Đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng steinernema spp ở một số tỉnh bắc trung bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN KẾ LONG Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long, nghiên cứu viên Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, người tận tình bảo, hướng cho tơi phương pháp luận vô giá trị để tơi có định hướng cho luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Giám đốc Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia tạo điều kiện công việc, thời gian tơi tập trung vào khóa học hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn tới anh, chị, em phòng Tuyến trùng học – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp nhiều q trình làm luận văn Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, phịng Đào tạo thầy Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nguyên cứu Cuối cùng, gửi lời cảm ơn đặc biệt đến: bố, mẹ, anh gái Hà Chi bé bỏng bên động viên, khuyến khích để tơi hồn thành luận văn này./ Tơi chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu đó! Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2010 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Hồng Thị Bích*, Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai Linh, Phan Kế Long (2010), “Nghiên cứu khả kháng vi sinh vật chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp TĐ3 phân lập từ Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Tạp chí Dược Học (giấy nhận đăng) Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode EPN 1.1.1 Sơ lược tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema 1.1.3 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 1.2.1 Giống Xenorhabdus 1.2.2 Giống Photorhabdus 1.2.3 Sự đa dạng giống Xenorhabdus Photorhabdus 1.3 Mối quan hệ tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh 1.3.1 Vai trò tuyến trùng với vi khuẩn 1.3.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh tổ hợp nematode-bacterium 10 1.4 Tình hình nghiên cứu giới nước 11 1.4.1 Những nghiên cứu giới 11 1.4.2 Những nghiên cứu Việt Nam 14 1.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học đại việc nghiên cứu vi khuẩn 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Tuyến trùng 19 2.1.2 Ấu trùng Bướm sáp lớn 20 2.2 Hóa chất thiết bị 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh 21 2.2.3 Trang thiết bị 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 22 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS 23 2.3.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cộng sinh 23 2.3.4 Phương pháp định loại VKCS dựa trình tự 16S rDNA 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Gây nhiễm ấu trùng BSL 30 3.2 Phân lập vi khuẩn cộng sinh 30 3.3 Quan sát hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn cộng sinh 32 3.4 Đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp từ tỉnh Bắc Trung Bộ 34 3.4.1 Kết khuếch đại gen 16S rDNA 34 3.4.2 Kết giải trình tự gen 16S rDNA 03 chủng VKCS 35 3.5 Phân tích đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với giống Steinernema 44 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 59 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella BTB Bromothymol Blue DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode) EtBr Ethidium bromide h IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile) NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction) TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA) TTC Triphenyltetrazolium chloride VKCS Vi khuẩn cộng sinh VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vịng đời tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp (IJs) 19 Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 20 Hình 3.1 Ảnh ấu trùng BSL chết nhiễm tuyến trùng Steinernema spp 30 Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 30TX1 31 Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 45XT 31 Hình 3.4 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn TK10 32 Hình 3.5 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 30TX1 33 Hình 3.6 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 45XT 33 Hình 