Phân lập và tuyển chọn các chủng lactobacillus spp có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản của phụ nữ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa học thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học mình, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) tin tưởng, tận tình bảo, hướng dẫn em suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong thời gian học tập trường em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo môn Vi sinh vật học, Phòng Sinh học Nano ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình học tập thực luận văn Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn ủng hộ giúp đỡ anh chị, em sinh viên bạn bè phịng thí nghiệm Hóa sinh Vi sinh môi trường suốt thời gian em thực đề tài Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho em suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thanh Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Probiotic .3 1.1.1 Khái niệm probiotic 1.1.2 Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp 1.2 Vai trò vi khuẩn probiotic 1.2.1 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa 1.2.2 Khả chống ung thư yếu tố đột biến 1.2.3 Tác động biểu mô ruột 1.2.4 Kích thích hệ thống miễn dịch 1.2.5 Cải thiện việc sử dụng lactose người không dung nạp lactose 1.2.6 Làm giảm cholesterol huyết hạn chế bệnh liên quan đến tim mạch .8 1.2.7 Khả chống dị ứng 1.2.8 Phòng ngừa điều trị viêm nhiễm phụ khoa phụ nữ .9 1.3 Cơ chế kháng khuẩn âm đạo cân hệ vi sinh đường sinh dục phụ nữ sử dụng thực phẩm chức probiotics .11 1.3.1 Sinh H2O2 .11 1.3.2 Sinh axit lactic .11 1.3.3 Sinh tổng hợp chất kháng khuẩn 12 1.4 Tổng quan chung sức khỏe sinh sản phụ nữ 13 1.5 Một số loại thực phẩm chức probiotics thương mại dùng cho người 14 1.5.1 Một số loại thực phẩm chức probiotics dành riêng cho phụ nữ thương mại Thế giới 14 ii 1.5.2 Một số thực phẩm chức probiotics thương mại nước hỗ trợ sức khỏe cho người .15 1.6 Vi khuẩn probiotic sữa mẹ 16 1.7 Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp phương pháp đông khô 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên liệu, thiết bị dụng cụ thí nghiệm 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ 18 2.1.3 Thiết bị .18 2.1.4 Dụng cụ 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng Lactobacillus spp mẫu sữa mẹ 20 2.2.2 Đánh giá số tính chất & hoạt tính probiotic chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .23 2.2.3 Nghiên cứu số điều kiện nhân giống in-vitro chủng vi khuẩn tuyển chọn 25 2.2.4 Nghiên cứu công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau q trình đông khô chủng tuyển chọn 26 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri khu vực nông thôn khu vực thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam kết tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ 29 3.1.1 Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri khu vực nông thôn khu vực thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29 3.1.2 Kết phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus spp từ sữa mẹ 30 3.1.3 Kết định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ 32 iii 3.2 Kết đánh giá số tính chất, hoạt tính điều kiện nhân giống chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .34 3.2.1 Kết đánh giá số tính chất hoạt tính probiotic chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện in-vitro .34 3.2.2 Kết nghiên cứu số điều kiện nhân giống in-vitro chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 3.3 Nghiên cứu công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống chủng tuyển chọn sau đông khô 45 3.3.1 Mật độ tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn trước đông khô 45 3.3.2 Mật độ sống chủng vi khuẩn tuyển chọn sau đông khô .46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Thử nghiệm công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic 27 với chất bảo vệ 27 Bảng Tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri