Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------------  ---------- NGỌ VĂN NGÔN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH GÂY BỆNH HÉO XANH LẠC VÀ XÁC ĐỊNH CÁC DÒNG, GIỐNG KHÁNG BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ: 62.62.01.12 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết 2. TS. Hà Viết Cƣờng HÀ NỘI, NĂM 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện. Công trình đƣợc thực hiện trong thời gian từ năm 2012-2014. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, chƣa từng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Luận án có sử dụng kết quả của đề tài khoa học “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” do PGS.TS. Nguyễn Văn Viết - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam làm chủ nhiệm đề tài phối hợp với Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Phần kết quả nghiên cứu này đã đƣợc những ngƣời cùng tham gia thực hiện cho phép công bố trong luận án. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn năm 2015 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám đốc, Ban Đào tạo sau đại học, các quý thầy, cô giáo của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Văn Viết và TS. Hà Viết Cƣờng, những ngƣời thầy tâm huyết đã tận tình hƣớng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hƣớng khoa học cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật; Viện Công nghệ sinh học; Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm; Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các địa phƣơng tác giả thu thập số liệu, quý thầy cô, cán bộ nghiên cứu, các phòng, bộ môn của đơn vị đã có nhiều ý kiến đóng góp và tạo điều kiện giúp đỡ quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, tác giả các công trình công bố đã trích dẫn trong luận án vì đã cung cấp nguồn tƣ liệu quý báu, những kiến thức liên quan trong quá trình tác giả nghiên cứu hoàn thiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo UBND Thành phố Hà Nội, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Hà Nội; Chi cục Phát triển nông thôn Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và tài chính để tác giả hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án. Cuối cùng, với tình yêu từ đáy lòng, tác giả xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, vợ, con cùng các anh, chị, em của tác giả, những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên về vật chất và tinh thần để tác giả vững tâm hoàn thành luận án của mình. Xin chân thành cảm ơn. Tác giả luận án Ngọ Văn Ngôn iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các bảng viii Danh mục các hình xi MỞ ĐẦU 1 1 Tính cấp thiết của đề tài 1 2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4 5 Những đóng góp mới của luận án 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.1.1 Tình hình sản xuất lạc trên thế giới 6 1.1.2 Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam 7 1.2 Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc 8 1.3 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 10 1.4 Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 11 1.5 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 12 1.5.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo 12 1.5.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum 13 1.5.3 Phƣơng thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum 14 1.5.4 Ảnh hƣởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 15 1.5.5 Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh 16 1.6 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 17 1.6.1 Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum 17 1.6.2 Chủng 18 iv 1.6.3 Loài phức 19 1.6.4 Kiểu gây bệnh 19 1.6.5 Kiểu quan hệ phả hệ 19 1.7 Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 20 1.7.1 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh 20 1.7.2 Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 22 1.8 Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 1.8.1 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh 1.8.2 25 25 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh CHƢƠNG 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 36 2.1 Nội dung nghiên cứu 36 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 2.3 Vật liệu nghiên cứu 37 2.4 Môi trƣờng, hóa chất dùng trong nghiên cứu 39 2.4.1 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa 39 2.4.2 Môi trƣờng, hóa chất sử dụng trong PCR 40 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng 40 2.5.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 41 2.5.3 Phƣơng pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc 41 2.5.4 Phƣơng pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum 42 2.5.5 Phƣơng pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh 2.5.6 héo xanh hại lạc 43 Phƣơng pháp phân tích ADN 44 v 2.5.7 Phƣơng pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK của nguồn vật liệu 48 2.5.8 Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 49 2.5.9 Chỉ tiêu theo dõi 50 2.5.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 51 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 3.1 Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 3.1.1 52 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 52 3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54 3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 55 3.1.4 Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc 58 3.2 Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 60 3.2.1 Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 60 3.2.2 Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các biovar khác nhau 3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN 3.2.4 67 Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 3.3 63 72 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.1 78 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 78 vi 3.3.2 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.3 92 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.4 101 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc ƣu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.5 109 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng 3.3.6 bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 115 Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng 125 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 1 Kết luận 128 2 Đề nghị 129 Danh mục các công trình khoa học đã công bố liên quan đến luận án 130 Tài liệu tham khảo 131 Phụ lục 144 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ 1 2 Ký hiệu, chữ viết Diễn giải ký hiệu, chữ viết tắt và thuật ngữ tắt và thuật ngữ o C Nhiệt độ (độ C) Microliter l 3 4 5 ADN Biovar Bp Deoxy Nucleic Acid Thứ sinh học base pair (cặp bazơ) 6 7 BVTV Cs Bảo vệ thực vật Cộng sự 8 CT Công thức 9 10 ĐC g Đối chứng Gram 11 12 HXVK ICRISAT Héo xanh vi khuẩn International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (Viện Nghiên cứu Cây trồng cho vùng nhiệt đới bán khô hạn Quốc tế) 13 14 15 16 17 18 Isolate NXB PCR R. solanacearum Race RAPD 19 RFLP Mẫu thu thập Nhà xuất bản Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Ralstonia solanacearum Nòi Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN đƣợc nhân bội ngẫu nhiên) Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) 20 21 22 23 24 25 SPA SSR Strain STT TLB TZCA STT Sucrose Peptone Agar Simple Sequence Repeat (Trình tự lặp lại đơn giản) Chủng Số thứ tự Tỷ lệ bệnh Tetrazolium Chloride Agar viii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT 1.1 Trang Giá trị sản xuất và sản lƣợng lạc của một số nƣớc đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) 6 1.2 Diện tích, năng suất và sản lƣợng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) 7 1.3 Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra ở châu Á 2.1 8 Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn 38 2.2 Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 39 2.3 Phản ứng xác định biovar vi khuẩn R. solanacearum 43 2.4 Mức độ chống chịu bệnh HXVK hại lạc 49 3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, vụ Xuân năm 2012 3.2 Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum trên môi trƣờng nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ 3.3 58 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) 3.5 56 Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 3.4 53 60 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 3.6 64 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 3.7 65 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trƣờng SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) 66 ix 3.8 Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 3.9 Phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 3.10 79 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2013) 3.14 75 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc (Thanh Trì, năm 2012 - 2013) 3.13 74 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 3.12 73 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) 3.11 68 84 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2012-2013) 3.15 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu giống lạc trong tập đoàn (năm 2012-2013) 3.16 92 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 3.18 91 Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Thanh Trì, năm 2014) 3.17 87 95 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 3.19 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai đơn (năm 2014) 3.20 101 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) 3.21 98 102 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 104 x 3.22 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy 3.23 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai hồi quy (năm 2013-2014) 3.24 115 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc triển vọng (Thanh Trì, năm 2013-2014) 3.29 113 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (năm 2014) 3.28 112 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 3.27 109 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc ƣu tú (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 3.26 108 Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc ƣu tú (Thanh Trì, năm 2014) 3.25 106 116 Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc triển vọng (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) 119 3.30 Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng 120 3.31 Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 3.32 121 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) 3.33 Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (năm 2013-2014) 3.34 122 124 Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 3.35 125 Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) 126 xi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 3.2 Hình thái vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi 55 trƣờng TZC; (B) - môi trƣờng SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 57 3.3 Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum 59 3.4 Xác định biovar các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 62 3.5 Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 67 3.6 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPB7 3.7 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPC2 3.8 89 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 3.15 83 Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013) 3.14 82 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25 mẫu giống lạc 3.13 82 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25 mẫu giống lạc 3.12 81 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 25 mẫu giống lạc 3.11 70 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 3.10 69 Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 3.9 69 110 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 111 xii 3.16 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 3.17 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc 3.18 3.20 117 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc 3.19 111 118 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc 118 Giống lạc L28 và L29 124 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày thuộc họ đậu, có nguồn gốc ở Nam Mỹ và đƣợc trồng ở trên 100 quốc gia thuộc cả 6 châu lục. Lạc là cây trồng có giá trị dinh dƣỡng và giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp đứng thứ 2 trong các cây lấy dầu thực vật. Sản phẩm chế biến từ lạc rất đa dạng, trong đó chủ yếu từ hạt. Hạt lạc là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp chế biến và khô dầu. Bên cạnh giá trị dinh dƣỡng, giá trị kinh tế, cây lạc còn có thể trồng xen, trồng gối với những cây trồng khác góp phần cải tạo đất, chuyển dịch cơ cấu cây trồng nông nghiệp tăng thêm nguồn thu nhập cho ngƣời sản xuất. Ở Việt Nam, lạc đang là một trong số các mặt hàng nông sản xuất khẩu quan trọng. Ngoài ra, lạc còn là cây trồng có khả năng thích ứng rộng, không đòi hỏi đầu tƣ phân bón cao do bộ rễ có khả năng cố định đạm, tạo ra lƣợng đạm sinh học cung cấp cho cây và làm tăng độ phì cho đất. Hiện nay, lạc là cây họ đậu chính tham gia vào các công thức luân canh, xen canh mang tính bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Trong hơn 100 quốc gia trồng lạc trên thế giới, Việt Nam đứng thứ 10 về diện tích và trong 25 nƣớc trồng lạc ở châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về diện tích gieo trồng sau Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma và Indonesia (FAO, 2013). Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên nhƣng năng suất và sản lƣợng lạc tăng chƣa tƣơng xứng với tiềm năng. Nguyên nhân chủ yếu là hầu hết các địa phƣơng trồng lạc, đặc biệt là vùng đất trồng lạc nhờ nƣớc trời nhƣ đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh gây hại, trong đó bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra là đối tƣợng gây hại nặng trên cây lạc. Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Mỹ, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Trung Quốc, Uganda, Việt Nam,… (He, 1986; Hayward, 1990; Mehan et al., 1994; Lam và Hamidah, 1995). Bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên cây lạc với tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% (Mehan et al., 1986), thậm chí có những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994). 2 Ở Việt Nam, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh,... (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong khoảng 15% đến 35% và ở vùng trồng lạc của tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%. Năm 1896 nhà bác học Smith là ngƣời đã phát hiện vi khuẩn R. solanacearum gây ra bệnh héo xanh (Hayward, 1990). Bệnh HXVK gây hại nặng ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và các vùng có nhiệt độ ấm áp. Phạm vi ký chủ của bệnh rộng, gây hại trên 400 loài cây trồng thuộc 80 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn có thể tồn tại lâu trong hạt giống, trong đất và cỏ dại, chính vì vậy việc phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở trong nƣớc và trên thế giới nhƣ biện pháp luân canh, sinh học, hóa học, bằng giống kháng bệnh... Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a). Trong thời gian qua, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhƣ giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thƣờng bị bệnh gây hại góp phần hạn chế tác hại của bệnh. Tuy nhiên, các giống này sản xuất liên tục trong thời gian dài nên bị thoái hóa, năng suất và khả năng kháng bệnh giảm dần. Công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở nƣớc ta đã đạt đƣợc những kết quả đáng khích lệ, tuy nhiên chủ yếu theo phƣơng pháp truyền thống nên hiệu quả tích lũy các gen kháng bệnh vào con lai còn khó khăn và mất thời gian dài. Đến nay ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu nào về sử dụng chỉ thị phân tử để chọn giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đƣợc công bố. Các nghiên cứu mới chỉ khảo sát đánh giá mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của mẫu giống lạc bằng quan sát, đánh giá bệnh trong điều kiện nhân tạo và đánh giá ở các khu vực có nguồn bệnh trong điều kiện sản xuất. 3 Để rút ngắn thời gian trong việc chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, ứng dụng chỉ thị phân tử là con đƣờng ngắn và hiệu quả, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong phòng chống bệnh, bảo vệ môi trƣờng và tạo sự đa dạng sinh học đối với cây lạc (Liao et al., 2005b; Peng et al., 2011; Ding et al., 2012). Trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử, cần xác định biovar, nòi và đánh giá đa dạng di truyền của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc đƣợc nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất. Nhằm giải quyết đƣợc các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam” mang tính thời sự cấp thiết. 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1. Mục tiêu Xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả. 2.2. Yêu cầu Điều tra xác định đƣợc mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Xác định đƣợc biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn R. solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Đánh giá đƣợc khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử. 4 Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh, có năng suất cao để phát triển trong sản xuất. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Cung cấp tƣ liệu khoa học mới về áp dụng phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp với đánh giá bệnh nhân tạo nguồn vật liệu và dòng, giống lạc kháng bệnh cho chọn tạo, phát triển giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả xác định đƣợc sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi khuẩn R. solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam làm cơ sở bố trí giống kháng bệnh. Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Một số mẫu giống lạc nhƣ L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao có thể sử dụng trong quản lý cây trồng tổng hợp nhằm sản xuất lạc hiệu quả, bền vững. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu Loài vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc. Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc đƣợc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam là ký chủ của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm. Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi 5 khuẩn R. solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam; đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chỉ thị phân tử. 5. Những đóng góp mới của luận án Luận án bổ sung các tƣ liệu khoa học mới về bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đặc biệt là phòng chống bằng giống kháng bệnh; sử dụng thành công phƣơng pháp sinh học phân tử kết hợp phƣơng pháp truyền thống trong xác định đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng cao), 07 dòng từ tổ hợp lai đơn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-41,6 tạ/ha), 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,4-40,6 tạ/ha), 13 dòng lạc ƣu tú (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 36,6-40,5 tạ/ha) và 04 dòng lạc triển vọng (kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng, năng suất từ 35,7-37,8 tạ/ha) để làm vật liệu chọn tạo và phát triển giống kháng bệnh. Xác định đƣợc 2 giống lạc triển vọng gồm L28 và L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có năng suất cao đã đƣợc khảo nghiệm Quốc gia để phát triển trong sản xuất. 6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tƣơng trong số các cây trồng lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lƣợng) và đƣợc trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Thế giới (FAO, 2013), các nƣớc có sản lƣợng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ (bảng 1.1). Bảng 1.1. Giá trị sản xuất và sản lượng lạc của một số nước đứng đầu thế giới (niên vụ 2011/2012) Tên nƣớc Giá trị sản xuất (USD) Sản lƣợng (tấn) Trung Quốc 7.388,368 16.800,000 Ấn Độ 2.452,413 5.779,000 Nigeria 1.308,585 3.070,000 Mỹ 1.334,413 3.057,850 Myanmar 551,522 1.371,500 Tanzania 348,380 810,000 Indonesia 315,292 712,874 Argentina 299,808 685,722 Senegal 285,484 672,803 Cameroon 242,354 570,000 Nguồn: FAO (2013). Năng suất lạc trung bình toàn thế giới tăng, song cũng không đều giữa các vùng lãnh thổ, vùng tăng nhiều, vùng tăng ít, thậm chí nhiều nơi diện tích và năng suất lạc đều giảm. Năng suất lạc thế giới trong niên vụ 2011/2012 trung bình đạt 1,57 tấn/ha (FAO, 2013). Trong niên vụ 2011/2012 về sản lƣợng lạc, Trung Quốc là nƣớc đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nƣớc đứng thứ 12 với sản lƣợng 0,47 triệu tấn. Trung Quốc có giá trị sản xuất lạc lớn nhất thế 7 giới đạt gần 7,39 triệu đô la Mỹ (USD), tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ với các chỉ số này lần lƣợt là 2,45 và 1,33 triệu USD (FAO, 2013). 1.1.2. Tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam Sản xuất lạc ở nƣớc ta đƣợc phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm (gồm đay, cói, mía, lạc, đậu tƣơng và thuốc lá), tập trung ở các vùng chủ yếu nhƣ vùng Duyên hải Nam Trung Bộ, vùng Đồng bằng sông Hồng, vùng Trung du và Miền núi phía Bắc, vùng Bắc Trung Bộ. Các vùng khác có diện tích trồng lạc thấp hơn. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam (năm 2002 - 2012) Năm Diện tích Năng suất Sản lƣợng (1.000 ha) (tấn/ha) (1.000 tấn) 2002 246,7 1,62 400,4 2003 243,8 1,67 406,2 2004 263,7 1,78 469,0 2005 269,6 1,81 489,3 2006 246,7 1,87 462,5 2007 254,5 2,00 510,0 2008 255,3 2,08 530,2 2009 245,0 2,09 510,9 2010 231,4 2,11 487,2 2011 223,8 2,08 465,9 2012 220,5 2,13 470,6 Nguồn: Tổng cục Thống kê (2013). Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013) cho thấy, trong vòng 10 năm qua (2002-2012). Mặc dù diện tích giảm từ 246,7 ha (năm 2002) xuống còn 220,5 ha (năm 2012) nhƣng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bƣớc chuyển biến tích cực về năng suất từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) tăng lên 2,13 tấn/ha (năm 2012) với sản lƣợng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012). Năm 8 2012, năng suất lạc bình quân cả nƣớc đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha. Sản lƣợng lạc của cả nƣớc đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (Tổng cục Thống kê, 2013). 1.2. Phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra đối với sản xuất lạc Trên thế giới, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở hầu hết các vùng trồng lạc. Tuy nhiên, bệnh gây hại nghiêm trọng hơn ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Denny, 2006; Genin và Denny, 2012). Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc thông báo ở Đông và Đông Nam Á nhƣ Trung Quốc (He, 1986); Philippines, Thái Lan, Sri Lanka, Papua New Guinea và Ấn Độ (Hayward, 1990). Bệnh cũng đƣợc thông báo ở một số nƣớc nhƣ Đài Loan, Nhật Bản và Nam Carolina ở Mỹ. Bệnh cũng đƣợc coi là gây thiệt hại kinh tế quan trọng ở Uganda (Mehan et al., 1994); ở Indonesia, Thái Lan, Malaysia (Lam và Hamidah, 1995) và Việt Nam (bảng 1.3). Bảng 1.3. Một số thông tin về mức độ giảm năng suất lạc do bệnh héo xanh vi khuẩn gây ra ở châu Á Nƣớc Trung Quốc Mức độ giảm năng suất (%) 10 - 100 Nguồn tài liệu Tan et al., 1994 Indonesia 5 - 65 Machmud và Rais, 1994 Malaysia 0 - 20 Lam và Hamidah, 1994 Philippines 30 Natural, 1994 Thái Lan >50 Butranu et al., 1994 Việt Nam 5 - 80 Hong et al., 1994 Nguồn: Pande et al. (1998). Hàng năm ƣớc tính thiệt hại do bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) trên lạc từ 50.000 đến 150.000 tấn (Machmud và Rats, 1994). Ở Trung Quốc, bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phân bố ở 16 tỉnh, nhƣng gây hại chủ yếu ở vùng sản xuất lạc miền Trung và miền Nam Trung Quốc, các tỉnh bị bệnh nặng là Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, An Huy. Tỷ lệ bệnh héo xanh ở Quảng Đông từ 10% đến 20%, ở những cánh đồng bị nhiễm nặng có thể tới 100% (Tan et al., 1994). 9 Với điều kiện nóng ẩm của vùng nhiệt đới ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên nhiều loài cây trồng, trong đó có cây lạc. Trên cây lạc, tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình từ 5% đến 20% và là nguyên nhân chính làm diện tích trồng lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn 1.318 ha năm 1986 với sản lƣợng tƣơng ứng từ 19.437 tấn giảm còn 5.000 tấn (Mehan et al., 1986). Kết quả khảo sát năm 1993 cho thấy bệnh xuất hiện chủ yếu ở các vùng trồng lạc chính của vùng Kelantan và Terengganu. Tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng biến động từ 0% đến 20% (Lam và Hamidah, 1995). Mức độ thiệt hại của bệnh ở vùng đất thấp có tƣới thƣờng thấp hơn ở vùng đất cao và khô hạn. Bệnh gây hại chủ yếu ở Nam Sumatra, Tây Java và Nam Sulawesi. Các vùng thuộc Trung và Đông Java, Bali và Bắc Sulawesi bệnh nhẹ hơn (Hayward, 1990; Machmud và Hayward, 1993). Ở Thái Lan, bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc ở nhiều vùng thuộc miền Nam, miền Trung và các tỉnh phía Bắc. Bệnh gây hại chủ yếu ở những vùng trồng lạc liên tục nhiều vụ hàng năm trồng trên đất cát và tùy thuộc và giống, khí hậu, điều kiện canh tác (Butranu et al., 1994). Ở Việt Nam từ năm 1968, Đặng Thái Thuận và cs. (1968) đã phát hiện, mô tả bệnh chết ẻo cây lạc, mức độ gây hại của bệnh từ 20% đến 30%. Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều vùng trồng trong cả nƣớc (Mehan và cs., 1991; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997; Lê Lƣơng Tề, 1997a). Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1991) cho rằng ở 14 hợp tác xã trồng lạc thì bệnh HXVK hại nặng nhất ở một số điểm điều tra của tỉnh Nghệ An với tỷ lệ từ 15% đến 40%, trong khi đó ở các điểm điều tra của huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang tỷ lệ bệnh trung bình chỉ từ 10% đến 15%. Nguyễn Văn Liễu và cs. (1995) điều tra tình hình bệnh HXVK hại lạc trong sản xuất ở miền Bắc và xác định hầu hết các giống lạc đang đƣợc trồng phổ biến trong sản xuất tại thời điểm nghiên cứu là không kháng bệnh HXVK (tỷ lệ cây chết trung bình trong vụ Xuân là 15% đến 25%, ở những vùng ổ dịch bệnh gây chết từ 90% đến 100%). Theo Nguyễn Văn Liễu (1998), bệnh HXVK có ở hầu khắp các vùng trồng lạc của miền Bắc, các tỉnh trọng điểm trồng lạc nhƣ Nghệ An, Thanh Hoá, Bắc Giang là những vùng bị bệnh gây hại từ 10% đến 20%. 10 Theo Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), bệnh héo xanh vi khuẩn là một bệnh gây hại phổ biến trên cây lạc vùng Hà Nội và phụ cận. Trong năm 20082009, kết quả điều cho thấy tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc cao nhất ở huyện Ý Yên, tỉnh Nam Định trên giống lạc Sen lai (1,28%) và tỷ lệ bệnh thấp nhất ở huyện Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang trên giống lạc L14 (0,19%). 1.3. Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Mehan et al. (1994) đã mô tả triệu chứng bệnh HXVK hại lạc nhƣ sau: triệu chứng bệnh có thể quan sát rõ trên cây lạc sau khi trồng 2 - 3 tuần. Cây con nhiễm bệnh nặng, héo chết nhanh. Trên đồng ruộng triệu chứng bệnh thể hiện rõ và nhiều nhất ở giai đoạn cây bắt đầu ra hoa trở đi. Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là một vài lá ở phía trên tái đi, hơi rủ xuống. Lúc đầu, lá cây héo vào ban ngày và ban đêm lại hồi phục đƣợc, nhƣng chỉ sau vài ngày cây bị héo nhanh chóng, bộ lá héo rũ xuống không hồi phục đƣợc. Tiếp theo là cây bị khô, lá có màu xanh nâu, chóp rễ cây bệnh bị thối nhũn, mầu nâu đen. Cắt gốc thân có thể thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng sữa chảy ra. Đối với cây già hơn hoặc những giống ít bị nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn thì quá trình héo diễn ra từ từ và thƣờng bắt đầu bị bệnh ở cành trên và cuối cùng toàn bộ cây có thể bị héo và chết. Đôi khi cây bị nhiễm bệnh héo xanh không biểu hiện rõ triệu chứng. Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là loại bệnh hại mạch dẫn nên triệu chứng đặc trƣng nhất là mạch dẫn ở thân, cành, rễ bị biến màu nâu sẫm, trong đó chứa đầy dịch vi khuẩn. Trên cây bệnh lá bị héo rũ, cuối cùng cây héo khô, rễ và quả lạc bị thối đen (Mehan et al., 1994). Ở Việt Nam, Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010) nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc tại vùng Hà Nội và phụ cận cho biết, triệu chứng gây hại chủ yếu của bệnh trên cây lạc làm lá ngọn héo rũ có mầu xanh tái, mặt lá phía dƣới, các cành cũng bị héo dần và chết nhanh. Ban đầu lá héo vào ban ngày, ban đêm lại phục hồi, nhƣng chỉ sau vài ngày cây lạc héo rũ hẳn xuống không phục hồi đƣợc. Cắt gốc thân thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm kéo dài lên phía trên. Dùng tay bóp nhẹ chỗ cắt ngang có dịch nhầy trắng nhƣ sữa chảy ra. 11 1.4. Phân loại và phổ ký chủ của vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên là Bacillus solanacearum. Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia. Vi khuẩn P. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992). Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B. solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã đƣợc đổi tên lại là R. solanacearum (Yabuuchi et al., 1995). Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi khuẩn năm 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum. Hiện nay phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Beta Proteobacteria Bộ (Order): Burkholderiales Họ (Family): Ralstoniaceae Chi (Genus): Ralstonia Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác (synonym) là Pseudomonas ricini (Archibald) Robbs, 1954; Pseudomonas batatae Cheng và Faan, 1962 (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R. solanacearum còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. Vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum, Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis, 12 Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp., Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp. europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale,... (Hayward, 1994; Mehan et al., 1994, Agrios, 2008; Chandrashekara và Prasnnakumar, 2010; Peng et al., 2012; Wu et al., 2013; Lin et al., 2015). Tuy nhiên, loài vi khuẩn R. solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các vùng địa lý sinh thái. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc. Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1993) vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc. Đoàn Thị Thanh và cs. (1995) cho biết vi khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae). Năm 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay. 1.5. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn R. solanacearum 1.5.1. Đặc điểm hình thái, cấu tạo R. solanacesrum là vi khuẩn hình que, kích thƣớc tế bào 0,5 x 1,5 µm, nhuộm gram âm. Các mẫu phân lập (isolate) có độc tính cao phần lớn không có 13 lông roi và không di động, ngƣợc lại những isolate có độc tính thấp thƣờng có từ 1 đến 4 lông roi mọc đối nhau, có mức di động cao và đều có các lông roi nhỏ ở rìa (Mehan et al., 1994; Anitha et al., 2003). Nếu isolate vi khuẩn chuyển sang kiểu khuẩn lạc nâu, răn reo là isolate vi khuẩn mất tính độc (nhƣợc độc). Để phát hiện dòng vi khuẩn có tính độc thƣờng dùng môi trƣờng chọn lọc TZCA (tetrazolium chloride agar). Trên môi trƣờng này isolate vi khuẩn có tính độc sẽ có khuẩn lạc nhỏ, ở giữa màu hồng, rìa trắng (Kelman, 1954). Vi khuẩn R. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định. Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất dinh dƣỡng dự trữ. Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu ADN. Bằng kính hiển vi điện tử có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 Ao (Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhƣng trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà thƣờng đƣợc xem nhƣ tƣơng ứng với nhân. Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng, ngoài màng bào tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng nhất định. Thức ăn vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình thành trong bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs., 1983; Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994). 1.5.2. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum Vi khuẩn R. solanacearum là vi khuẩn háo khí, không hình thành bào tử và nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là nguồn các bon dự trữ. Vi khuẩn R. solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy phân tinh bột, không có khả năng tạo indol và không sử dụng arginin. Tuy nhiên, loài vi khuẩn này có khả năng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả năng thủy phân Tween 80, phản ứng dƣơng tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và catalase, urê, pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate. Vi khuẩn R. solanacearum 14 chịu đựng kém với muối NaCl. Các isolate của vi khuẩn R. solanacearum không thể phát triển trên môi trƣờng chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trƣờng có 0,5% đến 1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008). 1.5.3. Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R. solanacearum Vi khuẩn R. solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dƣ thực vật. Nhiều loài cỏ dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng. Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống. Ở Indonesia và Trung Quốc, hạt lạc thu từ những cây nhiễm bệnh có thể truyền bệnh cho vụ sau. Vi khuẩn tồn tại trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton và Hayward, 1990; Machmud, 1993; Anitha et al., 2003). Vi khuẩn R. solanacearum xâm nhập vào cây lạc qua vết thƣơng cơ giới hoặc qua lỗ mở tự nhiên ở rễ của cây và đƣợc nhân lên nhanh chóng trong mạnh dẫn làm cho mạnh dẫn trở nên bị tắc nghẽn, vi khuẩn có thể tiếp tục xâm nhập vào những mô lân cận. Trong quá trình này, vi khuẩn sản sinh ra các hệ men nhƣ pectinase, cellulose để phân hủy mô, tế bào cây và sinh ra các độc tố làm tắc mạch dẫn, cản trở vận chuyển nƣớc, nhựa nguyên và nhựa luyện trong cây làm cây bị héo nhanh chóng. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum có độc tính đƣợc quyết định bởi hệ gen độc hrp (hypersensitive response and pathogenicity). Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc là bệnh lây lan chủ yếu qua đất. Trong số các vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn R. solanacearum bền vững nhất trong đất. Vi khuẩn R. solanacearum có thể sống sót trong đất bỏ hóa vài năm thậm chí cả khi không có cây trồng trên đất đó. Vi khuẩn R. solanacearum có thể qua đông trong đất, đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban đầu quan trọng nhất. Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễm bệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng. Vi khuẩn tồn tại tốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhƣng bị kìm hãm ở đất khô và đất bị ngập nƣớc. Vi khuẩn R. solanacearum lây lan chủ yếu qua đất nhƣng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn nƣớc, qua mƣa gió và qua những vết thƣơng cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của con ngƣời, cũng có thể qua vết thƣơng ở rễ do côn trùng và tuyến trùng gây ra (Middleton và Hayward, 1990). 15 1.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt chẽ với các yếu tố thời tiết khí hậu nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, mƣa, gió, độ pH đất,... Từ lúc xâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảng thời gian nhất định. Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt độ từ 25oC đến 35oC nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới. Đất có độ ẩm cao >60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn (Anitha et al., 2003). Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu cơ, độc canh cây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng luân canh lạc với lúa nƣớc, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vôi. Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc là một trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ tƣơng đối cao. Theo Lê Lƣơng Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thƣờng phát sinh ở cả hai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu. Trong điều kiện nhiệt độ tƣơng đối cao, ẩm ƣớt, cây sinh trƣởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh gây hại nặng. Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố sinh thái, kỹ thuật, Lê Lƣơng Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai đoạn sinh trƣởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đó bệnh giảm ở giai đoạn quả già. Về ảnh hƣởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh, cho năng suất lạc cao hơn so với đối chứng. Chế độ luân canh có ảnh hƣởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại của bệnh càng giảm. Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây - lạc. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phát sinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúa nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non. 16 Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tƣơng quan giữa bệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốc miền núi làm gia tăng tích lũy nguồn bệnh và làm tăng tỷ lệ bệnh các năm tiếp theo. 1.5.5. Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc và phân lập vi khuẩn gây bệnh Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắn khoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nƣớc, sau một thời gian xuất hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Cắt dọc theo thân cây, dễ dàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou, 1983). Phƣơng pháp chẩn đoán này cũng đã đƣợc áp dụng tại Việt Nam (Burgess et al., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010). Có nhiều phƣơng pháp để xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc nhƣ phân lập trên môi trƣờng, phƣơng pháp huyết thanh, phƣơng pháp phân tích PCR (Mehan và Mc. Donald, 1995). Theo Mehan (1995), môi trƣờng tetrazolium chloride agar (TZCA) phù hợp để phân lập vi khuẩn R. solanacearum, còn môi trƣờng sucrose peptone agar (SPA) phù hợp để nhân vi khuẩn R. solanacearum. Trên môi trƣờng TZCA khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng, còn trên môi trƣờng SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có hình dạng tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa. Nhiều công trình nghiên cứu về phƣơng pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác trong bệnh học thực vật đã đƣợc công bố. Phƣơng pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn so với các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh. Bằng phƣơng pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn ADN ban đầu và đoạn mồi có thể nhân lên hàng trăm triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu gen, xác định, nhận biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R. solanacearum ở trong mẫu cây bệnh cũng nhƣ trong đất nhiễm bệnh. Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệm tham gia mạng lƣới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nƣớc và vùng lãnh thổ châu Á, Thái Bình Dƣơng nhƣ: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của các mẫu 17 phân lập thuộc loài R. solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích thƣớc không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các isolate cho sản phẩm PCR có kích thƣớc nhƣ vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997). 1.6. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn héo xanh hại lạc 1.6.1. Biovar và nòi của vi khuẩn R. solanacearum Trong hơn 40 năm qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để phân biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R. solanacearum. Biovar của vi khuẩn R. solanacearum đƣợc xác định dựa trên khả năng chuyển hóa cácbon hydrat, cụ thể là khả năng ô xy hóa 3 đƣờng đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo cacbon (dulcitol, manitol, sorbitol) (Hayward, 1964; He et al., 1983). Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R. solanacearum đã đƣợc ghi nhận bao gồm: - Biovar 1: không ô xy hóa cácbon hydrat. - Biovar 2: ô xy hóa đƣờng nhƣng không ô xy hóa rƣợu. - Biovar 3: ô xy hóa tất cả các bon hydrat. - Biovar 4: chỉ ô xy hóa rƣợu. - Biovar 5: ô xy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhƣng không ô xy hóa sorbitol, dulcitol. Các mẫu R. solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu Mỹ) có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả năng sử dụng đƣờng ribose và đƣờng trehalose). Nhóm này đƣợc đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc đƣợc đổi thành biovar 2-A (Hayward, 1995b). Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 không gây bệnh cho lạc. Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các isolate gây bệnh trên cây lạc ở các nƣớc châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Theo Wu et al. (2013), 11 isolate của vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ các tỉnh khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3. Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al. (1983) đã phân chia các isolate vi khuẩn R. solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ. Năm nòi của R. solanacearum gồm: 18 Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4. Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹ gồm biovar 2 và biovar 3. Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua và đƣợc tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao. Nòi 3 chỉ có biovar 2. Nòi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines. Nòi 4 chỉ có biovar 4. Nòi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Trung Quốc. Nòi 5 chỉ có biovar 5. Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn R. solanacearum phân lập đƣợc kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một số cây ký chủ khác, các mẫu phân lập đƣợc đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4. Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua, cà pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R. solanacearum Smith, thuộc nòi 1, biovar 3. Các isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây ký chủ đều có khả năng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đó thể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các isolate vi khuẩn cũng khác nhau. Phân tích các mẫu bệnh HXVK thu thập từ một số vùng trồng lạc, Nguyễn Thị Yến và cs. (2002) cũng xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (2002) đã cho biết trồng lạc ở đất đồi gò, đất bãi ven sông thƣờng bị bệnh héo xanh gây hại nặng và cũng đã xác định đƣợc biovar 3 và biovar 4 gây hại trên lạc ở Việt Nam. 1.6.2. Chủng Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi khuẩn R. solanacearum. Các tác giả trên thế giới thƣờng sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các mẫu vi khuẩn R. solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào nhƣ nguồn gốc phân lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền. 19 Chủng của vi khuẩn R. solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen và Kelman, 1964). Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi ký chủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử, ngày nay phân tích ADN trở thành phƣơng pháp chính xác và phù hợp để xác định chủng nhiều loại ký sinh. Bên cạnh phƣơng pháp truyền thống xác định nòi và biovar, Hayward (1990) cho biết, bằng phân tích ADN qua phƣơng pháp RFLP đã xác định vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc gồm 2 nhóm chính là nhóm I và nhóm II. Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 isolate vi khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia thành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II. 1.6.3. Loài phức Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993) đã nhận thấy vi khuẩn R. solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ là một loài phức (complex species). Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tập hợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhƣng thuộc các loài khác nhau. Các nghiên cứu đa dạng vi khuẩn dựa trên lai ADN cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức độ tƣơng đồng ADN của các mẫu vi khuẩn thƣờng < 70% (là ngƣỡng thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài). Hiện nay, vi khuẩn R. solanacearum chính thức đƣợc xem là một loài phức (Meng, 2013). 1.6.4. Kiểu gây bệnh Các chủng vi khuẩn héo xanh còn đƣợc phân biệt thành các kiểu gây bệnh (pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó. Theo Tan et al. (1994), 36 mẫu vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã đƣợc xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6 giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing, Fuhua Sheng, Ehua 1). 1.6.5. Kiểu quan hệ phả hệ Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype) 20 đã đƣợc áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R. solanacearum. Cách phân loại này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa nhƣ gen 16S RNA ribosome, gen egl, gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan, 2005). Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã đƣợc ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotype tƣơng quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từ châu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các đảo thuộc Ấn Độ Dƣơng và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011). Nhìn chung, phylotype là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến hóa đối với phức hợp loài vi khuẩn R. solanacearum (Meng, 2013). 1.7. Nghiên cứu phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 1.7.1. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng giống kháng bệnh Trên thế giới, từ năm 1910 biện pháp dùng giống kháng bệnh HXVK đã đƣợc biết đến trên cây lạc. Việc chọn tạo và đƣa vào ứng dụng giống lạc Schwarz 21 kháng bệnh HXVK tại Indonesia năm 1927 và sau đó giống này trở thành vật liệu khởi đầu cho chọn giống lạc kháng bệnh nhƣ Gajah, Pelanduk, Tupai (Middleton và Hayward, 1990). Ở Trung Quốc cũng đã tạo đƣợc những giống lạc kháng bệnh HXVK cho năng suất cao và chất lƣợng tốt nhƣ Luhua 3, Guiyou 28, Zhong Hua 2, Yue You 92, Jinyou 3121. Những giống lạc kháng R. solanacearum thƣờng tỷ lệ nhiễm bệnh trong khoảng 10%, trong khi đó ở những giống nhiễm bệnh thì ở cùng điều kiện tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến 90% (Mehan et al., 1994). Ở Uganda, Busolo-Bulafu et al. (1993) đã nghiên cứu đánh giá chọn lọc nhiều giống lạc và đã tìm ra đƣợc một số giống lạc kháng bệnh HXVK đƣa vào thực tế sản xuất nhƣ Igola-1, AT474/3/5/3. Chƣơng trình chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã rất đƣợc chú ý ở Trung Quốc. Những giống lạc vừa có tính kháng bệnh HXVK vừa có khả năng cho năng suất cao đã đƣợc đƣa vào sản xuất có vai trò hết sức quan trọng trong việc kiểm soát bệnh và tăng sản lƣợng lạc ở những vùng nhiễm bệnh HXVK (Mehan et al., 1986). Cuối những năm 1960 đã có một số lƣợng giống lạc kháng bệnh HXVK đáng kể đƣợc đƣa vào sản xuất (Mehan et al., 1994). Việc xác định nguồn gen kháng bệnh HXVK luôn đƣợc coi là một hƣớng ƣu tiên và đƣợc xúc tiến ngay từ những giai đoạn nghiên cứu đầu tiên về bệnh HXVK ở 21 nhiều quốc gia (Mehan et al., 1994). Một số nƣớc nhƣ Uganda, Mỹ, Thái lan, Malaysia, Philippines, Sri Lanka cũng luôn coi việc sử dụng giống chống bệnh là biện pháp chính và quan tâm nhất trong chƣơng trình kiểm soát bệnh HXVK (Mehan et al., 1994). Từ đó cho thấy sử dụng giống khánh bệnh luôn là hƣớng ƣu tiên hàng đầu trong chiến lƣợc phòng chống bệnh HXVK ở hầu hết các nƣớc mà có bệnh HXVK gây hại. Trong các thập kỷ 1960 - 1980 việc sàng lọc giống lạc kháng bệnh HXVK tiếp tục đƣợc thực hiện và đã xác định đƣợc nhiều dòng có tính kháng nhƣ: PI 341884, PI 341885, PI 341886, R12, 708, ICGS 5313, ICGS 7968. Với sự hợp tác của ICRISAT, nhiều giống và dòng lạc đƣợc nhập từ ICRISAT đƣợc tiếp tục đánh giá tính kháng ở Uganda (Busolo-Bulafu et al., 1993). Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK đã đƣợc nghiên cứu thành công và ứng dụng trong sản xuất. Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1993) đã chọn đƣợc một số giống lạc kháng bệnh HXVK nhƣ giống KPS17, đặc biệt là giống MD7 có tính kháng bệnh HXVK cao, đƣợc đƣa vào khảo nghiệm diện rộng và sản xuất tại một số vùng sinh thái. Theo Nguyễn Văn Liễu và cs. (1998) giống lạc Gié Nho Quan là giống có mức kháng bệnh HXVK cao nhất trong tập đoàn (tỷ lệ cây sống sót trong vƣờn nhiễm trung bình là 94,9 ± 1,9%). Phổ kháng bệnh của giống này rộng với nhiều nguồn bệnh ở các vùng sinh thái khác nhau thuộc miền Bắc và ổn định qua nhiều vụ, nhiều năm. Hầu hết các giống trong bộ giống lạc kháng bệnh HXVK quốc tế đều biểu hiện ở mức kháng và kháng cao trong điều kiện miền Bắc Việt Nam. Giống MD7 đã đƣợc công nhận là giống chính thức và phát triển ở nhiều tỉnh trồng lạc trọng điểm (Nguyễn Xuân Hồng và cs., 2002). Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007), trong số 94 mẫu giống lạc tham gia đánh giá chỉ có 5 mẫu lạc kháng cao và kháng trung bình, còn lại các giống đều bị nhiễm. Kết quả nghiên cứu này khẳng định đƣợc rằng tỷ lệ các mẫu giống lạc kháng bệnh HXVK là rất ít. Do vậy công tác nghiên cứu, xác định nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lạc kháng bệnh là cần thiết và đòi hỏi nhiều công sức. Nguyễn Thị Vân và cs. (2013) đã chọn tạo thành công giống lạc TK10 kháng bệnh HXVK và đã phát triển ở nhiều vùng sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế cao. 22 1.7.2. Phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc bằng các biện pháp khác 1.7.2.1. Biện pháp canh tác Trên thế giới, phòng chống bệnh bằng biện pháp luân canh cây trồng để làm giảm thiệt hại của bệnh HXVK là biện pháp đã đƣợc Smith đƣa ra lần đầu vào năm 1896, sau đó đã có nhiều công bố về vấn đề này. Những công bố đó đã chỉ ra rằng: nhiều loại cây không phải là ký chủ khi luân canh với cây lạc hoặc các cây họ cà có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ và mức độ gây hại của bệnh. Việc luân canh lạc với lúa nƣớc đƣợc ứng dụng rộng rãi ở những vùng có tƣới nƣớc thuộc miền Nam Trung Quốc, nơi mà bệnh HXVK gây hại nặng. Công thức luân canh này cũng phù hợp với những vùng đất có tƣới hoặc những vùng có lƣợng mƣa lớn thuộc Nam và Đông Nam Á (Mehan et al., 1994). Ở những vùng đất khô hạn, theo Tan et al. (1994) thì luân canh lạc với ngô hoặc cao lƣơng với chu kỳ từ 4 đến 5 năm hoặc với mía từ 2 đến 5 năm cũng làm giảm đáng kể thiệt hại do bệnh HXVK gây ra. Đặc biệt biện pháp luân canh lạc với ngô là có tính khả thi ở nhiều vùng bị bệnh HXVK gây hại nặng thuộc một số nƣớc ở Đông Nam Á. Việc luân canh lạc với cây không phải là ký chủ nhƣ ngô, lúa, mía là một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát bệnh (Mehan et al., 1994). Luân canh cây trồng không phải là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc là một trong những giải pháp quan trọng giúp giảm mật độ vi khuẩn trong đất và hạn chế tối đa nguồn bệnh từ các tàn dƣ thực vật vụ trƣớc. He (1990) cho rằng ngâm ruộng 15 ngày đến 30 ngày trƣớc trồng lạc hoặc luân canh với cây lúa nƣớc từ 2 đến 4 năm có tác dụng giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của lạc. Ở các công thức luân canh khác nhau, hiệu quả phòng chống bệnh HXVK cũng khác nhau (Machmud, 1993). Đối với các vùng đất cao, khó khăn trong việc trồng lúa nƣớc và có tƣới nƣớc nói chung thì luân canh với cây lúa mì, đại mạch, tiểu mạch, ngô trong chu kỳ từ 4 năm 5 năm cũng có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh (Wang và Hou, 1983; Mehan et al., 1994). Trên đất sét, bón vôi kết hợp với phân hữu cơ cũng có hiệu lực phòng bệnh nhƣng không ổn định. Xử lý và cải tạo đất bằng việc bón tăng cƣờng phân chuồng, lƣu huỳnh, canxi cũng đem lại những kết quả khác biệt nhau (Kelman et al., 1994). Tuy nhiên, một số tác giả cho rằng việc bổ sung các chất hữu cơ và vô cơ trên đã làm tăng sức đề kháng của cây do vi khuẩn R. solanacearum rất mẫn cảm với điều kiện khô, vì 23 vậy việc cày ải đất cũng có tác dụng làm giảm bệnh HXVK rất rõ, hơn nữa việc cày ải còn làm hạn chế sự phát triển của cỏ dại, vì cỏ dại cũng rất có thể là ký chủ của vi khuẩn héo xanh hại lạc (Mehan et al., 1994). 1.7.2.2. Biện pháp sinh học Biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK chủ yếu sử dụng các chế phẩm vi sinh vật đối kháng. Nhiều loại vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc nhƣ Pseudomonas cepacia, Ps. fluorescens, Bacillus polymyxa, B. subtilis, v.v.,…(Nawangsih et al., 2012; Wang và Liang, 2014). Tại Indonesia, Nawangsih et al. (2012) sử dụng các chế phẩm Pseudomonas fluorescens RH4003 và Bacillus subtilis AB89, Bacillus sp. KS2 có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh vi khuẩn héo xanh hại lạc. Ở Việt Nam, đối với biện pháp sinh học phòng chống bệnh HXVK hại lạc, Nguyễn Thu Hà và cs. (2006) đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng Bacillus sp. nhằm hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn và nâng cao năng suất đối với cây lạc. Lê Nhƣ Kiểu và cs. (2010) đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật (VSV) phòng chống bệnh HXVK hại lạc qui mô phòng thí nghiệm. Mức độ sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm duy trì sự ổn định sau 3 tháng bảo quản. Tác giả đã sử dụng chủng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm vi sinh vật cho lạc gồm Ps1 (Pseudomonas fluorescens), TS6 (Pseudomonas sp.), BK1 (Bacillus sp.), Ba5.1 (Bacillus subtilis) và T15 (Bacillus megaterium). 1.7.2.3. Biện pháp hóa học Biện pháp dùng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc cho là ít có hiệu quả trong phòng chống vi khuẩn R. solanacearum do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh. Wang và Hou (1983) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã đƣợc tiến hành từ những năm 1960. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lƣợng 300 kg/ha xử lý đất trƣớc khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số thuốc khác nhƣ Thiabendazol (C5H6N6S2) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhƣng do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con ngƣời và gia súc nên chƣa thể áp dụng 24 vào sản xuất (Tan et al., 1994). Nhiều tác giả khác cũng công bố kết quả góp phần chứng minh luận điểm dùng hóa chất phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả thấp. Dùng thuốc kháng sinh đƣợc coi là biện pháp hạn chế bệnh HXVK có triển vọng, thay thế thuốc hóa học do thuốc kháng sinh đƣợc hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Tuy nhiên, dùng thuốc kháng sinh dễ tạo ra các chủng vi khuẩn mới kháng thuốc. Hơn nữa thuốc kháng sinh có giá thành cao cũng là một trở ngại cho việc ứng dụng rộng rãi. Theo Kiraly và cs. (1983) thì dùng streptomycine với liều lƣợng từ 200 đến 400 mg/lít đã kìm hãm sự sinh trƣởng và sinh sản của vi khuẩn, tuy nhiên nếu dùng streptomycine không cẩn thận có thể gây ra sự phát triển của những chủng vi khuẩn gây bệnh lao kháng thuốc ở ngƣời và kết quả là rất nguy hiểm nếu dùng rau quả tƣơi có sử dụng streptomycine để phòng chống bệnh. Hartman và Elphinstone (1994) cũng đã nghiên cứu việc xử lý đất bằng một số loại muối nhƣ KNO3, NaNO3, NaCl và KCl với nồng độ 1% cũng thấy mật độ vi khuẩn R. solanacearum ở trong đất giảm đáng kể tới mức không thể phân lập đƣợc nữa ở 4 đến 25 ngày sau xử lý, tùy loại muối. Nhƣ vậy, cho tới nay việc dùng hóa chất để kiểm soát bệnh HXVK là chƣa có tính khả thi trong điều kiện sản xuất đại trà. 1.7.2.4. Biện pháp quản lý tổng hợp Để kiểm soát và phòng chống bệnh HXVK, yếu tố quan trọng là sử dụng giống sạch bệnh, dùng giống chống chịu với bệnh HXVK, luân canh với những cây trồng không phải là ký chủ của bệnh, áp dụng những biện pháp canh tác tốt (vệ sinh đồng ruộng và cây trồng, quản lý giun đất, loại bỏ thân cây bị bệnh, làm cỏ, khử trùng nông cụ, không tƣới nƣớc bị ô nhiễm, cày ải phơi nắng đất,…). Hạn chế làm đất sau khi trồng (việc làm đất chỉ tại thời điểm trồng để tránh gây tổn thƣơng đến rễ cây). Việc làm cỏ cũng nên làm bằng tay để tránh tổn thƣơng đến cây trồng. Áp dụng biện pháp kiểm dịch: Khi bệnh HXVK đã xuất hiện, việc kiểm dịch cần phải đƣợc áp dụng triệt để tránh sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh héo xanh ra các vùng khác chƣa nhiễm bệnh. Vì vậy biện pháp quản lý tổng hợp mới thành công trong việc giảm sự lây lan và phòng chống bệnh HXVK có hiệu quả. 25 1.8. Sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh 1.8.1. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu ký sinh gây bệnh và chọn giống kháng bệnh Trong thời gian gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cũng nhƣ trong việc sàng lọc giống kháng bệnh và tính chống chịu đƣợc đặc biệt quan tâm. Xác định đƣợc chỉ thị ADN liên kết chặt với tính trạng nào đó thì có thể sử dụng cho chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (marker assisted selection-MAS). Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình. Chỉ thị phân tử đƣợc chia làm hai loại chính: (1) Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN (chỉ thị RFLP); (2) Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR (RAPD, AFLP…). 1.8.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Ở loài A. hypogaea, sự khác biệt ở mức độ phân tử đã đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật RFLP (Kochert et al., 1991; Halward et al., 1991). Kochert et al. (1991) đã chỉ ra không có sự khác biệt giữa A. hypogaea và A. monticola. Tuy nhiên, một sự khác biệt đáng kể giữa các loài Arachis đã đƣợc ghi nhận. Để chọn giống có hiệu quả, cần phải nghiên cứu mối liên kết giữa tính trạng mong muốn với một lƣợng lớn chỉ thị để đánh giá quần thể với nhiều tính trạng nhƣ: năng suất, tính kháng, mùi vị... Một bản đồ liên kết với nhiều chỉ thị, đặc biệt là đƣợc lập với một số lƣợng lớn chỉ thị (mức độ bão hòa) có thể đƣợc sử dụng để phân lập các gen quan tâm. Bằng phân tích quần thể F2, một bản đồ RFLP đã đƣợc lập ở lạc của cặp lai nhị bội (2n = 2x = 20) giữa A. stenosperma Krapov. và W.C. Gregory và A. cardenasii Krapov và W.C. Gregory. Bản đồ có chiều dài 1.063 cM với 117 chỉ thị trong 11 nhóm liên kết, 15 chỉ thị không liên kết cũng đã đƣợc thông báo (Halward et al., 1993). Bản đồ di truyền thứ 2 trên cơ sở chỉ thị RFLP đƣợc lập bởi Burow et al., (2001) của cặp lai tứ bội Florunner x 4x [A. batizocoi Krapov và W.C. Gregory (A. cardenasii x A. diogoi Hoehne)]. Phần lớn trong 380 chỉ thị RFLP đƣợc lập bản đồ có tính di truyền bởi nhiều cặp nhiễm sắc thể, với một số trƣờng hợp ngoại lệ một nhóm liên kết có thể ở trên nhiều nhiễm sắc thể. 26 Kỹ thuật RFLP cũng đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng giữa các giống thuộc loài Arachis (giống đại diện sẽ đƣợc sử dụng để lai với A. hypogaea) và tạo nên các nhóm bằng việc sử dụng các phân tích đa chiều tƣơng ứng chặt chẽ với các nhóm hình thái. Thể tứ bội đƣợc tách biệt rõ ràng với thể nhị bội (Kochert et al., 1991). Stalker et al. (1995) đã sử dụng kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa 18 dòng của loài A. duranensis Krapov và W.C. Gregory và đã phát hiện một lƣợng lớn khác biệt giữa các dòng trong loài này, sự khác biệt giữa các mẫu trong dòng cũng đƣợc xác định bằng RFLP. Kochert et al. (1991) kết luận rằng, giống lạc trồng trọt là kết quả lai giữa A. duranensis và A. ipaensis Krapov và W.C. Gregory, phân tích lục lạp cũng chỉ ra rằng A. duranensis đóng vai trò là mẹ trong cặp lai. Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen. Do vậy có thể phân biệt đƣợc các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ƣu việt của loại chỉ thị RFLP. Hạn chế của phƣơng pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, lƣợng công việc cồng kềnh. Đặc biệt là tiêu hao một lƣợng lớn ADN mà số lƣợng đa hình thu đƣợc rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận đƣợc đa hình. 1.8.