3.7 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn TK10 34 Hình 3.8: Sản phẩm PCR gen 16S rDNA chủng VKCS 35 Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide lồi giống Xenorhabdus 42 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số gốc giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu 46 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh tương ứng Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 27 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng xác định trình tự DNA 28 Bảng 3.1: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA vi khuẩn 30TX1 36 Bảng 3.2: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16sDNA vi khuẩn TK10 37 Bảng 3.3: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA vi khuẩn 45XT với ngân hàng liệu trình tự quốc tế ( Genbank) chương trình BLAST ta có kết thể bảng sau: 38 Bảng 3.4 Kết thành phần nucleotide trình tự phần gen 16S rDNA chủng vi khuẩn nghiên cứu 44 Bảng 3.5: Ma trận khoảng cách di truyền trình tự nghiên cứu theo mơ hình Jukes-Cantor với phân phối đồng 44 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hiện nay, Các quốc gia có xu hướng sử dụng sản phẩm sinh học thay cho chất hóa học để phịng trừ sâu hại Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN) có khả gây bệnh trùng nhờ có cộng sinh chặt chẽ đặc hiệu với vi khuẩn cộng sinh (Xenorhabdus Steinernema Photorhabdus Heterorhabditis) Sau thâm nhập vào vật chủ, vi khuẩn sản sinh nhanh tạo độc tố giết chết vật chủ, thêm vào vi khuẩn tiết số chất chống lại tác nhân cạnh tranh khác môi trường vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993) Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, hoạt chất sinh q trình trao đổi chất chủng/lồi vi khuẩn có khả kháng sinh, kháng nấm, ngăn chặn tăng sinh tế bào ung thư chủng/lồi vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus nguồn hợp chất tự nhiên quan trọng để nghiên cứu loại thuốc cho người (Chen et al., 1994) Do chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus tạo hoạt chất khác việc tìm chủng/loài loại vi khuẩn cần thiết Ở Việt Nam, phân lập 60 chủng EPN từ vùng sinh thái khác Đây sở để dự đoán đa dạng VKCS với tuyến trùng Mặc dù, có nhiều nghiên cứu tuyến trùng có giá trị có ý nghĩa khoa học xác định hình thái, đa dạng lồi chưa có nhiều nghiên cứu VKCS với tuyến trùng, việc phân loại, định tên tìm hiểu mối quan hệ vi khuẩn với tuyến trùng vấn đề cần nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 3.5 Phân tích đa dạng di truyền chủng VKCS với giống Steinernema Bằng phương pháp phân tích đoạn gen 16S rDNA phân tích mối quan hệ di truyền chúng thu kết sau: 97 X.doucetiae.DQ211702 X.romanii.DQ211717 X.mauleonii.DQ211715 X.nematophila.DQ282116 X.szentirmaii.AJ810295 X.beddingii.AY278675 X.miraniensis.DQ211713 X.cabanillasii.AY521244 X.indica.AB507813 61 X.griffiniae.DQ211710 Xenorhabdus sp MY8 TK10 68 45XT 94 X.bovienii.AB243429 X.poinarii.AY521239 X.japonica.AB243426 X.koppenhoeferi.DQ205450 X.hominickii.AB507814 X.innexi.AJ810292 68 X.stockiae.DQ202309 X.budapestensis.DQ329379 X.ehlersii.DQ208307 54 30TX1 X.kozodoii.DQ211716 P.asymbiotica.NC 012962 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số gốc giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Mối quan hệ di truyền loài thể hình 3.10 phân theo nhóm lớn bao gồm : + Nhóm1 : X budapestensis; X ehlersii; 30TX1; X stockiae; X innexi; X hominickii; X koppenhoeferi; X japonica) Nhận thấy trình tự chủng vi khuẩn 30TX1 nằm nhóm có gốc phát sinh chung với trình tự lồi X ehlersii X budapestensis Tuy nhiên với gốc phát sinh chung giá trị bootstrap 50% nên trình tự chủng vi khuẩn 30TX1 Việt Nam có quan hệ gần gũi với lồi X ehlersii X budapestensis +Nhóm 2: X poinarii; X bovienii; X indica; X cabanillasii; X szentirmaii; X miraniensis; X beddingii; 45XT; TK10; X MY8; X griffiniae; X mauleonii; X nematophila; X romanii; X doucetiae Riêng X kozodoii khơng có có khác biệt nhiều nằm ngồi nhóm lớn nêu Nhận thấy trình tự 45XT TK10 có gốc phát sinh chung với giá trị bootstrap củng cố mạnh mẽ với giá trị lên tới 94% Hai trình tự gốc phát sinh chung với