sữa mẹ khu vực thành thị khu vực nông thôn số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam 29 Bảng Lượng axit lactic sinh chủng L reuteri Lactobacillus spp 30 Bảng Đặc điểm chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .33 Bảng Số đo vòng kháng khuẩn chủng tuyển chọn với loại kháng sinh 40 Bảng Khả ức chế vi khuẩn nấm có hại 42 Bảng Mật độ sống sót sau đông khô chủng L rhamnosus SMH1 .46 Bảng Mật độ sống sót sau đơng khơ chủng L reuteri SMH2 .47 v DANH MỤC HÌNH Hình Hình thái sinh vật Lactobacillus tế bào biểu mô âm đạo (ảnh nhuộm Gram) [64] Hình Tương tác vi sinh vật đường ruột [35] Hình Các chủng vi khuẩn probiotic chế chống lại bệnh ung thư [29] Hình Cơ chế hoạt động probiotic thúc đẩy cân nội môi liên quan đến khả ứng dụng bệnh viêm ruột [102] .7 Hình Thiết kế thí nghiệm 19 Hình Máy đông khô vi khuẩn 28 Hình Đường cong sinh trưởng lượng axit lactic sinh theo thời gian chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng .34 Hình Khả chịu muối mật chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 36 Hình Khả chịu axit chủng chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 37 Hình 10 Khả sinh H2O2 chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 38 Hình 11 Khả nhạy cảm với kháng sinh chủng ĐC L reuteri VTCC 910087 (Hình 6A), chủng L reuteri SMH2 (Hình 6B) L rhamnosus SMH1 (Hình 6C) 40 Hình 12 Khả tạo màng biofilm chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng ĐC L reuteri VTCC 910087 41 Hình 13 Khả phát triển chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 910087 điều kiện nuôi lắc nuôi tĩnh 43 Hình 14 Khả phát triển mức nhiệt độ khác chủng L rhamnosus SMH1, L reuteri SMH2 chủng đối chứng L reuteri VTCC 91008744 vi MỞ ĐẦU Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa thuật ngữ dùng để bệnh nữ giới gây tình trạng viêm nhiễm quan sinh dục như: âm đạo, cổ tử cung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, vùng xung quanh Tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm phụ khoa nữ giới chưa quan hệ tình dục lần thấp có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên tử cung Đối với nữ giới quan hệ tình dục, đặc biệt thời kì mang thai, sinh nở nguy mắc bệnh viêm phụ khoa cao Viêm nhiễm phụ khoa coi bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt nước nhiệt đới có Việt Nam Nhiều thống kê từ 2004 đến cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa phụ nữ độ tuổi sinh đẻ mức cao, chiếm đến 90% [1] Nếu không điều trị điều trị không cách, không đầy đủ gây nên biến chứng vơ sinh, chửa tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung biến chứng cho thai nhi thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ coi vấn đề lớn quan tâm thiệt hại bệnh gây lớn Mặc dù nhiễm trùng đường sinh dục có triệu chứng khác nhau, lúc phụ nữ dễ dàng nhận Trên thực tế việc chẩn đốn chí cịn khó khăn bác sĩ có kinh nghiệm Các trường hợp nhiễm trùng nặng bác sĩ định điều trị kháng sinh phổ rộng với liều cao nên gây tác dụng phụ chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sinh hoạt tình dục… điều trị tái lặp dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, vấn đề cộm thách thức Để phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng đường sinh sản, nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chế phẩm probiotics chứa chủng lợi khuẩn Lactobacillus spp hiệu Các sản phẩm probiotics dành cho phụ nữ bắt đầu sử dụng phổ biến dạng sản phẩm chức hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân nhiễm trùng đường âm đạo tiết niệu Các sản phẩm thương mại bán nhiều thị trường Việt Nam phần lớn hàng nhập từ Mỹ, Anh, Nhật Bản với giá thành cao Việt Nam chưa có dịng sản phẩm nghiên cứu phát triển dành riêng cho phụ nữ Sản phẩm nhập ngoại chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp người dân Việt Nam, đặc biệt phụ nữ vùng nơng thơn miền núi Trong đó, 80% phụ nữ Việt Nam bị mắc bệnh phụ khoa Chính vậy, việc nghiên cứu sản