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN bằng PCR Phản ứng PCR dựa trên cơ sở phản ứng nhân ADN nhờ enzym ADN polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, mồi (primer), các nucleotide (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động nhƣ một chất xúc tác. Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trƣng. a) Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Chỉ thị RAPD đƣợc tạo ra do sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotide với nhiệt độ bắt mồi thấp. Sản phẩm của phản ứng đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dƣới đèn cực tím. RAPD là chỉ thị trội do không phân biệt đƣợc thể dị hợp tử. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP. Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Rohlf, 2000). 27 Trên cơ sở kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị RAPD, nghiên cứu của Halward et al. (1993) cho thấy sự khác nhau rất ít ở loài A. hypogaea. Chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng để xác định các giống và dòng trong chi Arachis. Các chỉ thị RAPD sử dụng trong nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt di truyền lớn giữa các giống thuộc loài Arachis (Halward et al., 1991; Subramanian et al., 2000; Mondal et al., 2007; Vyas et al., 2014; Vadodariyagopal et al., 2014). Chỉ thị RAPD có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đặc biệt đối với những sinh vật có hệ gen lớn. Garcia (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD đã phát hiện ra sự tƣơng đồng giữa chỉ thị RAPD và RFLP. Nghiên cứu cho thấy, trong mỗi thế hệ tự phối đã phát hiện số lƣợng của các chỉ thị phân tử biến mất do sự giảm phân bất thƣờng và kết quả của sự mất gen ngẫu nhiên. Tuy nhiên, trong quần thể tam bội đƣợc tạo ra bởi tự phối lục bội, có thêm gen của loài A. cardenasii vào bộ gen của loài A. hypogaea ở 10 trong 11 nhóm liên kết trên bản đồ phân tử nhị bội. Điều đó chỉ ra rằng, sự thêm gen có thể xảy ra từ các dạng nhị bội đến các dạng trồng trọt và bộ gen của loài A. hypogaea rất giống nhau. b) Chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat-SSR) Đối với cây lạc, SSR là một chỉ thị đƣợc ƣa thích trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. SSR còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại gồm từ 2 đến 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn. Bản chất đa hình của vi vệ tinh là do sự khác biệt về số lần lặp của các đơn vị lặp. Sự đa hình của các locut vi vệ tinh đƣợc xác định bằng phản ứng PCR dùng 2 mồi đƣợc thiết kế trên trình tự bản thực ở 2 đầu của vùng lặp. Chỉ thị vi vệ tinh là chỉ thị có nhiều ƣu điểm vì nó là chỉ thị đồng trội và mức độ đa dạng của quần thể có thể đƣợc xác định khi dùng nhiều chỉ thị vi vệ tinh phân bố trên toàn bộ bộ gen. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tƣợng động vật và thực vật (Perrier và Colette, 2006). Hopkins et al. (1999) đã ghi nhận 6 chỉ thị SSR đa hình ở A. hypogaea với số alen ở mỗi chỉ thị dao động từ 2 đến 14 alen. Sự khác biệt giữa 15 trong số 19 giống lạc đã đƣợc ghi nhận. 28 Chỉ thị SSR đƣợc sử dụng có hiệu quả trong việc xác định sự đa dạng di truyền của các loài lạc trồng trọt đã đƣợc công bố (Hopkins et al., 1999;. Ferguson et al., 2004;. Mace et al., 2006). Bản đồ liên kết di truyền với các chỉ thị SSR đã đƣợc xây dựng cho bộ đôi lặp lại AA trong bộ gen (Moretzsohn et al., 2004), BB (Moretzsohn et al., 2005, 2013), bộ bốn AABB (Li et al., 2004; Varshney et al., 2005, 2009; Hong et al., 2008, 2010). Gần đây, có nhiều nghiên cứu về cơ sở di truyền có tính chuyên sâu để phát triển chỉ thị SSR cung cấp các công cụ di truyền phục vụ cho nghiên cứu tổng thể giống lạc, các chỉ thị SSR đang đƣợc tập trung nghiên cứu, đã có hàng trăm chỉ thị SSR đa hình đã đƣợc nhận biết ở loài lƣỡng bội Arachis đƣợc công bố (Gimenes et al., 2007; Guo et al., 2009; Varshney et al., 2009; Hong et al., 2010; Gautami et al., 2009; Ravi et al., 2011; Mondal và Badigannavar, 2010; Qin et al., 2012; Sujay et al., 2012; Shirasawa et al., 2012). 1.8.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc và chọn lọc giống kháng bệnh Kết quả nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới còn hạn chế so với một số cây trồng khác. Trên cây lạc, chỉ thị RAPD đƣợc ứng dụng để đánh giá đa dạng di truyền đối với một số bệnh hại lạc, trong đó có bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chỉ thị RAPD có mức đa hình thấp giữa các giống lạc nghiên cứu (Subramanian et al., 2000;. Dwivedi et al., 2003; Mondal et al., 2007; Kumari et al., 2009). Tuy nhiên, ứng dụng chỉ thị RAPD cho kết quả tốt trong việc nghiên cứu đa hình của các giống lạc kháng tuyến trùng và kháng bệnh rỉ sắt gây hại trên cây lạc (Mondal et al., 2007; Mondal và Badigannavar, 2010). Bera et al. (2014) đã sử dụng 10 mồi RAPD để phân tích đa hình ADN của 34 mẫu giống lạc nghiên cứu tại Ấn Độ. Đối với mồi RAPD, số phân đoạn ADN tạo đƣợc trên bản gel điện di từ 11-18 phân đoạn với kích thƣớc từ 500-1.500 bp. Trong đó, mồi OPT6 tạo ra số phân đoạn nhiều nhất (18 phân đoạn) và mồi OPT5 tạo ra số phân đoạn ít nhất (11 phân đoạn). Mức độ đa hình của các mẫu giống lạc đánh giá từ 72,7% đến 100%. 29 Đối với cây lạc, SSR là một công cụ về di truyền phù hợp trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng và trong các chƣơng trình chọn giống. Các chỉ thị phân tử đối với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc đã đƣợc một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu bằng các chỉ thị SSR cũng nhƣ về biểu hiện gen liên quan đến bệnh héo xanh vi khuẩn. Việc nhận biết các dòng, giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn thuyết phục nhất là đánh giá phản ứng của các dòng, giống khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh, theo dõi vật liệu lây nhiễm qua một số vụ. Theo Tang et al. (2007), sử dụng 34 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 24 giống lạc trồng (Arachis hypogaea L.) đã cho thấy có 10 đến 16 chỉ thị SSR cho đa hình. Mức độ khác biệt di truyền của các giống lạc cao, biểu đồ quan hệ di truyền cho thấy hình thành 4 cụm khác nhau của các giống lạc nghiên cứu. Các dòng lạc kháng bệnh đƣợc xác định thông qua việc sàng lọc trên đồng ruộng khi lây nhiễm với vi khuẩn gây bệnh. Với 33 chỉ thị phân tử SSR đánh giá trên 46 kiểu gen đƣợc chọn lọc đã phát hiện ra 107 alen, trong đó có 101 alen đa hình (chiếm 99,4%). Tỷ lệ đa hình alen dao động từ 0,103 đến 6,669 với giá trị trung bình là 0,386. Phân tích cây phả hệ cho thấy 2 nhóm riêng biệt trong nguồn gen kháng bệnh phổ biến, tƣơng ứng với 2 phân loài hypogaea và fastigiata của loài A. hypogaea. Tuy nhiên, những dòng của 2 loài phụ gồm peruviana và aequatoriana nằm cùng nhóm với những dòng của phân loài hypogaea, mà không nằm cùng với những dòng khác thuộc phân loài fastigiata. Ngoài ra, phân tích sự thay đổi phân tử đã ghi nhận đƣợc 15% trong tổng số những thay đổi của nhóm có phản ứng với bệnh héo xanh vi khuẩn. Điều này hết sức có ý nghĩa trong việc chọn kiểu gen bố mẹ cho các cặp lai tạo quần thể lập bản đồ và lai tạo nhằm mở rộng nguồn di truyền cho các dòng, giống lạc trong tƣơng lai (Mace et al., 2007). Jiang et al., 2007a xác định có 29 chỉ thị trong số 78 chỉ thị SSR phát hiện đa hình đã đƣợc xác định dựa trên một tập đoàn 31 giống lạc có mức độ kháng bệnh héo xanh vi khuẩn khác nhau. Trong một nghiên cứu khác, 32 chỉ thị SSR đƣợc xây dựng từ 45 giống lạc cũng đƣợc phát hiện 99,4% đa hình (Mace et al., 2007). Jiang et al. (2007b) đã dựa trên quần thể F6 của cặp lai giữa hai giống Yuanza 9102 và Chico phân tích trên 354 chỉ thị SSR đã nhận đƣợc 8 nhóm liên kết, trong đó nhận đƣợc 2 chỉ thị SSR là 7G2 và PM137 liên kết với bệnh héo xanh vi khuẩn. 30 Ren et al. (2008) đã tiến hành lai 2 giống Zhonghua 5 (giống nhiễm bệnh) với giống Yuanza 9102 (giống kháng bệnh) để nghiên cứu đặc tính di truyền của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Theo dõi sự di truyền của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc từ quẩn thể F1 đến F6 của phép lai. Kết quả cho thấy, tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc đƣợc điều khiển bởi 2 gen chủ yếu với sự di truyền cao (84%). Hai chỉ thị phân tử ADN, ký hiệu là P3M59 và P1M5 liên kết với 2 gen kháng bệnh lần lƣợt ở tỷ lệ là 8,12 cM (centiMorgan) và 11,46 cM đƣợc ghi nhận khi sử dụng kỹ thuật AFLP kết hợp phân tích các biến dị với số lƣợng lớn. Có 10 kiểu gen cây lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và 3 kiểu gen nhiễm bệnh đƣợc sử dụng để kiểm tra mức độ tin cậy của các chỉ thị kháng bệnh. Kết quả mối tƣơng quan cao đã đƣợc ghi nhận với 2 chỉ thị P3M59 và P1M5 lần lƣợt là 70% và 50%. Với các kết quả thu đƣợc, chỉ thị phân tử hoàn toàn có thể sử dụng trong chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh theo tính trạng mong muốn. Một số kết quả nghiên cứu khác trong việc sử dụng chỉ thị SSR trong chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với cây lạc cũng đã đƣợc công bố, nhƣ tác giả Gautami et al. (2009) đã chọn lọc đƣợc 29 chỉ thị SSR có đa hình trên giống lạc ICGV86031. Nagy et al. (2010) đã chọn lọc đƣợc 2.847 chỉ thị SSR liên kết với gen kháng Rma-247 trên cây lạc, kết quả phân tích liên kết của 926 chỉ thị cùng với các chỉ thị đã đƣợc công bố tạo ra 21 nhóm liên kết. Một số kết quả chọn lọc chỉ thị SSR khi nghiên cứu trên cây lạc cũng đã đƣợc công bố (He et al., 2003, 2005; Barkley et al., 2007; Song et al., 2010; Holbrook et al., 2011; Koilkonda et al., 2012; Molla et al. 2012; Zhao et al., 2012; Goswami et al., 2013; Ren et al., 2014). Chỉ thị SSR liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc cũng đã đƣợc phát hiện (Bo-Shou et al., 2010). Một nghiên cứu ở Viện Hàn lâm Khoa học nông nghiệp Trung Quốc qua đánh giá hình thái và sử dụng phản ứng PCR với 18 giống lạc đã tìm thấy sự liên kết của một số chỉ thị SSR với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn (Chen et al., 2008). Để tìm ra các kiểu gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn phục vụ việc lai tạo các giống lạc, Chuang et al. (2009) tiến hành trồng 106 dòng, giống có nguồn gốc khác nhau, trên 2 địa điểm của tỉnh Shandong, Trung Quốc sau đó cho lây nhiễm với vi khuẩn gây 31 bệnh héo xanh để đánh giá khả năng kháng bệnh của từng kiểu gen dựa trên tỷ lệ sống sót của các dòng. Kết quả cho thấy, trong số 106 dòng, giống lạc đƣợc đánh giá, chỉ có 05 kiểu gen (chiếm 4,7%) kháng bệnh cao với tỷ lệ sống sót của cây sau khi lây nhiễm đạt 83,3% đến 93,3%, có 9 kiểu gen (chiếm 8,5%) kháng bệnh trung bình với tỷ lệ sống của cây sau lây nhiễm là 66,7% đến 73,3%, có 19 kiểu gen (chiếm 17,9%) đƣợc xác định là nhạy cảm trung bình và 73 kiểu gen (chiếm 68,9%) đƣợc xác định là nhạy cảm cao đối với bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc. Để khảo sát cơ chế phân tử của tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc, một giống lạc kháng bệnh Yuanza 9102 và một giống mẫn cảm Zhonghua 12 đã đƣợc lây nhiễm với vi khuẩn R. solanacearum. Những biểu hiện khác nhau của gen liên quan đến tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đã đƣợc phân tích bằng kỹ thuật AFLP sử dụng cDNA, tổng số 12.596 đoạn bản sao đã đƣợc nhân bởi 256 tổ hợp mồi, trong đó có 709 đoạn nhận đƣợc từ 119 tổ hợp mồi; 98 đoạn ngẫu nhiên đƣợc đọc trình tự và kết quả phân tích BLASTx của những trình tự thu đƣợc cho thấy 40 đoạn mã hóa cho sản phẩm gen liên quan đến năng lƣợng, phiên mã, trao đổi chất, sinh trƣởng tế bào hoặc tổng hợp protein,… Phân tích biểu hiện của 4 gen bởi qRT-PCR cho kết quả giống nhƣ phân tích cDNA-AFLP. Đặc biệt một trong số đó đoạn TDFs, 32-54-1 đã xuất hiện 47 lần trong tập đoàn giống kháng đã biết. Điều này cho thấy tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn liên quan đến nhiều mặt về hoạt động hóa sinh và sinh lý, liên quan đến sự điều chỉnh phức tạp của các gen trong các con đƣờng khác nhau nhƣ trao đổi chất, sự sao chép và khả năng chống chịu. Đoạn TDFs, 32-54-1 đƣợc dự đoán là có liên kết chặt với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn (Peng et al., 2011). Pandey et al. (2012) đã chọn lọc đƣợc 946 chỉ thị SSR có mức đa hình cao trên 20 giống lạc trồng (Arachis hypogaea L.). Theo kết quả nghiên cứu của Bera et al. (2014) sử dụng 15 chỉ thị SSR cho thấy, số phân đoạn tạo đƣợc trên bản gel điện di từ 2-10 phân đoạn. Chỉ thị PM375 tạo ra số phân đoạn nhiều nhất (10 phân đoạn) và chỉ thị TC1A02 và TC7C06 tạo ra số phân đoạn ít nhất (2 phân đoạn). Giá trị PIC của 15 chỉ thị SSR từ 0,4 (chỉ thị TC1A02) đến 0,9 (chỉ thị PM375). Chỉ thị SSR đƣợc đánh giá là cho mức độ đa hình cao hơn so với các chỉ thị 32 RFLP, RAPD. Việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc là một hƣớng đi đƣợc nhiều nhà chọn giống quan tâm và thực hiện. Ở Việt Nam, ứng dụng chỉ thị phân tử vào công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và chọn tạo giống lạc nói riêng là một hƣớng đi mới. Song song với các phƣơng pháp chọn tạo giống truyền thống thì đây đƣợc coi là một công cụ hữu ích làm tăng hiệu quả và góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống. Tuy nhiên, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lạc kháng bệnh ở nƣớc ta còn nhiều hạn chế, phần lớn các kết quả đạt đƣợc chỉ mới dừng ở nội dung đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn gây bệnh và đa dạng di truyền mẫu giống lạc. Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 35 giống lạc có phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn, Lê Thị Muội và cs. (2005) đã sử dụng 20 chỉ thị SSR để đánh giá. Kết quả cho thấy, có 19 chỉ thị cho đa hình, hệ số sai khác di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12% đến 49%. Kết quả đã ghi nhận các giống lạc có cùng nguồn gốc hoặc cùng mức độ kháng bệnh đều đƣợc xếp vào một nhóm nhỏ. Viện Công nghệ sinh học đã phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ đánh giá đa dạng tập đoàn mẫu giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng các chỉ thị RAPD, SSR và đánh giá tuyển chọn các nguồn bố mẹ làm cặp lai có tính kháng bệnh và năng suất phục vụ tạo giống đồng thời đánh giá sớm các dòng cây chọn đƣợc để phát triển thành giống. Theo Nguyễn Văn Tuất và cs. (2007), khi phân tích tính đa hình của 25 isolate vi khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chia thành 2 nhóm, trong đó nhóm I bao gồm 2 isolate là P9 và P12 gây hại lạc thu thập tại Hà Nội và Vĩnh Phúc có sự sai khác so với 23 isolate vi khuẩn còn lại là 14% (1- 0,86). Tuy chúng khác nhau về mặt địa lý nhƣng có sự trùng lặp về tƣơng quan di truyền với nhau; Nhóm II gồm 23 isolate gây hại trên cây lạc, cây vừng có sự sai khác so với nhóm I từ 0% đến 0,83%, trong đó có 14 isolate giống nhau hoàn toàn. Có 12 isolate gây hại lạc và 2 isolate (P23 và P25) có sự tƣơng đồng đến 100% và gây hại trên cây vừng. Theo kết quả nghiên cứu của Đinh Thị Phòng và cs. (2008) khi phân tích tính đa hình của 6 isolate vi khuẩn với 20 mồi ngẫu nhiên, có 15/20 mồi cho tính đa hình. 33 Trong phạm vi vùng phân tích có 126 phân đoạn ADN đƣợc nhân bản, số lƣợng phân đoạn ADN đƣợc nhân bản của các mồi dao động từ 1 đến 13 phân đoạn. Xét mối quan hệ địa lí giữa các isolate cho thấy các isolate phân lập trong cùng một vùng địa lí cũng có sự sai khác rõ ràng. Các isolate P3, P5 và P6 cùng thu tại tỉnh Hà Tây (cũ) nhƣng isolate P6 lại khác biệt với 2 isolate còn lại. Tƣơng tự nhƣ vậy, isolate P1 và P4 cùng đƣợc phân lập tại tỉnh Hòa Bình nhƣng lại có sự khác biệt lớn về di truyền và nằm tách biệt ở hai nhánh của cây phân loại. Việc sử dụng 20 mồi phân tích đã chỉ ra đƣợc sự sai khác di truyền của 6 isolate vi khuẩn phân lập ở các địa phƣơng khác nhau. Hệ số sai khác di truyền giữa 6 isolate vi khuẩn nghiên cứu là từ 0,02% đến 29,0%. Isolate P4 có sự sai khác rõ rệt với các isolate còn lại, 2 isolate P3 và P5 có sự giống nhau đến 98,0%. Sự đa dạng của các isolate còn thể hiện ngay trên cùng một vùng địa lí. Nguyễn Thị Vân và cs. (2008) cũng đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của 11 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc cho thấy có tính đa hình ở mức độ phân tử, trong đó isolate P1 thu thập ở Hà Tây (cũ) có sự khác biệt di truyền rõ ràng so với 10 isolate còn lại và có 4 isolate gồm P2, P6, P7, P9 không có sự sai khác về mặt di truyền khi phân tích bằng 10 mồi trong nghiên cứu. Tác giả đã đánh giá đƣợc khả năng kháng bệnh HXVK của 94 dòng, giống lạc trong đó có 02 giống kháng (TK10, LH3-1-1) chiếm 2,1%, có 10 giống kháng trung bình (chiếm 3,2%), 50 giống nhiễm (chiếm 53,2%) và 29 giống nhiễm nặng (chiếm 36,9%). Lƣu Minh Cúc (2009) đã nghiên cứu chỉ thị vi vệ tinh trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm lá muộn ở cây lạc. Phân tích đa dạng di truyền 32 giống lạc cho kết quả 46/104 chỉ thị cho đa hình giữa các giống, sử dụng phƣơng pháp chọn giống truyền thống kết hợp chỉ thị phân tử rút ngắn đƣợc thời gian chọn giống và chọn ra 17 dòng mang gen kháng bệnh. * Một số nhận xét rút ra từ phần tổng quan tài liệu Qua các công trình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam cho thấy, để xác định và phân biệt đặc tính gây bệnh, tính đa dạng của các isolate vi khuẩn R. solanacearum đã sử dụng hai khái niệm chính là biovar và nòi. Kết hợp công nghệ sinh học phân tử với phƣơng pháp truyền thống để xác định biovar và nòi, nhờ thành tựu của sinh học phân tử, gần đây phân tích ADN trở thành phƣơng 34 pháp chính và phù hợp để phân tích đa dạng di truyền của ký sinh. Chính vì vậy, đối với vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc, bên cạnh việc xác định nòi dựa trên phạm vi ký chủ và biovar dựa trên phản ứng sinh hóa thì việc phân tích đa dạng di truyền bằng phân tích ADN là tiêu chí quan trọng để xác định đặc điểm của các isolate vi khuẩn khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn R. solanacearum gồm 5 biovar, trong đó biovar 1, biovar 3, biovar 4 gây hại trên lạc và thuộc nòi 1. Bằng phân tích ADN với kỹ thuật RFLP đã xác định vi khuẩn R. solanacearum gây hại lạc gồm hai nhóm chính là nhóm I và nhóm II. Các nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 1997-2002 xác định nguồn vi khuẩn R. solanacearum phân lập trên cây lạc bị bệnh héo xanh đều thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn, không những góp phần hạn chế tác hại của bệnh mà còn hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, bảo vệ môi trƣờng và đem lại hiệu quả kinh tế cao. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh là con đƣờng ngắn và hiệu quả. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên thế giới còn hạn chế so với một số cây trồng khác. Một số công trình nghiên cứu đã xác định đƣợc một số chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhƣ 7G2, PM137, P3M59, P1M5,… Ở Việt Nam, ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống lạc kháng bệnh mới dừng ở nội dung đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn gây bệnh và đa dạng di truyền mẫu giống lạc. Để chọn đƣợc giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử vừa mang gen kháng, vừa có đặc điểm nông sinh học tốt và kháng đƣợc với bệnh cần xác định đa dạng di truyền của tác nhân gây bệnh héo xanh hại lạc, từ đó làm cơ sở đánh giá và chọn ra các mẫu giống lạc mới mang gen kháng với các biovar vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở các vùng sản xuất. Do vậy, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc là cần thiết nhằm phục vụ công tác chọn tạo các giống lạc kháng đối với các biovar vi khuẩn R. solanacearum hiện có trong điều kiện miền Bắc Việt Nam. 35 Một trong những công đoạn của chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn là đánh giá khả năng chống chịu bệnh của nguồn vật liệu với các isolate gây bệnh phổ biến bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc bằng các chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng kháng bệnh để cung cấp nguồn vật liệu kháng bệnh cho các nhà chọn tạo giống thực hiện các tổ hợp lai. 36 CHƢƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1. Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn gây héo xanh lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. - Điều tra, thu thập mẫu bệnh héo xanh lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. - Phân lập vi khuẩn R. solanacearum gây héo xanh lạc thu thập từ một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Nội dung 2. Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. - Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. - Nghiên cứu một số yếu tố (môi trƣờng nuôi cấy, nhiệt độ, pH) ảnh hƣởng đến sự phát triển của isolate vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh héo xanh lạc. - Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN, sự phân bố của biovar và nhóm di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam. Nội dung 3. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng, giống lạc và xác định dòng, giống kháng bệnh. - Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc mẫu giống lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử và một số đặc điểm nông học của tập đoàn mẫu giống lạc. - Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử và một số đặc điểm nông học của các dòng lai. 37 - Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử và một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài thực hiện tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Công nghệ sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm và các địa phƣơng thu mẫu bệnh (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh). Thời gian thực hiện từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 12 năm 2014. 2.3. Vật liệu nghiên cứu Nguồn vi khuẩn gồm 61 isolate gây bệnh héo xanh đƣợc thu thập từ các tỉnh: Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Từ nguồn vật liệu 61 isolate vi khuẩn đã tách chiết ADN 56 mẫu thành công đƣa vào nghiên cứu đa dạng di truyền (ADN 5 isolate tách chiết không đạt yêu cầu). Mẫu giống lạc: tập đoàn mẫu giống lạc gồm 63 mẫu giống; các dòng lạc từ tổ hợp lai do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp (50 dòng từ tổ hợp lai đơn; 26 dòng từ tổ hợp lai hồi quy; 13 dòng ƣu tú kế thừa từ nguồn vật liệu chọn giống giai đoạn trƣớc; 13 dòng triển vọng chọn từ tập đoàn) (bảng 1, 2, 3, 4, 5 phần phụ lục). Giống lạc đối chứng: Đối chứng kháng bệnh HXVK gồm hai giống Gié Nho Quan là giống có mức kháng cao đối với bệnh HXVK (Nguyễn Văn Liễu và cs., 1998) và giống BW15 có khả năng kháng bệnh HXVK tƣơng đƣơng giống Gié Nho Quan. Đối chứng nhiễm bệnh HXVK là giống ICGV3704 (là giống chuẩn nhiễm của Viện Nghiên cứu Cây trồng cạn và bán khô hạn Quốc tế - ICRISAT); đối chứng sản xuất gồm: giống MD7 là giống lạc kháng bệnh HXVK đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận chính thức năm 2002 và giống lạc L14 là giống phổ biến trong sản xuất hiện nay. Chỉ thị SSR (simple sequence repeat), RAPD (random amplified polymorphic deoxy nucleic acid) đƣợc đặt mua từ hãng Operon (Mỹ). 38 Chỉ thị phân tử: Sử dụng 3 chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK gồm: pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 là 3 chỉ thị đƣợc nhóm tác giả trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nƣớc “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK bằng kỹ thuật chỉ thị ADN” xác định với trình tự sau (bảng 2.1): Bảng 2.1. Trình tự các chỉ thị phân tử SSR liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Tên chỉ thị Trình tự (5’---3’) Độ dài Chiều dài nhân đoạn bản nhân bản chuẩn thu (bp) đƣợc(bp) Nguồn tác giả Mồi xuôi: Ferguson TTCAGTTGTGATTCCACCCC pPGPseq3F5 Mồi ngƣợc: 210 219 et al. (2004) TTACATGGCCACTGACTAGAAGTT Mồi xuôi: Ferguson ACTCCCGATGCACTTGAAAT 7G2 Mồi ngƣợc: 350 386 et al. (2004) AACCTCTGTGCACTGTCCCT Mồi xuôi: Budiman GA161 TGAGGCCGTCTTGTTTAGAGA Mồi ngƣợc: 220 226 et al., 2006 CCTCTTCCATCACCGTTCATA Sử dụng 10 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc bao gồm: OPAB5, OPAL8, OPAK14, OPB7, OPC2, OPC15, OPE17, OPE18, OPE19 và OPE20. Trình tự các mồi này đƣợc mua từ hãng Operon (Mỹ). 39 Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự (5’---3’) 1 OPAB5 CCCGAAAGCGA 2 OPAL8 GTCGCCCTCA 3 OPAK14 CTGTCATGCC 4 OPB7 GGTGACGCAG 5 OPC2 GTGAGGCGTC 6 OPC15 GACGGATCAG 7 OPE17 CTACTGCCGT 8 OPE18 GGACTGCAGA 9 OPE19 ACGGCGTATG 10 OPE20 AACGGTGACC 2.4. Môi trƣờng, hóa chất dùng trong nghiên cứu 2.4.1. Môi trường, hóa chất sử dụng trong phân lập vi khuẩn, phản ứng sinh hóa Môi trƣờng TZCA (Tetrazolium Chloride Agar) phân lập vi khuẩn R. solanacearum theo Mehan (1995): 10g pepton + 5g glucose + 1g casein hydrolysate + 17g agar + 0,05g 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride + 1 lít nƣớc cất; chỉnh pH 7,0 - 7,2. Môi trƣờng SPA (Sucrose Peptone Agar) nhân vi khuẩn R. solanacearum theo Mehan (1995): 20g sucrose + 5g peptone + 0,25g K2HPO4 + 0,25g MgSO4.7H2O + 15g agar + 1 lít nƣớc cất; chỉnh pH 7,2 - 7,4 bằng NaOH 40%. Môi trƣờng cơ sở để xác định biovar (Hayward, 1964; He et al., 1983): 1g peptone + 1 g NH4H2PO4 + 0,2 g KCl + 0,2 g MgSO4.7H2O + 3 g agar + 0,08 g bromothymol blue + 1 lít nƣớc cất; chỉnh pH 7,0 - 7,1. Các hóa chất cần thiết cho việc xác định biovar của vi khuẩn R. solanacearum nhƣ: các loại đƣờng lactose, maltose, cellobiose; các loại rƣợu 6 cácbon: sorbitol, manitol, dulcitol. 40 2.4.2. Môi trường, hóa chất sử dụng trong PCR Đệm CTAB 100 ml gồm: Nƣớc cất: 71 ml + Tris HCl 1 M, pH 8,0: 10 ml + EDTA 0,5 M, pH 8,0: 2 ml + NaCl 5 M: 14 ml + CTAB 2%: 2 g + β-mercaptoethanol: 200 µl. Đệm TE (EDTA 0,5 M, pH 8,0: 10 mM + Tris HCl pH 8,0: 1 mM); RNase (10 mg/ml); Hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25: 24: 1 v/v); hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (25: 24 v/v); cồn tuyệt đối 70% (lạnh). Hóa chất điện di: Agarose; Đệm 10× TBE gồm: 54 g Tris base + 27,5 g boric axit + 20 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0 + bổ sung nƣớc cất đến thể tích 500 ml; ethidium bromide: 10 mg/ml; Đệm tra mẫu (loading buffer) gồm: 2,5 mg bromophenol blue + 2,5 mg xylene cyanol + 0,4 g sucrose + bổ sung nƣớc cất đến thể tích 1 ml. Sau khi pha xong lƣu giữ ở tủ lạnh 4ºC. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: dNTP, Taq polymerase, MgCl2, đệm 10× PCR đƣợc đặt mua từ hãng Operon (Mỹ). Trang thiết bị trong phòng thí nghiệm: Hộp petri, ống nghiệm, ống đong, bình tam giác, que cấy, đèn cồn, panh, dao kéo, tủ định ôn, tủ sấy, máy lọc nƣớc, kính hiển vi, nồi hấp, ...và các vật dụng khác dùng trong nghiên cứu bệnh vi khuẩn hại cây trồng. 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng Điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về phƣơng pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010). Mỗi tỉnh chọn huyện và xã có diện tích trồng lạc trọng điểm. Chọn ít nhất 3 ruộng có đặc trƣng canh tác khác nhau: đất thịt, đất cát pha, đất chuyên màu... ghi chép các số liệu liên quan đến giống, chế độ luân canh, thời vụ, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật... Xác định ruộng điều tra đại diện cho vùng bị bệnh. Điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 50 cây. Đối với các mẫu bệnh có triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng, tiến hành thu đoạn thân gần gốc, cho vào túi sạch, ghi nhãn với các thông tin: nơi thu thập, giống, ngày thu mẫu,... 41 Chỉ tiêu theo dõi: tổng số cây điều tra, số cây bị bệnh. Tính tỷ lệ cây bị bệnh héo xanh vi khuẩn (%) theo công thức: TLB (%) = (A/B) x 100 Trong đó: A: Tổng số cây bị bệnh HXVK, B: Tổng số cây điều tra. 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc Phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc đƣợc áp dụng theo Mehan (1995), Nguyễn Văn Tuất (1997). Thu thập mẫu cây lạc bị bệnh héo xanh vi khuẩn điển hình, rửa sạch mẫu bệnh (thân hoặc rễ) dƣới vòi nƣớc rồi dùng dao mổ đã khử trùng cắt thành những mẩu nhỏ kích thƣớc 3-4 mm, rửa lại kỹ bằng nƣớc cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng sau đó cho từng mẫu bệnh đã cắt vào tuýp chứa nƣớc 5 ml nƣớc cất vô trùng (tất cả các thao tác trên tiến hành trong buồng cấy vô trùng có ngọn lửa đèn cồn). Sau một thời gian sẽ có dòng vi khuẩn màu trắng sữa tuôn ra từ mạch dẫn ở đầu mẫu bệnh. Sau đó lấy dịch vi khuẩn này cấy lên môi trƣờng TZCA. Phân lập vi khuẩn R. solanacearum đƣợc thực hiện trên môi trƣờng TZCA để nhận dạng các dòng vi khuẩn thông qua hình dạng và màu sắc khuẩn lạc. Để các đĩa petri đã cấy trong tủ định ôn ở nhiệt độ 28 oC và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy. Các khuẩn lạc có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng trên môi trƣờng TZCA là đặc trƣng của vi khuẩn R. solanacearum. Từ các khuẩn lạc đơn đặc trƣng, tiến hành chọn từ 3 đến 5 khuẩn lạc để cấy trên môi trƣờng TZCA. Sau 24 giờ đến 48 giờ ở nhiệt độ 28oC, tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng sữa, tâm phớt hồng có kiểu hình thái, màu sắc điển hình của vi khuẩn R. solanacearum có độc tính cao giữ trong nƣớc cất vô trùng hoặc bảo quản trên môi trƣờng dùng cho các thí nghiệm sau. Trên môi trƣờng SPA để nhân nguồn vi khuẩn, khuẩn lạc có màu trắng ngà và rìa nhẵn. 2.5.3. Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc Các isolate vi khuẩn R. solanacearum đƣợc xác định độc tính bằng phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum). Sau các thời gian bảo quản, các isolate vi khuẩn đƣợc kiểm tra, đánh giá mức độ mọc trên môi trƣờng SPA sau đó 42 tiêm vào mô lá cây thuốc lá (với nồng độ 108 CFU/ml đến 109 CFU/ml, liều lƣợng 1/20 ml/1 mũi tiêm), cây đối chứng tiêm nƣớc cất vô trùng. Tiêm theo hƣớng mặt trên của lá bánh tẻ và mũi kim tiêm úp xuống. Theo dõi mức độ hoại tử của mô lá thuốc lá sau tiêm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Isolate nào gây hoại tử trên cây thuốc lá trong thời gian càng ngắn càng có độc tính cao (Kinaly và cs., 1983). 