trình tự Xenorhabdus sp MY8 củng cố giá trị 75% Điều cho thấy loài 45XT TK10 Việt Nam có quan hệ gần gũi với có mối quan hệ mật thiết với Xenorhabdus sp MY8 Tuy lồi lồi Mặc dù khoảng cách di truyền loài 45XT, TK10 với 30TX1 2,8% chúng lại nằm hai nhóm khác Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã phân lập chủng VKCS từ mẫu tuyến trùng Steinernema spp phân lập số tỉnh Bắc Trung Bộ: Vi khuẩn Xenorhabdus sp 30TX1 cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sangi thu Thường Xuân - Thanh Hóa Vi khuẩn Xenorhabdus sp TK10 cộng sinh với tuyến trùng Steinernema loci thu Thạch Khê - Hà Tĩnh Vi khuẩn Xenorhabdus sp 45XT cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp thu Xuân Trường - Thọ xuân - Thanh Hóa Những chủng vi khuẩn nghiên cứu, phân lập công bố lần Việt Nam Đã xác định trình tự đoạn gen 16S-rDNA chủng vi khuẩn 45XT; 30TX1; TK10 Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy trình tự chủng vi khuẩn 30TX1 Việt Nam có quan hệ gần gũi với lồi X ehlersii X budapestensis Phân tích phát sinh chủng loại cho thấy loài 45XT TK10 Việt Nam có quan hệ gần gũi với có mối quan hệ mật thiết với Xenorhabdus sp MY8 Tuy lồi lồi Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 4.2 Kiến nghị - Tiến hành thêm phản ứng sinh hóa phân tích thơng tin di truyền vùng gen khác để khẳng định loài - Nghiên cứu khả kháng sinh kháng khuẩn từ sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn phân lập để ứng dụng y dược - Vùng chưa khảo sát tuyến trùng Việt Nam chưa rộng, cần khảo sát thêm vùng khác Việt Nam để làm phong phú nguồn thông tin VKCS với tuyến trùng bổ sung vào sưu tập tuyến trùng VN Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Tài liệu nước Nguyễn Ngọc Châu (2008), Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Việt Nam Nhà Xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội Nguyễn Ngọc Châu, Phan Kế Long (2005), “Áp dụng kỹ thuật DNA để phân loại hai giống tuyến trùng Steinernema Travassos, 1927 Heterorhabditis Poinar, 1975 Việt Nam” Tạp chí Sinh học, 27 (3), 5-11 Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hồng, Ngơ Xn Tưởng (1999), “Hiệu lực gây chết chủng tuyến trùng Steinernema sp TK 10 Heterorhabditis sp TK số sâu hại trồng Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 21(2b), 91-113 Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000), “Sinh học Vi sinh vật”- NXB Giáo dục, 282 tr Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), “Vi sinh vật học”, NXB Giáo dục, 539 tr Phan Kế Long, Nguyễn Ngọc Châu Moens, M (2003), “Sự phân bố tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Rhabditida: Steinernema Heterohabditis) Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 670 -673 Phan Kế Long (2004), “Cây phát sinh chủng loại số chủng Steinernema Việt Nam sở giải mã vùng ITS-rDNA”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nhà xuất KHKT Hà Nội, 156-159 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 Phan Kế Long, Nguyễn Ngọc Châu Maurice Moens (2003), “Sự phân bố tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Rhabditida: Steinernema Heterorhabditis) Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 670-673 Phạm Văn Lực, Dương Công Chinh (1999), “Phát lồi giun trịn Steinernema sp Na Hang – Tuyên Quang khả diệt số trùng gây hại chúng”, Tạp chí sinh học, 21(2b):164-169 10 Vũ Tứ Mỹ, Nguyễn Ngọc Châu, Lại Phú Hoàng (2004), “Hiệu lực gây chết chủng tuyến trùng H-NT3 số sâu hại trồng Việt nam”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr.829-832 11 Phan Kế Long, Nguyễn Thị Nhã Helge B Bode (2009), “Diketopiperazine từ sản phẩm trao đổi chất thứ cấp vi khuẩn Xenorhabdus sp cộng sinh với Steinernema robustispiculum TN21 Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ ba, 1002 - 1005 12 Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thùy Dương, Phan Thị Hà (2002), “Xenorhabdus sp CA: Một số tính chất proteinase ngoại bào từ vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng” Tạp chí di truyền học ứng dụng, 1-6 13 Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương Thùy Dương, Phan Thị Hà (2002), “Nghiên cứu số