩn lạc đặctrưng Trãi đĩa trên môi trường TSA, nuôi ở 28oC trong 24 giờ

Lựa chọn các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng cho dòng Bacillus spp với ưu

tiên là chủng B.subtilis, có đặc điểm khuẩn lạc sần sùi, màu trắng sữa Sử dụng

phương pháp cấy ria để tách các dòng vi khuẩn, tạo dòng thuần sau khoảng 2 – 3 thếhệ

3.3.3 Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh phân lập được

Các chủng nấm đã được làm thuần bằng cách cấy chuyền dựa vào đặc điểm đạithể sẽ được tiến hành quan sát vi thể dưới kính hiển vi theo phương pháp buồng giữẩm

3.3.3 Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp.

Phương pháp được thực hiện tham khảo theo P Montri (2009) với một vài thayđổi như sau:

Quả ớt thuộc giống ớt sừng trâu ở giai đoạn còn xanh được ngâm trong nướcJaven (NaClO) 1% (w/v) trong 5 phút để khử trùng và trung hòa các loại hóa chất và

vi sinh vật trên bề mặt vỏ quả Sau đó rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng hai lần

Dùng phương pháp tạo vết thương trên vỏ quả hoặc tiêm trực tiếp 20 µl huyềnphù bào tử nấm bệnh vào quả ớt Đặt mẫu ớt vào hộp nhựa, kích thước (20 x 30 x 10cm) bên trong có lót giấy ẩm, sau đó được ủ ở 28oC Biểu hiện bệnh thán thư đượckhảo sát sau 3, 5, 7, 9 ngày từ lúc tiêm chủng Chỉ tiêu đo là phần trăm (%) kích thướcvết bệnh so với kích thước toàn bộ quả

3.3.4 Kiểm tra sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp.

Thực hiện các phản ứng kiểm tra sinh hóa định danh vi khuẩn Bacillus spp.

theo Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Bao gồm các phản ứng:

Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn Bacillus spp theo Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology

Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B subtilis và B licheniformis theo Bergey’s

Manual of Determinative Bacteriology