xuất số chế phẩm probiotics từ Lactobacillus spp phân lập sữa mẹ bà mẹ cho bú Việt Nam có đặc tính ưu việt việc ức chế vi sinh vật gây viêm nhiễm phụ khoa việc làm cần thiết, có ý nghĩa cộng đồng ý nghĩa thực tiễn cao Dựa nhu cầu tính cấp thiết vấn đề nêu nên thực đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ” Hiện nay, cịn tài liệu cơng bố liên quan đến xuất Lactobacilli Lactobacillus reuteri sữa mẹ Việt Nam Chính thế, nghiên cứu thực để điều tra xuất nhóm vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus spp loài L reuteri sữa mẹ, xác định mối liên hệ có có mặt L reuteri sữa mẹ bà mẹ vùng nông thôn thành thị miền Bắc Việt Nam nghiên cứu đặc tính probiotic chủng Lactobacillus spp tuyển chọn để hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ Mục tiêu đề tài: - Xác định tỉ lệ Lactobacillus spp L reuteri có sữa mẹ bà mẹ sống khu vực nông thôn thành thị số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam tuyển chọn chủng Lactobacillus spp có hoạt tính probiotic tốt - Xác định cơng thức phối trộn để nâng cao mật độ sống sót sau q trình đơng khơ chủng tuyển chọn 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 Kalliomäki M., Salminen S., Arvilommi H., Kero P., Koskinen P., and Isolauri E (2001), "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebocontrolled trial", The Lancet 357(9262), pp 1076-1079 Laughton J.M., Devillard E., Heinrichs D.E., Reid G., and McCormick J.K (2006), "Inhibition of expression of a staphylococcal superantigen-like protein by a soluble factor from Lactobacillus reuteri", 152(4), pp 1155-1167 LeBlanc J.G., Chain F., Martín R., Bermúdez-Humarán L.G., Courau S., and Langella P (2017), "Beneficial effects on host energy metabolism of short-chain fatty acids and vitamins produced by commensal and probiotic bacteria", Microbial Cell Factories 16(1), p 79 Ma B., Forney L.J., and Ravel J (2012), "Vaginal microbiome: rethinking health and disease", Annual review of microbiology 66, pp 371-389 Mackie R.I., Sghir A., and Gaskins H.R (1999), "Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract", The American Journal of Clinical Nutrition 69(5), pp 1035s-1045s Macklaim J.M., Clemente J.C., Knight R., Gloor G.B., and Reid G (2015), "Changes in vaginal microbiota following antimicrobial and probiotic therapy", Microbial Ecology in Health and Disease 26, pp 27799-27799 Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., Pavlov A., Pavlova N., Karamychev V., Polouchine N., et al (2006), "Comparative genomics of the lactic acid bacteria", Proceedings of the National Academy of Sciences 103(42), p 15611 Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., Pavlov A., Pavlova N., Karamychev V., Polouchine N., et al (2006), "Comparative genomics of the lactic acid bacteria", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(42), pp 15611-15616 Martín R., and Suárez J.E (2010), "Biosynthesis and Degradation of H 2O2 by Vaginal Lactobacilli", Applied and environmental microbiology 76(2), p 400 Martín R., Olivares M., Marín M.L., Fernández L., Xaus J., and Rodríguez J.M (2005), "Probiotic Potential of Lactobacilli Strains Isolated From Breast Milk", Journal of Human Lactation 21(1), pp 8-17 Mastromarino P., Macchia S., Meggiorini L., Trinchieri V., Mosca L., Perluigi M., and Midulla C (2009), "Effectiveness of Lactobacillus-containing vaginal tablets in the treatment of symptomatic bacterial vaginosis", Clinical Microbiology and Infection 15(1), pp 67-74 Matu M.N., Orinda G.O., Njagi E.N.M., Cohen C.R., and Bukusi E.A (2010), "In vitro inhibitory activity of human vaginal lactobacilli against pathogenic bacteria associated with bacterial vaginosis in Kenyan women", Anaerobe 16(3), pp 210215 55 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 McLean N.W., and Rosenstein I.J (2000), "Characterisation and selection of a Lactobacillus species to re-colonise the vagina of women with recurrent bacterial vaginosis", 