tính chất protease ngoại bào từ vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Xenorhabdus sp.XS4”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 6-13 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 2/ Tài liệu nước ngồi: 14 Adams B.J., Fodor A., Koppenhưfer H.S., Stackebrandt E., Stock S.P and Klein, M.G (2006), “Biodiversity and systematic of nematode-bacterium entomopathogens”, Biological Control, 37, pp 32-49 15 Akhurst R.J (1980), “Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis” Journal of General Microbiology, 121, pp 303–309 16 Akhurst R.J and Dunphy G.B (1993), “Tripartite interactions between symbiotically associated entomopathogenic bacteria, nematodes, and their insect hosts”, Parasites and pathogens of insects, 2, pp 1-23 17 Akhurst, R J (1983), ”Taxnonomic study of Xenorhabdus , a genus of bacteria symbiotically associated with insect pathogenic nematodes” International Journal of Systematic Bacteriology, 33, p 38-45 18 Akhurst, R J., Boemare, N E (1990), ”Biology and taxonomy of Xenorhabdus ”, Entomopathogenic Nematodes in Biologyical Control, p.75-92 19 B Brunel, A Givaudan, A Lanois, R J Akhurst and N Boemare (1997), ”Fast and accurate identification of Xenorhabdus and Photorhabdus species by Restriction analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes”, Applied and Environmental Microbiology, p.574-580 20 Boemare N (2002) "Biology, Taxonomy and Systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus ", Entomopathogenic Nematology, 57-78 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 21 Boemare N.E and Akhurst R.J (1988), “Biochemical and physiological characterization of colony form variants in Xenorhabdus spp (Enterobacteriaceae)”, Journal of General Microbiology, 134, p.751-761 22 Emília Szállás Cathrin Koch, András Fodor, Jutta Burghardt, Orsola Buss, Attila Szintirmai, Kenneth H nealson, and Erko Stackebrandt (1997), “Phylogenetic evidence for the taxonomic heterogeneity of Photorhabdus luminescens”, International Journal of Systematic Bacteriology, 47(2), p 402-407 23 F Shahina, M Anis, A P Reid, Janet Rowe and M A Maqbool (2001), “Steinernema pakistanense sp n (Rhabditida: Steinernematidae) from Pakistan”, International Journal of Nematology, 11(1), pp.124-133 24 G Christopher Cutler and S Patricia Stock (2003), “Steinernema websteri sp n (Rhabditida: Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from china”, Nematol medit, 31, p.215-224 25 Givaudan A., Baghdiguian S., Lanois A and Boemare N.E (1995), “Swarming and swimming changes concomitant with phase variation in Xenorhabdus nematophilus”, Applied and Environmental Microbiology, 61, pp.1408-1413 26 Isabelle Babic, Marion Fischer-Le Saux, Eric Giraud and Noel Boemare (2000), “Occurrence of natural dixenic associations between the symbiont Photorhabdus luminescens and bacteria related to Ochrobactrum spp n tropical entomopathogenic Heterorhabditis spp (Nematoda, Rhabditida)”, Microbiology, 146, pp.709-718 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 27 Jennifer L Woodring and Harry K Kaya (1988), “Steinernematid and Heterorhabditid nematodes: A Handbook of Biology and Techniques Arkansas Agricultural Experiment Station Fayetteville, Arkansas 28 Jie Liu, Ralph E Berry and Michael S Blouin (2001), Identification of Symbiotic Bacteria (Photorhabdus and Xenorhabdus ) from the Entomopathogenic Nematodes Heterorhabditis marelatus and Steinernema oregonense Based on 16S- rDNA Sequence”, Journal of Invertebrate Pathology, 77(2), p 87-91 29 Joyce, S.A Reid, A., Driver, F and Curran, J (1994), “Application of polymerase chain reaction (PCR) methods to identification of entomogenic nematodes”, Genetic of entomopathogenic nematode-bacterium complex, pp 178-187 30 Ke Long Phan, Ngoc Chau Nguyen and Maurice Moens (2001), “Steinernema loci sp n and Steinernema thanhi sp n (Rhabditida: Steinernematidae) from Vietnam”, Nematology, 3(6), pp 503-514 31 Ke Long Phan, Sergei E Spiridonov, Sergei A Subbotin and Maurice Moens (2006), “Four new species of Steinernema travassos, 1928 with short inferctive juveniles