Đa dạng di truyền vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema SPP ở một số tỉnh Bắc Trung Bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG STEINERNEMA SPP Ở MỘT SỐ TỈNH BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHAN KẾ LONG Hà Nội - 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Kế Long, nghiên cứu viên Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, người tận tình bảo, hướng cho phương pháp luận vô giá trị để có định hướng cho luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Giám đốc Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia tạo điều kiện công việc, thời gian tập trung vào khóa học hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn tới anh, chị, em phòng Tuyến trùng học – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp nhiều trình làm luận văn Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, phòng Đào tạo thầy cô Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nguyên cứu Cuối cùng, gửi lời cảm ơn đặc biệt đến: bố, mẹ, anh gái Hà Chi bé bỏng bên động viên, khuyến khích để hoàn thành luận văn này./ Tôi chân thành cảm ơn giúp đỡ quí báu đó! Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2010 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Phương Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Hoàng Thị Bích*, Nguyễn Thị Phương, Phạm Ngọc Tuyên, Lê Thị Mai Linh, Phan Kế Long (2010), “Nghiên cứu khả kháng vi sinh vật chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema sp TĐ3 phân lập từ Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Tạp chí Dược Học (giấy nhận đăng) Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Entomopathogenic nematode EPN 1.1.1 Sơ lược tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema 1.1.3 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN 1.2.1 Giống Xenorhabdus 1.2.2 Giống Photorhabdus 1.2.3 Sự đa dạng giống Xenorhabdus Photorhabdus 1.3 Mối quan hệ tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh 1.3.1 Vai trò tuyến trùng với vi khuẩn 1.3.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh tổ hợp nematode-bacterium 10 1.4 Tình hình nghiên cứu giới nước 11 1.4.1 Những nghiên cứu giới 11 1.4.2 Những nghiên cứu Việt Nam 14 1.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học đại việc nghiên cứu vi khuẩn 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.1 Tuyến trùng 19 2.1.2 Ấu trùng Bướm sáp lớn 20 2.2 Hóa chất thiết bị 20 2.2.1 Hóa chất 20 2.2.2 Môi trường phân lập vi khuẩn cộng sinh 21 2.2.3 Trang thiết bị 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL 22 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS 23 2.3.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào vi khuẩn cộng sinh 23 2.3.4 Phương pháp định loại VKCS dựa trình tự 16S rDNA 23 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Gây nhiễm ấu trùng BSL 30 3.2 Phân lập vi khuẩn cộng sinh 30 3.3 Quan sát hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn cộng sinh 32 3.4 Đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp từ tỉnh Bắc Trung Bộ 34 3.4.1 Kết khuếch đại gen 16S rDNA 34 3.4.2 Kết giải trình tự gen 16S rDNA 03 chủng VKCS 35 3.5 Phân tích đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với giống Steinernema 44 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 59 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSL Bướm sáp lớn Galleria mellonella BTB Bromothymol Blue DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid EPN Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode) EtBr Ethidium bromide h IJ Ấu trùng xâm nhiễm (Infective juvenile) NBTA Môi trường phân lập vi khuẩn (Nutrient agar supplemented with bromothymol blue and triphenyl tetrazolium chloride) PCR Phản ứng khuyếch đại đoạn DNA (Polymerase Chain Reaction) TBE Dung dịch đệm điện di (Tris/Borate/EDTA) TTC Triphenyltetrazolium chloride VKCS Vi khuẩn cộng sinh VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vòng đời tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Hình 2.1: Hình ảnh tuyến trùng Steinernema spp (IJs) 19 Hình 2.2 Ấu trùng bướm sáp lớn Galleria mellonella 20 Hình 3.1 Ảnh ấu trùng BSL chết nhiễm tuyến trùng Steinernema spp 30 Hình 3.2 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 30TX1 31 Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn 45XT 31 Hình 3.4 Ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn TK10 32 Hình 3.5 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 30TX1 33 Hình 3.6 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn 45XT 33 Hình 3.7 Ảnh tế bào chủng vi khuẩn TK10 34 Hình 3.8: Sản phẩm PCR gen 16S rDNA chủng VKCS 35 Hình 3.9: So sánh trình tự nucleotide loài giống Xenorhabdus 42 Hình 3.10: Cây phát sinh chủng loại Maximum Parsimony, số gốc giá trị % bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu 46 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tuyến trùng vi khuẩn cộng sinh tương ứng Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 27 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng xác định trình tự DNA 28 Bảng 3.1: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA vi khuẩn 30TX1 36 Bảng 3.2: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16sDNA vi khuẩn TK10 37 Bảng 3.3: Kết đối chiếu trình tự đoạn gen 16S-rDNA vi khuẩn 45XT với ngân hàng liệu trình tự quốc tế ( Genbank) chương trình BLAST ta có kết thể bảng sau: 38 Bảng 3.4 Kết thành phần nucleotide trình tự phần gen 16S rDNA chủng vi khuẩn nghiên cứu 44 Bảng 3.5: Ma trận khoảng cách di truyền trình tự nghiên cứu theo mô hình Jukes-Cantor với phân phối đồng 44 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hiện nay, Các quốc gia có xu hướng sử dụng sản phẩm sinh học thay cho chất hóa học để phòng trừ sâu hại Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic Nematodes – EPN) có khả gây bệnh côn trùng nhờ có cộng sinh chặt chẽ đặc hiệu với vi khuẩn cộng sinh (Xenorhabdus Steinernema Photorhabdus Heterorhabditis) Sau thâm nhập vào vật chủ, vi khuẩn sản sinh nhanh tạo độc tố giết chết vật chủ, thêm vào vi khuẩn tiết số chất chống lại tác nhân cạnh tranh khác môi trường vi khuẩn, nấm (Akhurst and Dunphy, 1993) Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, hoạt chất sinh trình trao đổi chất chủng/loài vi khuẩn có khả kháng sinh, kháng nấm, ngăn chặn tăng sinh tế bào ung thư chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus nguồn hợp chất tự nhiên quan trọng để nghiên cứu loại thuốc cho người (Chen et al., 1994) Do chủng/loài vi khuẩn Xenorhabdus /Photorhabdus tạo hoạt chất khác việc tìm chủng/loài loại vi khuẩn cần thiết Ở Việt Nam, phân lập 60 chủng EPN từ vùng sinh thái khác Đây sở để dự đoán đa dạng VKCS với tuyến trùng Mặc dù, có nhiều nghiên cứu tuyến trùng có giá trị có ý nghĩa khoa học xác định hình thái, đa dạng loài chưa có nhiều nghiên cứu VKCS với tuyến trùng, việc phân loại, định tên tìm hiểu mối quan hệ vi khuẩn với tuyến trùng vấn đề cần nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... gây bệnh côn trùng 1.1.2 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Steinernema 1.1.3 Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng Heterorhabditis 1.2 Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng EPN...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ PHƯƠNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG... khuẩn cộng sinh 30 3.3 Quan sát hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn cộng sinh 32 3.4 Đa dạng di truyền chủng vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema spp từ tỉnh Bắc Trung Bộ