49(6), pp 543-552 McNabney S.M., and Henagan T.M (2017), "Review: Short Chain Fatty Acids in the Colon and Peripheral Tissues: A Focus on Butyrate, Colon Cancer, Obesity and Insulin Resistance", Nutriens 9(12) Miller M (1982), "Lactobacillus sp 01.png", Centers for Disease Control and Prevention's Public Health Image Library (PHIL) Morikawa M., Kagihiro S., Haruki M., Takano K., Branda S., Kolter R., and Kanaya S (2006), "Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γpolyglutamate", 152(9), pp 2801-2807 Nall R (2018), "Vaginal pH balance: Symptoms, remedies, and tests." In Medical news today Nardini P., Ñahui Palomino R.A., Parolin C., Laghi L., Foschi C., Cevenini R., Vitali B., and Marangoni A (2016), "Lactobacillus crispatus inhibits the infectivity of Chlamydia trachomatis elementary bodies, in vitro study", Scientific reports 6, pp 29024-29024 Nielsen S.S (2017), Food Science (Springer) Nugent R.P., Krohn M.A., and Hillier S.L (1991), "Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation", Journal of Clinical Microbiology 29(2), p 297 O'Hanlon D.E., Moench T.R., and Cone R.A (2011), "In vaginal fluid, bacteria associated with bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide", BMC infectious diseases 11, pp 200-200 O'Hanlon D.E., Moench T.R., and Cone R.A (2011), "In vaginal fluid, bacteria associated with bacterial vaginosis can be suppressed with lactic acid but not hydrogen peroxide", BMC infectious diseases 11(1), p 200 O'Toole G.A., and Kolter R (1998), "Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development", Molecular Microbiology 30(2), pp 295-304 Ooi L.-G., and Liong M.-T (2010), "Cholesterol-lowering effects of probiotics and prebiotics: a review of in vivo and in vitro findings", International journal of molecular sciences 11(6), pp 2499-2522 Osset J., Bartolomé R.M., García E., and Andreu A (2001), "Assessment of the Capacity of Lactobacillus to Inhibit the Growth of Uropathogens and Block Their Adhesion to Vaginal Epithelial Cells", The Journal of Infectious Diseases 183(3), pp 485-491 Ouwehand A.C (2007), "Antiallergic Effects of Probiotics", The Journal of Nutrition 137(3), pp 794S-797S 56 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 Özdemir Ö., and Erol A.Y.G (2013), "Preventative and therapeutic probiotic use in allergic skin conditions: experimental and clinical findings", BioMed research international 2013, pp 932391-932391 P.A C (2006), " Identification of anti-infective signals from lactobacilli." In (University of Western Ontario, Canada) "Phosphate buffered saline." In ( 2008) Picciano M.F (2001), "Nutrient Composition of Human Milk", Pediatric Clinics of North America 48(1), pp 53-67 "Probiotics: In Depth." In (2018) (National Center for Complementary and Integrative Health) Reuter G (2001), "The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession", Current issues in intestinal microbiology 2, pp 43-53 Rijkers G.T., de Vos W.M., Brummer R.-J., Morelli L., Corthier G., and Marteau P (2011), "Health benefits and health claims of probiotics: bridging science and marketing", British Journal of Nutrition 106(9), pp 1291-1296 Saikusa T., Horino T., and Mori Y (1994), "Distribution of Free Amino Acids in the Rice Kernel and Kernel Fractions and the Effect of Water Soaking on the Distribution", Journal of Agricultural and Food Chemistry 42(5), pp 1122-1125 Savini M., Cecchini C., Verdenelli M.C., Silvi S., Orpianesi C., and Cresci A (2010), "Pilot-scale production and viability analysis of freeze-dried probiotic bacteria using different protective agents", Nutrients 2(3), pp 330-339 Savino F., Pelle E., Palumeri E., Oggero R., and Miniero R (2007), "Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) Versus Simethicone in the Treatment of Infantile Colic: A Prospective Randomized Study", Pediatrics 119(1), p e124 Schieber M., and Chandel N.S (2014), "ROS function in redox signaling and oxidative stress", Current biology : CB 24(10), pp R453-R462 Shornikova A.