from Vietnam”, Russian Journal of Nematology, 14(1), pp.11-29 32 Khuong B Nguyen, Mekete Tesfamariam, Ugur Gozel, Randy Gaugler and Byron J Adams (2004), “Steinernema yirgalemense n sp (Rhabditida: Steinernematidae) from Ethiopia”, Nematology,6(6), pp.839-856 33 L Qiu, X Hu, Y Zhou, S Mei, K.B Nguyen and Y Pang (2005), “Steinernema akhursti sp n (Nematoda: Steinernematidae) from Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 Yunnan, China“, Journal of Invertebrate Pathology, 90, pp 151-160 34 Lengyel, K., Lang, E., Fodor, A Szállás, E., Schumann, P., Stackebrandt, E (2005), “Description of four novel species of Xenorhabdus , family Enterobacteriaceae: Xenorhabdus budapestensis sp nov., Xenorhabdus ehlersii sp nov., Xenorhabdus innexi sp nov., Xenorhabdus szentimaii sp nov” Syst Appl Microbiol, 28, pp.115-122 35 Long Phan Ke, Ngoc Chau Nguyen and Maurice Moens (2001), “Steinernema sangi sp n (Rhabditida: Steinernematidae) from Vietnam”, Asian Journal of Nematology, 9(1), p.1-7 36 Marion Fischer, Hervé Mauléon, Philippe Constant, Brigitte Brunel, and Noël Boemare (1998), “PCR-Ribotyping of Xenorhabdus and Phhotorhabdus isolates from the Caribbean region in relation to the taxonomy and geographic distribution of their nematode hosts”, Applied and Environmental Microbiology, 64(11), p 4246-4254 37 Martin Sergeant, Laura Baxter, Paul Jarrett, Eve Shaw, Margaret Ousley, Craig Winstanley, and J Alun W Morgan (2006), “Identification, Typing, and Insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from Entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and Characterization of the xpt toxin Loci”, Applied and Environmental Microbiology, 72(9), p.5895-5907 38 Mutsuhiro Yoshida (2004), “Steinernema litorale n sp (Rhabditida: Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from Japan” Nematology, 6(6), pp 819-838 39 N.E Boemare, R J Akhurst and R G Mourant (1993), “DNA relatedness between Xenorhabdus spp (Enterobacteriaceae), symbiotic bacteria of Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Entomopathogenic Nematodes and a proposal to transfer Xenorhabdus luminescens to a new genus, Photorhabdus gen nov.” International Journal of Systematic Bacteriology, 43(2), p.249-255 40 Nei & Kumar S (2000), Molecular evolution and phylogenetic, Oxford university Press 41 Nguyen, K.B., D.I Shapiro-Ilan, R.J Stuart, C.W McCoy, R.J James and B.J Adams , (2004), “Heterorhabditis mexicana n sp (Rhbditida: Heterorhabditidae) from Tamaulipas, Mexico and morphological studies of the bursa of Heterorhabditis spp.”, Nematology, 6(2), 231-244 42 Nguyen, Khuong B.; Malan, Antoinette P.; Gozel, Ugur (2006), “Steinernema khoisanae n sp (Rhabditida : Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from South Africa”, Nematology, 8(2), pp 157-175 43 Nishimura, Y., Hagiwara, A., Suzuki, T., Yamanaka, S (1994), “Xenorhabdus japonicus sp nov associated with the nematode Steinernema kushidai”, World J Microbiol Biotechnol, 10, pp.207-210 44 Patrick Tailliez, Sylvie Pagès, Nadège Ginibre and Noel Boemare (2006), “New insight into diversity in the genus Xenorhabdus , including the description of ten novel species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, p 2805-2818 45 Phan Ke Long, (2004), “Diversity in entomopathogenic nematodes (Steinerrnema and Heterorhabditis spp.) in Vietnam and their potential for the biocontrol of pest insects”, University Gent pp 179 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 46 Rzhetsky A & Nei M (1992), “A simple method for estimating and testing minimum evolution trees”, Molecular Biology and Evolution, 9, p.945-967 47 S E Spiridonow et al (2004), “Steinernema jollieti sp n (Rhabditida : Steinernematidae), a new entomopathogenic nematode from the American Midwest” Russian Journal of Nematology, 12(1), p 85-95 48 S Patricia Stock, Christine T Griffin and Rani Chaerani (2004), Morphological hermaphroditum and n molecular sp characterisation (Nemmatoda: of Steinernema Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus”, Nematology, 6(3), pp 401412 49 S Patricia Stock, Zdenek Mrácek and John