-V., Casas I.A., Isolauri E., Mykkänen H., and Vesikari T (1997), "Lactobacillus reuteri as a Therapeutic Agent in Acute Diarrhea in Young Children", 24(4), pp 399-404 Sieber R., Stransky M., and Vrese M.d (1997 Dec), "Lactose intolerance and consumption of milk and milk products", Z Ernahrungswiss 36(4), pp 375-393 Simoes J.A., Aroutcheva A., Heimler I., Shott S., and Faro S (2001), "Bacteriocin susceptibility of Gardnerella vaginalis and its relationship to biotype, genotype, and metronidazole susceptibility", American Journal of Obstetrics & Gynecology 185(5), pp 1186-1190 Singhi S.C., and Kumar S (2016), "Probiotics in critically ill children", F1000Research 5, pp F1000 Faculty Rev-1407 57 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Sinkiewicz G., and Ljunggren L (2008), "Occurrence of Lactobacillus reuteri in human breast milk", Microbial Ecology in Health and Disease 20(3), pp 122-126 Skarin A., and Sylwan J (1986), "Vaginal Lactobacilli inhibiting growth of Gardnerella vaginalis, Mobiluncus and other bacterial species cultured from vaginal content of women with bacterial vaginosis", Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Series B Microbiology 94B(1‐6), pp 399-403 Strus M., Kucharska A., Kukla G., Brzychczy-Włoch M., Maresz K., and Heczko P.B (2005), "The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida Infect Dis Obstet Gynecol", Infect Dis Obstet Gynecol 13, pp 6975 Strus M., Malinowska M., and Heczko P.B (2002), "In vitro antagonistic effect of Lactobacillus on organisms associated with bacterial vaginosis", The Journal of reproductive medicine 47(1), pp 41-46 Succi M., Tremonte P., Reale A., Sorrentino E., Grazia L., Pacifico S., and Coppola R (2005), "Bile salt and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese", FEMS Microbiology Letters 244(1), pp 129137 Todorov S.D., Vaz-Velho M., and Gibbs P (2004), "Comparison of two methods for purification of plantaricin ST31, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ST31", Brazilian Journal of Microbiology 35, pp 157-160 Todorov S.D., Furtado D.N., Saad S.M.I., Tome E., and Franco B.D.G.M (2011), "Potential beneficial properties of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon", Journal of Applied Microbiology 110(4), pp 971986 "Turn Up the Heat: Bacterial Spores Can Take Temperatures in the Hundreds of Degrees" Valeur N., Engel P., Carbajal N., Connolly E., and Ladefoged K (2004), "Colonization and Immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the Human Gastrointestinal Tract", Applied and environmental microbiology 70(2), p 1176 Valík Ľ., Medveďová A., and Liptakova D (2008), "Characterization of the growth of Lactobacillus rhamnosus GG in milk at suboptimal temperatures", Journal of food and nutrition research 47, pp 60-67 Valík Ľ., Medveďová A., Čižniar, and Liptáková D (2013), "Evaluation of temperature effect on growth rate of Lactobacillus rhamnosus GG in milk using secondary models", Chemical Papers 67, pp 737-742 Vanderpool C., Yan F., and Polk B.D (2008), "Mechanisms of probiotic action: Implications for therapeutic applications in inflammatory bowel diseases", Inflammatory Bowel Diseases 14(11), pp 1585-1596 58 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 Verdenelli M.C., Cecchini C., Coman M.M., Silvi S., Orpianesi C., Coata G., Cresci A., and Renzo G.C (2016), "Impact of Probiotic SYNBIO® Administered by Vaginal Suppositories in Promoting Vaginal Health of Apparently Healthy Women", Current Microbiology 73(4), pp 483-490 Verdenelli M.C., Ghelfi F., Silvi S., Orpianesi C., Cecchini C., and Cresci A (2009), "Probiotic properties of Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus paracasei isolated from human faeces", European Journal of Nutrition 48(6), pp 355-363 Vigneshwari R S , Rambabu, Jeyaseelan Senthinath T , Revathi P., and S D.A.U (2014), "Role Of Probiotics In The Treatment Of Bacterial Vaginosis", International Journal of Science and Research 3(4) Vlková E., Rada V., Popelářová P., Trojanová I., and Killer J (2006), "Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria isolated from gastrointestinal tract of calves", Livestock Science 105(1), pp 253-259 Voravuthikunchai S.P., Bilasoi S., and Supamala O (2006), "Antagonistic activity against pathogenic bacteria by human vaginal lactobacilli", Anaerobe 12(5), pp 221-226 Wagner R.D., Pierson C., Warner T., Dohnalek M., Farmer J., Roberts L., Hilty M., and Balish E (1997), "Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidiasis in immunodeficient mice", Infection and Immunity 65(10), p 4165 Wang L., Guo M.-J., Gao Q., Yang J.-F., Yang L., Pang X.-L., and Jiang X.-J (2018), "The effects of probiotics on total cholesterol: A meta-analysis of randomized controlled trials", Medicine 97(5), pp e9679-e9679 Weese J.S., and Martin H (2011), "Assessment of commercial probiotic bacterial contents and label accuracy", The Canadian veterinary journal = La revue veterinaire canadienne 52(1), pp 43-46 Weizman Z., Asli G., and Alsheikh A (2005), "Effect of a Probiotic Infant Formula on Infections in Child Care Centers: Comparison of Two Probiotic Agents", Pediatrics 115(1), p Wilks M., Wiggins R., Whiley A., Hennessy E., Warwick S., Porter H., Corfield A., and Millar M (2004), "Identification and H 2O2 Production of Vaginal Lactobacilli from Pregnant Women at High Risk of Preterm Birth and Relation with Outcome", Journal of Clinical Microbiology 42(2), p 713 Yan F., and Polk D.B (2011), "Probiotics and immune health", Current opinion in gastroenterology 27(6), pp 496-501 Yang G., Liu Z.-Q., and Yang P.-C (2013), "Treatment of allergic rhinitis with probiotics: an alternative approach", North American journal of medical sciences 5(8), pp 465-468 59 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 Yirga H (2015), "The Use of Probiotics in Animal Nutrition", Journal of Probiotics & Health 03 Yu B., J R Liu, F S Hsiao, T T Lee, and P W S Chiou (2008), "The Probiotic and Adherence Properties of Lactobacillus reuteri Pg4 Expressing the Rumen Microbial β-Glucanase ", Asian-Australasian Journal of Animal Science 21, pp 1324-1329 Za´rate G., and Nader-Macias M.a.E (2006), "Viability and biological properties of probiotic vaginal lactobacilli after lyophilization and refrigerated storage into gelatin capsules", Process Biochemistry 41(8), pp 1779-1785 Zayed G., and Roos Y.H (2004), "Influence of trehalose and moisture content on survival of Lactobacillus salivarius subjected to freeze-drying and storage", Process Biochemistry 39(9), pp 1081-1086 Boris S., Suárez J.E., Vázquez F., and Barbés C (1998), "Adherence of Human Vaginal Lactobacilli to Vaginal Epithelial Cells and Interaction with Uropathogens", Infection and Immunity 66(5), p 1985 Bozoglu T.F., and Guraka G.C (1989), "Freeze-Drying Injury of Lactobacillus acidophilus", Journal of Food Protection 52, pp 259-260 Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., and Gibbs P (2004), "Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria", International Dairy Journal 14, pp 835-847 Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Teixeira P., Malcata F.X., and Gibbs P (2002), "Survival of freeze-dried Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus during storage in the presence of protectants", Biotechnology Letters 24(19), pp 1587-1591 Castro H., Teixeira P., and Kirby R (1996), "Changes in the membrane of Lactobacillus bulgaricus during storage following freeze-drying", Biotechnology Letters 18, pp 99-104 Ray B., and Johnson M.C (1986), "Freeze-drying injury of surface layer protein and its protection in Lactobacillus acidophilus", CryoLetters 7, pp 210-216 Selmer-Olsen E., Birkeland S.E., and Sørhaug T (1999), "Effect of protective solutes on leakage from and survival of immobilized Lactobacillus subjected to drying, storage and rehydration", Journal of Applied Microbiology 87(3), pp 429437 Talarico T.L., and Dobrogosz W.J (1989), "Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri", Antimicrobial agents and chemotherapy 33(5), p 674 60 PHỤ LỤC Phụ lục Bản thỏa thuận cung cấp mẫu cho nghiên cứu – Consent form BỘ Y TẾ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương PHIẾU CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA MẸ Họ tên người tham gia nghiên cứu: …………………………………………… Địa chỉ: ………………………………………………………………………………… Quận/huyện: ………………………………………………………………………… Xã/phường: ………………………………………………………………… Thơn/khu phố: ……………………………………………………………… Tổ dân phố/xóm …………………………………………………………… Tôi người tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Tơi giải thích chất, q trình tiến hành mục đích nghiên cứu phương pháp, phương tiện mà qua nghiên cứu tiến hành; rủi ro, nguy cơ, lợi ích thơng báo cho tơi biết trước Những câu hỏi việc tham gia vào nghiên cứu trả lời đầy đủ thỏa mãn thắc mắc Tôi cho phép nhóm nghiên cứu sử dụng phân tích báo cáo liệu tơi sau mã hóa Tơi hiểu tơi có quyền nhận lại thơng tin để xem xét thực thay đổi cần thiết Tôi cho phép cán nghiên cứu liên hệ với theo số điện thoại là:…………………………………………………… [ ] Chấp thuận tham gia nghiên cứu [ ] Chấp thuận lấy mẫu cho nghiên cứu [ ] Chấp thuận cho phép sử dụng mẫu cho nghiên cứu nghiên cứu tương lai Chữ ký người tham gia nghiên cứu:……………………………………………… Ngày: / /201 Vào hồi: : Tuyên bố cán nghiên cứu lấy phiếu chấp thuận: Tơi trình bày chất, nội dung yêu cầu chương trình nghiên cứu cho người tham gia nghiên cứu ghi trên, trả lời đầy đủ câu hỏi người tham gia nghiên cứu chứng kiến việc hoàn thành phiếu chấp thuận tham gia nghiên cứu Chữ ký cán nghiên cứu lấy phiếu chấp thuận:………………………………… Họ tên:………………………………………………………………………………… Chức vụ:………………………………………………………………………………… Ngày: / /201 Vào hồi: : ID: BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN BÀ MẸ CUNG CẤP MẪU SỮA MẸ Ngày vấn Địa điểm điều tra Ghi chú: Điều tra viên hỏi trực tiếp, khoanh tròn vào đáp án mà đối tượng trả lời (chú ý có câu hỏi lựa chọn nhiều lựa chọn) STT Câu hỏi Trả lời Phần I: Thông tin chung Chị sinh ngày tháng năm nào? Chị người dân tộc nào? Kinh Khác (ghi rõ) …………….………………… Nghề nghiệp Tình trạng nhân Đã kết chị gì? Ly thân Ly dị Góa Khác (ghi rõ) ……………………………… Hiện nay, chị sống với ai? Chồng Người yêu/bạn tình Một Sống với bạn Khơng cố định/lang thang Khác (ghi rõ):………………………………… Nơi chị Nhà riêng Nhà thuê/trọ Chị sinh cháu cháu gần cách bao lâu? Ghi rõ : ……………………………………… Phần II: Hành vi sức khỏe lối sống Chị hút thuốc chưa? Có hút Khơng hút Nếu có hút, chị hút thuốc từ nào? Trong trình mang thai sau sinh con, chị có thường xun hút thuốc khơng? (Chỉ khoanh lựa chọn) Rất thường xuyên (hàng ngày) Thường xuyên (3-5 lần/tuần) Thỉnh thoảng (1-2 lần/tuần) Hiếm (1-2 lần/tháng) Khơng hút thuốc Trong q trình mang thai sau sinh chị có sống/ làm Có việc với người hút thuốc Khơng khơng? Trong trình mang thai sau sinh con, chị có thường xun uống rượu bia khơng? (Chỉ khoanh lựa chọn) Hàng ngày Hầu hết ngày Thỉnh thoảng (1-2 lần) Hiếm 1-2 lần/tháng Không uống rượu/bia Trong trình cho bú, chị Có có sử dụng thuốc kháng sinh Khơng khơng (có ghi rõ) Khác (ghi rõ):……………………………… Trong trình cho bú, chị Có có sử dụng chế phẩm sinh học Khơng probiotics khơng (có ghi rõ) Khác (ghi rõ):……………………………… Có Trong q trình mang thai cho bú, chị có bị mắc Khơng bệnh có khả lây qua sữa mẹ ( HIV, lao, thủy đậu, Khác (ghi rõ): ……………………………… Cytomegalo virus, Herpes simplex,….) không? Phần III Kiến thức hệ vi sinh vật sữa mẹ trước tham gia nghiên cứu Trước tham gia nghiên cứu này, chị nghe nói Có hệ vi sinh vật sữa mẹ Chưa chưa? Theo chị, hệ vi sinh vật sữa Gồm loại vi rút mẹ gồm thành phần nào? Gồm loại vi khuẩn (Có thể khoanh nhiều lựa chọn) Gồm loại ký sinh trùng Gồm loại nấm Khác (ghi rõ): ………………………………… Khơng biết Có Theo chị, hệ vi sinh vật