M Webster (2000), Morphological variation between allopatric populations of Steinernema kraussei (Steiner, 1923) (Rhabditida: Steinernematidae)”, Nematology, 2(2), p.143-152 50 S S Hussaini, M A Ansari, W.ahmad and S A Subbotin (2001), “Identification of some Indian populations of Steinernema species (Nematoda) by RFLP analysis of the ITS region of rDNA”, International Journal of Nematology,11(1), pp 73-76 51 Saitou N, Nei M (1987), “The neighbour-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol 4: 406-425 52 Selcuk Hazir, Patricia Stock and Nevin Keskin (2003), “A new entomopathogenic nematode, Steinernema anatoliense n sp (Rhabditida: Steinernematidae), from Turkey”, Systematic Parasitology, 55, pp.211-220 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 53 Sudershan Ganguly and L K Singh (2000), “Steinernema thermophilum sp n (Rhabditida: Steinernematidae) from india”, International of Nematology, 10(2), pp.183-191 54 Tailliez P., Pagès S., Ginibre N and Boemare N.E (2006), “New insight into diversity in the genus Xenorhabdus , including the description of ten novel species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56, p.2805-2818 55 Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007), “MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0”, Molecular Biology and Evolution 10.1093/molbev/msm092 56 Tímea Tóth and Tamás Lakatos (2008), “Photorhabdus temperata subsp cinerea subsp nov., isolated from nematodes”, Heterorhabditis International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58, p 2579-2581 57 Chen G., Dunphy G.B and Webster J.M (1994), “Antifungal activity of two Xenorhabdus species and Photorhabdus luminescens species of Heterorhabditis megidis” Biological Control 4: 157-162 58 Akhurst, R J (1982), “Antibiotic activity of Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with insect pathogenic nematodes of the families Heterorhabditidae and Steinernematidae”, J Gen Microbiol., 128, 3061-3066 59 Boemare, N.E., and R.J Akhurst (1990), “Physiology of phase variation in Xenorhabdus spp., Society for Invertebrate Pathology, 208-212 60 RAHN : New principles for the classification of bacteria Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene Abteilung II, 1937, 96, 273-286.] Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 61 Thomas and Poinar (1979) Xenorhabdus gen, nov., a genus of entomopathogenic nematophilic bacteria of the family Entorobacteriaccae, International journal of Systematic Bacteriology 29, 352-360 3/ Tài liệu online (WEB SITES) Genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 PHỤC LỤC Phụ lục 1: Danh sách loài Xenorhabdus tham khảo cho lập phát sinh chủng loại TT Xenorhabdus spp Genbank Steinernema spp Phân bố X griffiniae DQ211710 S ermaphroditum Xenorhabdus 21 X romanii DQ211717 S puertoricense Puero Rico X.miraniensis DQ211713 Steinernema sp Australia X bedding AY278675 Steinernema sp Australia X indica AM040494 S thermophilum India X.cabanillasii DQ211711 S riobrave USA X mauleonii DQ211715 Steinernema sp St Vicent X nematophila AY278674 S carpocapsae USA 10 X szentirmaii AJ810295 S rarum Argentina 11 X poinarii D78010 S glaseri USA 12 X budapestensis AJ810293 S bicornutum Serbia 13 X ehlersii AJ810294 S longicaudum China 14 X innexi AJ810292 S scapterisci Uruguay 15 X stockiae DQ202309 S siamkayai Thailand 16 X kozodoii DQ211716 S arenarium Russia 17 X japonica DQ202310 S kushidai Japan 18 Xenorhabdus sp TX1 DQ205447 S sangi Vietnam 19 X doicetiae DQ211709 S diaprepesi Martinique 20 X koppenhoeferi DQ205450 S scarabaei USA 21 X hominickii DQ205449 S monticolum Korea 22 X bovienii X82252 Australia sp TN S robustispiculum Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên S feltiae Indonesia Vietnam http://www.lrc-tnu.edu.vn ... gây bệnh côn trùng 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema 1.1.3 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG... khuẩn cộng sinh 30 3.3 Quan sát hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn cộng sinh 32 3.4 Đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp từ tỉnh Bắc Trung Bộ