sữa Khơng mẹ có gây nguy hiểm khơng? Khơng biết Có Theo chị, hệ vi sinh vật sữa Khơng mẹ có lợi ích khơng? Khơng biết Do thể mẹ tự tiết Theo chị, vi sinh vật Do yếu tố môi trường tác động sữa mẹ có từ đâu? Do nhiễm trùng từ vi sinh vật mơi trường (Có thể khoanh nhiều lựa chọn) Do tác động thực phẩm chức sản phẩm hỗ trợ Khác (ghi rõ): ……………………………… Không biết Trân trọng cảm ơn tham gia chị! Đánh giá mức độ hoàn thành câu hỏi: Hồn tồn hợp tác Khơng hợp tác Khác (ghi rõ) …………………… NGÀY PHỎNG VẤN: / / 201… GIÁM SÁT VIÊN ĐÃ KIỂM TRA: Tên giám sát viên: _ Chữ ký: _ Phụ lục Lượng axit lactic sinh chủng L reuteri Lactobacillus spp (Giá trị độ lệch chuẩn) STT Ký hiệu chủng thuộc loài L reuteri Lượng axit lactic (g/100 mL) giờ 12 24 28 32 36 SMH2 0,0027 0,0406 0,0156 0,0227 0,0156 0,0104 SMH3 0,0025 0,0403 0,0150 0,0240 0,0160 SMH4 0,0024 0,0410 0,0210 0,0260 SMH5 0,0032 0,0410 0,0230 SMH6 0,0227 0,0156 SMH7 0,0240 SMH8 SMH9 STT Ký hiệu chủng Lactobacillu s spp 0,0109 0,0138 0,0140 0,0142 0,0145 0,0180 0,0107 0,0145 0,0143 0,022 0,0170 0,0120 0,0128 0,0124 0,0104 0,0138 0,0142 0,0027 0,0406 0,0156 0,0160 0,0109 0,0140 0,0145 0,0025 0,0403 0,0150 0,0260 0,0180 0,0107 0,0145 0,0143 0,0024 0,0410 0,0210 0,0220 0,0170 0,0120 0,0128 0,0124 0,0032 0,0410 0,0230 Lượng axit lactic (g/100 mL) giờ 12 24 28 32 36 0,0017 0,0401 0,0126 0,0129 0,0135 0,0101 10 SMH1 SMH10 0,0019 0,0302 0,0104 0,0242 0,0116 11 SMH11 0,0021 0,0401 0,0221 0,0246 12 SMH12 0,0030 0,0411 0,0213 13 SMH13 0,0207 0,0126 14 SMH14 0,0241 15 SMH15 16 0,0123 0,0123 0,0143 0,0122 0,0155 0,0118 0,0107 0,0155 0,0153 0,0222 0,0137 0,0112 0,0121 0,0134 0,0103 0,0141 0,0132 0,0017 0,0416 0,0136 0,0162 0,0108 0,0142 0,0138 0,0029 0,0423 0,0157 0,0261 0,0185 0,0117 0,0125 0,0133 0,0014 0,0412 0,0215 SMH16 0,0223 0,0171 0,0121 0,0118 0,0104 0,0025 0,0409 0,0231 17 SMH17 0,0017 0,0433 0,0167 0,0212 0,0106 0,0114 0,0128 0,0112 18 SMH18 0,0015 0,0413 0,0135 0,0234 0,0176 0,0119 0,0149 0,0140 19 SMH19 0,0011 0,0412 0,0218 0,0263 0,0185 0,0107 0,0145 0,0142 20 SMH20 0,0002 0,0416 0,0233 0,0227 0,0157 0,0123 0,0118 0,0121 21 SMH21 0,0223 0,0155 0,0104 0,0138 0,0112 0,0027 0,0406 0,0156 22 SMH22 0,0242 0,0160 0,0109 0,0143 0,0125 0,0025 0,0403 0,0215 23 SMH23 0,0261 0,0182 0,0107 0,0145 0,0113 0,0024 0,0241 0,0121 24 25 26 27 SMH24 SMH25 SMH26 SMH27 0,0220 0,0022 0,0013 0,0021 0,0173 0,0416 0,0413 0,0412 0,0120 0,0146 0,0135 0,0211 0,0128 0,0227 0,0241 0,0260 0,0104 0,0106 0,0160 0,0183 0,0032 0,0104 0,0109 0,0107 0,0141 0,0138 0,0114 0,0145 0,0023 0,0142 0,0145 0,0143 28 SMH28 0,0012 0,0410 0,0233 0,0223 0,0171 0,0121 0,0128 0,0124 29 SMH29 0,0217 0,0145 0,0114 0,0138 0,0112 0,0027 0,0406 0,0156 30 SMH30 0,0246 0,0161 0,0109 0,0142 0,0135 0,0025 0,0403 0,0015 31 SMH31 0,0260 0,0157 0,0127 0,0145 0,0123 0,0024 0,0201 0,0121 32 SMH32 0,0223 0,0110 0,0112 0,0128 0,0114 0,0032 0,0331 0,0223 33 SMH33 0,0242 0,0161 0,0109 0,0141 0,0105 0,0025 0,0403 0,0215 34 SMH34 0,0261 0,0118 0,0107 0,0145 0,0131 0,0024 0,0312 0,0121 35 SMH35 0,0220 0,0107 0,0112 0,0128 0,0126 0,0032 0,0418 0,0023 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ Nguyễn Thanh Hiền, Nguyễn Phương Anh, Trần Thị Thanh Huyền, Mai Thị Đàm Linh, Phạm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà (2019), “Đặc tính probiotic chủng Lactobacillus reuteri SMH2 phân lập từ sữa mẹ” Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2019 ... Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp CĨ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ Chuyên ngành: Vi sinh vật học... đến phát triển sản phẩm probiotic phục vụ sức khoẻ sinh sản cho phụ nữ dựa chủng B coagulans, nhiên sản phẩm giai đoạn nghiên cứu phát triển chủng đặc thù phân lập tuyển chọn phụ nữ khoẻ mạnh Việt... rằng, có nhiều chế phẩm probiotics Việt Nam chưa có chế phẩm phát triển để phục vụ riêng cho việc chăm sóc sức khoẻ sinh sản phụ nữ Ý tưởng sản xuất sản phẩm probiotic để hỗ trợ điều trị bệnh phụ