2.5.4. Phương pháp xác định biovar của vi khuẩn R.solanacearum Xác định biovar của vi khuẩn R. solanacearum theo Hayward (1995a). Năm biovar của vi khuẩn R. solanacearum đƣợc nhận biết trên cơ sở khả năng ô xi hóa 3 đƣờng đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rƣợu Hexo - cacbon (dulcitol, manitol, sorbitol). a) Chuẩn bị môi trường cơ sở Pha 1g peptone + 1g NH4H2PO4 + 0,2g KCl + 0,2g MgSO4.7H2O + 3g agar + 0,08g bromothymol blue + 1 lít nƣớc cất; chỉnh pH 7,0 - 7,1 bằng NaOH 40%. Khử trùng bằng hấp ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 30 phút. b) Chuẩn bị dung dịch hydratcacbon Chuẩn bị 10% dung dịch hydratcacbon (dulcitol kém hòa tan ở nhiệt độ 20oC đến 30oC nên cần hòa tan bằng cách làm nóng trong bể nƣớc nóng ở nhiệt độ 60 oC đến 70oC, sau đó làm nguội lại). Cho 10 ml manitol, 10 ml sorbitol và 10 ml dulcitol vào các bình tam giác, sau đó khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 110oC trong thời gian 20 phút. Cho 10 ml lactose, 10 ml maltose và 10 ml cellobiose vào các bình tam giác, sau đó khử trùng bằng màng lọc. c) Thêm hydratcacbon vào môi trường cơ bản Sau khi đã chuẩn bị 10% dung dịch hydratcacbon, thêm vào môi trƣờng cơ bản ở nhiệt độ 60oC, sau khi hỗn hợp môi trƣờng cơ bản rồi pha 3 ml đã khử trùng vào tuýp để kiểm tra kết quả phản ứng xác định biovar. d) Chuẩn bị nguồn vi khuẩn Vi khuẩn R. solanacearum sau khi đƣợc làm thuần, tiến hành khuấy tan dịch vi khuẩn với nƣớc cất vô trùng (với nồng độ 108 CFU/ml đến 109 CFU/ml), sau đó hút 0,02 ml thể huyền phù của dịch vi khuẩn vào môi trƣờng hỗn hợp. 43 đ) Kiểm tra kết quả phản ứng xác định biovar Theo dõi các tuýp sau 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 28 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC đến 30oC cho đến khi thay đổi màu phản ứng so với màu sắc ban đầu. Xác định biovar của vi khuẩn dựa theo tài liệu mô tả của Hayward (1964), He et al. (1983) (bảng 2.3). Bảng 2.3. Phản ứng xác định biovar vi khuẩn R. solanacearum Chất khử Biovar 1 2 3 4 5 Cellobiose - + + - + Lactose - + + - + Maltose - + + - + Manitol - - + + + Sorbitol Dulcitol - - + + + + - Sự ô xi hóa của: Ghi chú: + Phản ứng dương (có sự ô xi hóa, màu sắc thay đổi); - Phản ứng âm hoặc (không có sự ô xi hóa, màu sắc thay đổi). Isolate vi khuẩn thuộc biovar 1 nếu không phản ứng với cả 6 nguồn các bon (3 loại đƣờng và 3 loại rƣợu); thuộc biovar 2 nếu chỉ phản ứng với 3 loại đƣờng; thuộc biovar 3 nếu có phản ứng với cả 6 nguồn các bon và thuộc biovar 4 nếu chỉ phản ứng với 3 loại rƣợu; thuộc biovar 5 thì phản ứng với 3 loại đƣờng và 1 loại rƣợu là manitol, không phản ứng với 2 loại rƣợu còn lại (sorbitol và dulcitol). 2.5.5. Phương pháp thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn R. solanacearum thuộc các biovar khác nhau gây bệnh héo xanh hại lạc 2.5.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển khuẩn lạc vi khuẩn thuộc biovar khác nhau Chọn các khuẩn lạc đơn có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng là đặc trƣng của vi khuẩn R. solanacearum đƣợc tách và nhân trên môi trƣờng SPA và TZCA ở pH 7,0. Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ định ôn ở mức nhiệt độ 30oC. Các isolate thuộc các biovar vi khuẩn R. solanacearum thí nghiệm bao gồm: 44 + Biovar 3: NA1, TH1, SS1, HT3. + Biovar 4: BG1, LS1. Tất cả các isolate đều thuộc nòi 1. Mỗi công thức lặp lại 3 đĩa petri/lần nhắc cho một isolate vi khuẩn. Chỉ tiêu theo dõi: Hình dạng, màu sắc và đo đƣờng kính khuẩn lạc (mm) nhân trên môi trƣờng TZCA và SPA ở pH 7,0 sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ nuôi cấy. 2.5.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự phát triển khuẩn lạc vi khuẩn Các khuẩn lạc đơn có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng cấy trên môi trƣờng SPA, pH 7,0. Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ định ôn ở mức nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC và 35oC. Các isolate thuộc các biovar vi khuẩn R. solanacearum thí nghiệm bao gồm: biovar 3: NA1, TH1, SS1, HT3; biovar 4: BG1, LS1. Mỗi công thức lặp lại 3 đĩa petri/lần nhắc cho một isolate vi khuẩn. Chỉ tiêu theo dõi: Đo đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở mức nhiệt độ 20 oC, 25oC, 30oC và 35oC sau 72 giờ nuôi cấy. 2.5.5.3. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến sự phát triển khuẩn lạc vi khuẩn Chọn các khuẩn lạc đơn có đặc tính nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng cấy trên môi trƣờng SPA với các mức pH 6,0; pH 6,5; pH 7,0; pH 7,5 và pH 8,0. Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ định ôn ở mức nhiệt độ 30oC. Các isolate thuộc các biovar vi khuẩn R. solanacearum thí nghiệm bao gồm: biovar 3: NA1, TH1, SS1, HT3; biovar 4: BG1, LS1. Mỗi công thức lặp lại 3 đĩa petri/lần nhắc cho một isolate vi khuẩn. Chỉ tiêu theo dõi: Đƣờng kính của khuẩn lạc (mm) nuôi cấy trên môi trƣờng SPA với các mức pH 6,0; pH 6,5; pH 7,0; pH 7,5 và pH 8,0 sau 72 giờ nuôi cấy. 2.5.6. Phương pháp phân tích ADN 2.5.6.1. Phương pháp tách chiết ADN từ lá lạc ADN từ lá lạc đƣợc tách chiết và tinh sạch bằng phƣơng pháp CTAB của Saghai- Maroof et al. (1994) có cải tiến theo trình tự nhƣ sau: phá vỡ tế bào bằng cách nghiền lá tƣơi với ni tơ lỏng trong chày cối sứ, tách chiết ADN bằng dung dịch CTAB, loại protein và các tạp chất khác bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1) và 45 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). ADN sau khi tinh sạch theo phƣơng pháp trên đƣợc hòa tan bằng dung dịch đệm TE (EDTA 0,5 M, pH 8,0: 10 mM + Tris HCl pH 8,0: 1 mM), pha nồng độ 25 mg/µl để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo. Kiểm tra sản phẩm ADN đã tách chiết bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Gel agarose đƣợc nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 254-260nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ). Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN tách chiết bằng quang phổ hấp phụ, phƣơng pháp tiến hành nhƣ sau: đo OD ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế 8452A Hewlett Parkard. Nồng độ ADN đƣợc tính theo công thức sau: Nồng độ ADN (µg/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng. Độ sạch ADN = OD260 /OD280 OD260, OD280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. 2.5.6.2. Phương pháp tách chiết ADN từ vi khuẩn Hút 1,6 ml dịch vi khuẩn vào mỗi tuýp 1,5 ml, ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa sau đó hòa tan tủa trong 1 ml dung dịch TES (10 mM Tris pH 7,5 + 1 mM EDTA + 100 mM NaCl). Ly tâm thu tủa tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Tái hòa tan tủa trong 500 µl dung dịch đệm TES có bổ sung 10 µl Lysozyme (100 mg/µl). Ủ mẫu ở nhiệt độ 37oC trong 1 giờ, sau đó bổ sung 10 µl dung dịch SDS (sodium dodecyl sulfate) 10%, lắc nhẹ rồi để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Tiến hành 2 lần: bổ sung 0,5 ml dung dịch phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ, rồi ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút phần dịch nổi sang tuýp 1,5 ml mới, thêm 0,5 ml dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ, rồi ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút dịch nổi sang ống mới, thêm cồn tuyệt đối theo tỷ lệ cồn/mẫu (2:1), bổ sung NaCl 5M sau đó lắc nhẹ. Tiến hành ủ mẫu ở nhiệt độ -20oC trong 1 giờ, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. Hòa tan tủa có chứa ADN bằng 50 l dung dịch đệm TE (EDTA 0,5 M, pH 8,0: 10 mM + Tris HCl pH 8,0: 1 mM). Tuýp có chứa ADN tổng số tách chiết đƣợc bảo quản trong điều kiện -20oC cho đến khi sử dụng. 46 2.5.6.3. Kỹ thuật PCR với các chỉ thị SSR Phản ứng PCR với các chỉ thị đặc hiệu đã thiết kế ở trên đƣợc tiến hành trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ) với tổng thể tích là 25 l/1 mẫu gồm những thành phần sau: 13,0 l nƣớc cất vô trùng đã khử ion; 3,0 l đệm 10x PCR; 1,5 l dNTP (2,5 mM); 1,0 l MgCl2 (50 mM); 2,0 l mồi xuôi (20 M); 2,0 l mồi ngƣợc (20 M); 0,5 l enzyme Taq polymerase (5 đơn vị/ l) và 2,0 l ADN tổng số đƣợc tách chiết. Chu trình nhiệt bao gồm 4 bƣớc sau: (1) mức nhiệt độ 94oC trong 4 phút; (2) mức nhiệt độ 94oC trong 1 phút; (3) mức nhiệt độ 58oC trong 1 phút; (4) mức nhiệt độ 72oC trong 2 phút, lặp lại 40 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 và tiếp tục điều chỉnh nhiệt độ 72oC trong 7 phút; giữ nhiệt độ ở 4oC. Kiểm tra kết quả của phản ứng PCR bằng điện di trên gel polyacrylamide. 2.5.6.4. Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide Chuẩn bị kính chạy gel: Lau hai tấm kính chạy gel bằng nƣớc cất vô trùng và cồn tuyệt đối (99,9%), rồi dùng giấy mềm, dai để lau cho kính không xƣớc và dính bụi giấy. Tấm dẫn điện ngắn cho bôi trơn bằng nƣớc rửa kính Rain X để gel không bị dính. Tấm dẫn điện dài cho hỗn hợp 1 ml (0,5% acid acetic + 95% cồn 95 o) và 2,5 µl chất dính rồi bôi đều mặt kính, để khô trong thời gian từ 15 đến 20 phút. Lắp hai bản kính với nhau theo khung có sẵn, để độ dày của tấm khung tạo khoảng trống làm khuôn đúc gel. Chuẩn bị gel: Lấy 55 ml polyacrylamide 5% (0,25% bis-acrylamide + 7,5 M urea + 50 mM boric acid + 1 mM EDTA ) và 55 l Temed cùng với 165 l ammonium persulfate 10% khuấy đều. Chạy điện di: Bản gel đƣợc điện di trên máy Sequi-Gen GT (BioRad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) trong đệm 0,5x TBE (Tris-borateEDTA). Làm nóng máy trong 30 phút ở dòng điện có công suất 100W bắt đầu tra mẫu (đã thêm 6 l loading dye) sau đó chạy điện di ở 75W trong khoảng 1,5 giờ. Khi chạy xong, bản gel đƣợc đƣa vào dung dịch cố định (125 ml acid acetic + 1 lít nƣớc cất) trong 30 phút, sau khi rửa sạch ngâm trong dung dịch nhuộm (1g AgNO3 + 1,5 ml formandehyt + 1 lít nƣớc cất) trong 30 phút, cuối cùng đƣa vào dung dịch (30g sodium cacbonat + 1,5 ml formadehyt + 0,4 ml sodium thiosunfat) khuấy cho tan hết sau đó làm lạnh ở 4oC. 47 2.5.6.5. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN Sử dụng 10 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc bao gồm: OPAB5, OPAL8, OPAK14, OPB7, OPC2, OPC15, OPE17, OPE18, OPE19 và OPE20. Trình tự các mồi này đƣợc mua tại hãng Operon (Mỹ). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi so sánh giữa các isolate với nhau trong cùng 1 mồi. Số phân đoạn ADN nhân bản dao động từ 8 đến 30 phân đoạn tùy thuộc vào từng loại mồi RAPD khác nhau. Nguồn vi khuẩn gồm 61 isolate gây bệnh héo xanh đƣợc thu thập từ các tỉnh: Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nội, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh. Từ nguồn vật liệu 61 isolate vi khuẩn đã tách chiết ADN 56 mẫu thành công đƣa vào nghiên cứu đa dạng di truyền (ADN 5 isolate tách chiết không đạt yêu cầu). Phản ứng PCR - RAPD với tổng thể tích là 15 µl, bao gồm đệm PCR 10x và nồng độ của các thành phần khác là: MgCl2 2,0 mM; dNTPs 0,2 mM; mồi 0,5 µM; 0,2 đơn vị Taq polymerase và 20 ng ADN tổng số. Phản ứng đƣợc thực hiện theo chƣơng trình ở mức nhiệt độ 95oC trong 5 phút, 35 chu kì lặp lại với 3 bƣớc chính sau: (1) biến tính ADN khuôn 50 giây ở nhiệt độ 34oC; (2) gắn mồi 1 phút 30 giây ở nhiệt độ 72oC; (3) kéo dài chuỗi ở nhiệt độ 72oC trong 5 phút. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel. Phân tích số liệu: Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, sự xuất hiện các băng điện di đƣợc ƣớc lƣợng kích thƣớc và thống kê các băng điện di với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di đƣợc tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: số 1 - xuất hiện phân đoạn ADN và số 0 - không xuất hiện phân đoạn ADN. Số liệu đƣợc xử lý bằng chƣơng trình NTSYSpc 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA, 1998). 2.5.6.6. Phương pháp chọn lọc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử Sử dụng 3 chỉ thị phân tử SSR gồm pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, có độ tin cậy cao để phân tích, chọn 48 lọc mẫu giống lạc mang gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn (trình tự nucleotide của 3 chỉ thị SSR, kích thƣớc sản phẩm điện di đƣợc ghi ở mục 2.3). Các dòng, giống lạc phân tích bao gồm các dòng, giống lạc ghi ở mục 2.3. Những dòng, giống lạc sau khi phân tích với chỉ thị có băng tƣơng ứng với giống chuẩn kháng (Gié Nho Quan hoặc BW15) đƣợc chọn là dòng, giống lạc có khả năng kháng bệnh HXVK. 2.5.7. Phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK của nguồn vật liệu Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Do tập đoàn mẫu giống lạc và các quần thể con lai rất hạn chế về số củ nên chỉ đủ để lây nhiễm đánh giá bệnh nhân tạo cho 1 isolate vi khuẩn (30 hạt lạc). Đề tài đã lựa chọn isolate SS1 thuộc biovar 3 là biovar phổ biến nhất, có độc tính và gần địa điểm thí nghiệm (Sóc Sơn, Hà Nội) nên thuận lợi cho việc thu thập, bổ sung thêm nguồn bệnh để phân lập và lây nhân tạo bổ sung trực tiếp nguồn bệnh thu thập trên đồng ruộng. Nguồn vi khuẩn đƣợc làm thuần, nhân lên trên môi trƣờng SPA bằng phƣơng pháp trang trên đĩa petri, sau 2 đến 3 ngày nuôi cấy, hòa dịch vi khuẩn đã nuôi cấy vào nƣớc cất vô trùng với mật độ tế bào vi khuẩn phù hợp (108 CFU/ml đến 109 CFU/ml). Phƣơng pháp lây nhiễm: Hạt lạc đã nảy mầm, nứt nanh đƣợc lây nhiễm với dịch vi khuẩn (mật độ tế bào vi khuẩn từ 108 CFU/ml đến 109 CFU/ml) bằng cách ngâm hạt lạc đã nảy mầm, nứt nanh vào dịch vi khuẩn trong thời gian 20 phút trƣớc khi đem gieo, sau đó trồng trên nền sick-plot để đánh giá (Mehan et al., 1994). Phƣơng pháp bổ sung dịch vi khuẩn: Thu thập tàn dƣ cây lạc bị bệnh tại vùng dịch bệnh là nơi đã thu thập isolate SS1 (Sóc Sơn). Tiến hành chặt cây lạc bị bệnh, ngâm trong thùng phi. Sau thời gian ngâm từ 8 giờ đến 12 giờ lấy nƣớc có chứa dịch vi khuẩn tƣới vào gốc cây lạc. Thời gian bổ sung nguồn bệnh: Cây lạc ở giai đoạn bắt đầu ra hoa. Bố trí thí nghiệm: Mỗi mẫu giống lạc gieo 10 hạt/1 công thức, nhắc lại 3 lần. Khoảng cách: cây cách cây 10 cm, hàng cách hàng 25 cm. Đối chứng kháng bệnh HXVK là Gié Nho Quan; đối chứng nhiễm bệnh HXVK là ICGV3704. 49 Chỉ tiêu theo dõi: Đếm toàn bộ số cây bị héo, chết sau khi mọc và khi giống đối chứng nhiễm ICGV3704 đạt tỷ lệ bệnh cao nhất. Đánh giá khả năng kháng nhiễm theo thang 6 điểm của ICRISAT (Mehan et al., 1994) (bảng 2.4). Bảng 2.4. Mức độ chống chịu bệnh HXVK hại lạc Mức độ chống Điểm số Tỷ lệ cây chết (%) 1 ≤ 10 2 >10 - 20 Kháng 3 >20 - 30 Kháng trung bình MR 4 5 6 >30 - 50 >50 - 90 > 90 Nhiễm trung bình Nhiễm Nhiễm nặng MS S HS chịu bệnh HXVK Kháng cao Ký hiệu HR R 2.5.8. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng đánh giá tập đoàn và so sánh giống 2.5.8.1. Phương pháp thí nghiệm đánh giá tập đoàn và dòng lai Phƣơng pháp thí nghiệm đánh giá tập đoàn và tổ hợp lai áp dụng theo quy trình của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm và theo tài liệu mô tả của Vũ Văn Liết (2009). Thí nghiệm đƣợc bố trí theo phƣơng pháp tuần tự không lặp lại, mỗi mẫu giống lạc đƣợc trồng với diện tích 1m2. Khoảng cách trồng: 30 cm x 10 cm x 1cây. Mức phân bón cho 1 ha: 5 tấn phân chuồng + 30 kg N + 90 kg P2O5 + 60 kg K2O và 500 kg vôi bột. Phƣơng pháp bón phân: Bón lót toàn bộ phân hữu cơ, phân lân, 1/2 lƣợng vôi + 1/2 lƣợng đạm + 1/2 lƣợng kali. Toàn bộ phân hoá học đƣợc trộn đều và bón vào hàng đã rạch sẵn, sau đó bón phân chuồng, lấp một lớp đất nhẹ phủ kín phân rồi mới gieo hạt để tránh hạt tiếp xúc với phân làm giảm sức nảy mầm. Bón thúc lần 1 khi cây có từ 2 đến 3 lá thật: 1/2 lƣợng đạm + 1/2 lƣợng kali. Bón thúc lần 2 khi ra hoa rộ: 1/2 lƣợng vôi. Xới vun: Lần 1: Khi cây có từ 2 đến 3 lá thật (sau mọc từ 10 đến 12 ngày), xới nông khắp mặt luống. Lần 2: Khi cây có từ 6 đến 8 lá thật (sau mọc từ 30 đến 35 ngày), xới sâu từ 5 đến 6 cm sát gốc và nhặt cỏ dại, không vun đất vào gốc. Lần 3: Sau khi ra hoa rộ từ 7 đến 10 ngày, xới và vun cao quanh gốc. 50 Thời gian trồng: Năm 2012 trồng ngày 05 tháng 02. Năm 2013 trồng ngày 10 tháng 02. Năm 2014 trồng ngày 08 tháng 02. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ bệnh HXVK (%), số quả chắc/cây (quả); khối lƣợng 100 quả (g); khối lƣợng 100 hạt (g); tỷ lệ hạt/quả (%); năng suất quả khô thực thu (tạ/ha). Địa điểm thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, huyện Thanh Trì, Hà Nội. 2.5.8.2. Phương pháp thí nghiệm so sánh giống Thí nghiệm so sánh giống đƣợc áp dụng theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống lạc (QCVN 01-57: 2011/BNNPTN). Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, 3 lần nhắc lại. Diện tích ô thí nghiệm 7,5m2 (5 m x 1,5 m), mặt luống rộng 1,2 m, rãnh rộng 0,3 m. Mỗi luống trồng 4 hàng dọc. Khoảng cách trồng, lƣợng phân bón và phƣơng pháp bón phân, xới vun nhƣ phƣơng pháp thí nghiệm đánh giá tập đoàn và tổ hợp lai. 2.5.9. Chỉ tiêu theo dõi Số liệu theo dõi về sinh trƣởng phát triển của các dòng, giống lạc thí nghiệm đƣợc áp dụng theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống lạc (QCVN 01-57: 2011/BNNPTN). Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn: TLB (%). Ngày mọc: là ngày có khoảng 50% số cây/ô có 2 lá mang xòe ra trên mặt đất. Ngày ra hoa: là ngày có khoảng 50% số cây/ô có ít nhất 1 hoa nở ở bất kỳ đốt nào trên thân chính. Thời gian sinh trƣởng (số ngày từ gieo đến chín): Quan sát toàn bộ cây trên ô. Khi có khoảng 80% đến 85% số quả có gân điển hình, mặt trong vỏ quả có màu đen, vỏ lụa hạt có màu đặc trƣng của giống; tầng lá giữa và gốc chuyển màu vàng và rụng là ngày chín. Chiều cao cây (cm): Đo từ đốt lá mầm đến đỉnh sinh trƣởng của thân chính của 10 cây mẫu/ô. Đo vào giai đoạn thu hoạch. Số cành cấp 1/cây: Đếm số cành hữu hiệu (cành có quả) mọc từ thân chính của 10 cây mẫu/ô. Đếm vào giai đoạn thu hoạch. 51 Số quả chắc/cây: Đếm tổng số quả chắc trên 10 cây mẫu/ô vào giai đoạn thu hoạch. Tính trung bình số quả chắc 1 cây. Khối lƣợng 100 quả (g): Cân 3 mẫu (bỏ quả lép, quả non, chỉ lấy quả chắc) vào giai đoạn sau thu hoạch, mỗi mẫu 100 quả khô ở độ ẩm hạt khoảng 12%. Khối lƣợng 100 hạt (g): Cân 3 mẫu hạt nguyên vẹn không bị sâu, bệnh đƣợc tách từ 3 mẫu quả vào giai đoạn sau thu hoạch, mỗi mẫu 100 hạt ở độ ẩm khoảng 12%. Tỷ lệ hạt/quả (%) là khối lƣợng hạt khô/khối lƣợng quả khô của 100 quả mẫu (độ ẩm khoảng 12%) vào giai đoạn sau thu hoạch. Năng suất quả khô thực thu (tạ/ha): Thu riêng từng ô, bỏ quả lép, quả non chỉ lấy quả chắc, phơi khô (độ ẩm hạt khoảng 12%), cân khối lƣợng (gồm cả hạt của 10 cây mẫu) để tính năng suất trên ô, sau đó quy ra năng suất tạ/ha. Thời gian đánh giá vào giai đoạn sau thu hoạch. Với tiêu chí chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao (từ 35,0 tạ/ha trở lên) nên đối với các dòng lai, dòng triển vọng sau khi đánh giá, đề tài chỉ chọn các dòng vừa có khả năng kháng bệnh HXVK, vừa có năng suất từ 35,0 tạ/ha trở lên để tiếp tục chọn lọc và phát triển. 2.5.10. Phương pháp xử lý số liệu Tính giá trị trung bình ( ), độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình (s) của các mẫu theo công thức sau: Giá trị trung bình: = ; Độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình: s= (nếu n ≥ 30) và s = (nếu n < 30) Trong đó: s là độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình; của mẫu thứ i (từ 1…n); n là tổng số mẫu đƣợc đánh giá; là giá trị đo đếm đƣợc là giá trị trung bình. Số liệu thu thập đƣợc xử lý trong Microsoft Excel và xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai bằng chƣơng trình IRRISTAT 4.0. 52 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều tra, thu thập và phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 3.1.1. Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam Bệnh HXVK hại lạc là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng, phổ biến ở các tỉnh trồng lạc trong cả nƣớc. Mức độ gây hại của bệnh phụ thuộc vào mùa vụ, điều kiện canh tác, thổ nhƣỡng, khí hậu. Đề tài đã tiến hành điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên 3 loại đất khác nhau, với các công thức luân canh khác nhau và trên giống lạc đƣợc trồng phổ biến ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam trong vụ Xuân năm 2012 (bảng 3.1). Kết quả điều tra cho thấy, trên các loại đất khác nhau (đất đồi gò, đất chuyên màu, đất ruộng) với các công thức luân canh khác nhau, tỷ lệ bị bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có tỷ lệ bệnh cũng khác nhau. Trên đất đồi gò (chuyên màu, xen canh với sắn, luân canh với ngô,..) tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn trung bình ở các địa phƣơng khác nhau với các giống khác nhau là cao nhất (21,6%), tiếp đến là đất chuyên màu (luân canh với cây màu) có tỷ lệ bệnh trung bình là 12,3%, thấp nhất ở đất ruộng (luân canh với lúa nƣớc) có tỷ lệ bệnh trung bình là 2,7%. Ở trên cùng một loại đất nhƣng ở các địa phƣơng khác nhau, trên các giống lạc khác nhau cũng có tỷ lệ bệnh HXVK khác nhau. Đối với đất đồi gò (chuyên màu, xen canh với sắn, luân canh với ngô,..) tỷ lệ bệnh thu đƣợc qua điều tra cao nhất ở huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang là 23,3% trên các giống lạc L14 và giống lạc địa phƣơng. Tại các điểm điều tra ở thị trấn Xuân Mai, huyện Chƣơng Mỹ, thành phố Hà Nội có tỷ lệ bệnh là 22,2%; tiếp theo các điểm điều tra ở huyện Lƣơng Sơn, tỉnh Hòa Bình có tỷ lệ bệnh là 21,2%; Tỷ lệ bệnh thấp hơn ở các điểm điều tra thuộc huyện Cẩm Xuyên, tỉnh Hà Tĩnh với tỷ lệ bệnh héo xanh hại lạc là 19,7% trên giống lạc Sen lai. 53 Bảng 3.1. Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, vụ Xuân năm 2012 Loại đất/hệ thống cây trồng Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh Đất đồi gò (Chuyên Địa điểm canh 2,27 Lạc địa phƣơng 21,2 2,34 Lạc địa phƣơng, L14 22,2 2,61 Lạc địa phƣơng, L14 23,3 1,95 21,6 2,29 10,7 1,08 Hƣng Nguyên, Nghệ An Lạc địa phƣơng 12,2 1,23 Tĩnh Gia, Thanh Hóa L14, Sen 10,8 1,54 Lạc địa phƣơng 14,2 2,43 Lạc Sơn, Hòa Bình Lạc địa phƣơng 12,5 1,96 Việt Yên, Bắc Giang Lạc địa phƣơng 13,5 1,96 12,3 1,70 với Hiệp Hòa, Bắc Giang Trung bình Đức Thọ, Hà Tĩnh Đất chuyên màu (Luân canh với Nho Quan, Ninh Bình cây màu) (%) 19,7 màu, Lƣơng Sơn, Hòa Bình ngô,…) Tỷ lệ bệnh Sen lai xen canh với sắn, Xuân Mai, Chƣơng Mỹ luân Giống L14 Trung bình Diễn Châu, Nghệ An L14 2,5 0,57 Hậu Lộc, Thanh Hóa L14 2,8 0,79 (Luân canh với Nga Sơn, Thanh Hóa L14 2,8 0,43 lúa nƣớc) Sán Dầu 2,7 0,54 2,7 0,58 Đất ruộng Ý Yên, Nam Định Trung bình Trên đất chuyên màu (luân canh lạc với cây màu) tỷ lệ bệnh biến động từ 10,7% đến 14,2%. Tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc cao nhất ở các điểm điều tra tại huyện Nho Quan, tỉnh Ninh Bình là 14,2% trên giống lạc địa phƣơng, tiếp đến là các điểm điều tra ở huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang với tỷ lệ bệnh là 13,5%; tỷ lệ bệnh thấp hơn ở các điểm điều tra thuộc các địa phƣơng nhƣ: huyện Lạc Sơn, tỉnh Hòa Bình 54 (12,5%); huyện Hƣng Nguyên, tỉnh Nghệ An (12,2%); huyện Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa (10,8%); tỷ lệ bệnh HXVK trung bình thấp nhất ở các điểm điều tra tại huyện Đức Thọ, tỉnh Hà Tĩnh (10,7%). Ở đất ruộng (luân canh với lúa nƣớc) tỷ lệ bệnh HXVK hại lạc biến động từ 2,5% đến 2,8% với tỷ lệ bệnh trung bình 2,7%. Tỷ lệ bệnh cao nhất ở huyện Hậu Lộc và huyện Nga Sơn tỉnh Thanh Hóa là 2,8%, tiếp đến là các điểm điều tra tại huyện Ý Yên, tỉnh Nam Định (2,7%), thấp nhất ở các điểm điều tra tại huyện Diễn Châu, tỉnh Nghệ An (2,5%). Nhƣ vậy, bệnh HXVK hại lạc phát sinh và gây hại nặng hơn tại vùng đất đồi gò, đất chuyên màu, còn trên đất luân canh với lúa nƣớc thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn. Ngoài ra, kết quả đánh giá tỷ lệ bệnh HXVK tại các điểm điều tra cho thấy, ở thời kỳ cây lạc ra hoa đến thời kỳ quả non bị bệnh HXVK gây hại nặng nhất. Kết quả điều tra cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây (Lê Lƣơng Tề, 1997b; Nguyễn Xuân Hồng và cs., 1997). Do đó để hạn chế bệnh HXVK hại lạc trƣớc tiên cần chọn giống kháng bệnh đồng thời luân canh cây lạc với lúa nƣớc hoặc với các cây trồng khác không phải là ký chủ của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc, bổ sung dinh dƣỡng cân đối đặc biệt vào thời kỳ cây lạc mẫn cảm với bệnh héo xanh (cây lạc ra hoa quả non), bón bổ sung phân kali và vôi bột để tăng sức đề kháng cho cây lạc, hạn chế bệnh HXVK gây hại. 3.1.2. Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc Quan sát triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng cho thấy, cây lạc bị bệnh có lá ở phía trên tái, hơi rủ xuống hoặc xoăn nhẹ. Ban đầu lá héo vào ban ngày, ban đêm lại phục hồi, nhƣng chỉ sau vài ngày cây lạc héo rũ hẳn và không phục hồi đƣợc. Rễ cây bệnh bị thối nhũn, màu nâu đen. Cắt ngang gốc thân quan sát thấy mạch dẫn mầu nâu sẫm, hoặc nâu nhạt. Ngâm đoạn cắt vào cốc nƣớc, sau một thời gian xuất hiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt. Triệu chứng bệnh héo xanh hại lạc quan sát đƣợc cũng giống với các kết quả nghiên cứu đã công bố trƣớc đây (Lê Lƣơng Tề, 1997a; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010). 55 Hình 3.1. Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trên đồng ruộng năm 2012 Trong quá trình điều tra tình hình bệnh héo xanh hại lạc đã thu thập đƣợc các mẫu bệnh HXVK hại lạc điển hình ở các địa phƣơng. Kết quả đã thu thập đƣợc 61 mẫu bệnh HXVK hại lạc điển hình tại 16 huyện của 8 tỉnh, thành phố làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3. Phân lập vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn giúp cho việc phân biệt, giám định giữa loài vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc so với các loài vi khuẩn gây bệnh cây khác. Từ một số isolate vi khuẩn (BG1, LS1, HT1(HT3), NA1, TH1, SS1, NQ1, BN1), đã tiến hành nghiên cứu màu sắc, hình thái khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum nuôi cấy môi trƣờng TZCA và SPA (bảng 3.2). Kết quả cho thấy, trên môi trƣờng TZCA, khuẩn lạc của 6 isolate vi khuẩn R. solanacearum (BG1, LS1, HT1 (HT3), NA1, TH1, SS1) có đặc tính khá đặc trƣng, dễ nhận biết là khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng, theo Mehan và McDonal (1995) các isolate này có độc tính cao. Trong khi khuẩn lạc của 2 isolate vi khuẩn R. solanacearum (NQ1, BN1) có đặc trƣng gần giống với các isolate trên nhƣng có sự khác biệt là tất cả đều có hình tròn, có màu đỏ chính giữa, đều và sâu trong khuẩn lạc, theo Mehan và McDonal (1995) các isolate này có độc tính thấp. Còn trên môi trƣờng SPA, các khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum có hình dạng tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa, không nhận biết đƣợc sự khác nhau. 56 Bảng 3.2. Đặc điểm hình dạng, màu sắc khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum trên môi trường nhân tạo sau nuôi cấy 72 giờ (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) Chỉ tiêu Isolate Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trƣờng TZCA SPA Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn BG1 đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn LS1 đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn HT1* (HT3) đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn NA1 đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn TH1 đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. SS1 Khuẩn lạc tròn, nhầy, hình dạng không Khuẩn lạc tròn, nhẵn đều, rìa khuẩn lạc có màu trắng kem, ở bóng, màu trắng sữa. giữa có phớt màu hồng nhạt. NQ1 BN1 Khuẩn lạc hình tròn, có màu đỏ chính Khuẩn lạc tròn, nhẵn giữa, đều và sâu trong khuẩn lạc. bóng, màu trắng sữa. Khuẩn lạc hình tròn, có màu hồng đỏ Khuẩn lạc tròn, nhẵn chính giữa, đều và sâu trong khuẩn lạc. bóng, màu trắng sữa. Ghi chú: *: số gốc là HT3 ; isolate vi khuẩn BG1 (Bắc Giang), LS1 (Lương Sơn, Hòa Bình), HT3 (Hà Tĩnh), NA1 (Nghệ An), TH1 (Thanh Hóa), SS1 (Sóc Sơn, Hà Nội), NQ1 (Nho Quan, Ninh Bình), BN1 (Bắc Ninh). 57 Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trƣờng TZCA theo mô tả, hƣớng dẫn của Kelman (1954), Mehan và McDonal (1995) cho thấy các isolate phân lập đều do vi khuẩn R. solanacearum gây ra. Nhƣ vậy, trên môi trƣờng TZCA có thể nhận biết khuẩn lạc của vi khuẩn R. solanacearum rất đặc trƣng nên môi trƣờng TZCA thích hợp cho việc phân lập và nhận biết vi khuẩn R. solanacearum hại lạc. (A) (B) (C) (D) Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh trên (A)- môi trƣờng TZC; (B) - môi trƣờng SPA; (C) và (D)- bảo quản nguồn vi khuẩn 58 3.1.4. Thử phản ứng siêu nhạy của nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc Để xác định độc tính của các nguồn vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc, việc thử phản ứng siêu nhạy là phƣơng pháp hữu hiệu. Từ các isolate vi khuẩn đƣợc phân lập trên mẫu bệnh thu thập ở các địa điểm điều tra, đã tiến hành thí nghiệm nhằm đánh giá độc tính của một số isolate vi khuẩn sau thời gian bảo quản 12 tháng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng SPA và tiến hành thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum). Pha dịch khuẩn trong nƣớc cất vô trùng với mật độ tế bào vi khuẩn 108 CFU/1 ml đến 109 CFU/1 ml. Sử dụng dịch vi khuẩn tiêm vào mô lá thuốc lá với liều lƣợng 1/20 ml/1 mũi tiêm. Cây đối chứng tiêm nƣớc cất vô trùng. Tiến hành theo dõi sau tiêm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 72 giờ, nếu xuất hiện đám mô chết hoại tử màu nâu xám, chứng tỏ nguồn vi khuẩn vẫn còn độc tính. Các isolate vi khuẩn đã mất độc tính sẽ không tạo vết hoại tử khi tiến hành kiểm tra phản ứng siêu nhạy (hình 3.3). Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) STT Isolate vi khuẩn Biểu hiện phản ứng siêu nhạy 1 BG1 + 2 LS1 + 3 HT1 (HT3) + 4 NA1 + 5 TH1 + 6 SS1 + 7 Đối chứng (nƣớc cất vô trùng) - Ghi chú: +: Có tạo phản ứng siêu nhạy; - : Không tạo phản ứng siêu nhạy. Qua kết quả thử phản ứng cho thấy, các isolate vi khuẩn thí nghiệm đều gây phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá sau 12 tháng bảo quản trên môi trƣờng SPA 59 chứng tỏ đều đảm bảo có độc tính, trong khi đối chứng (sử dụng nƣớc cất vô trùng) thì không tạo phản ứng siêu nhạy. Hình 3.3. Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá Nicotiana tabacum Nhƣ vậy, trong vụ Xuân 2012, các giống lạc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam bị bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum gây hại khá nặng với tỷ lệ bệnh tại các điểm điều tra từ 2,5% đến 23,3%. Bệnh hại phổ biến và gây hại nặng ở vùng đất đồi gò (chuyên màu, xen canh với sắn, luân canh với ngô,..) với tỷ lệ trung bình là 21,6%; bệnh cũng khá nặng trên đất chuyên màu (luân canh với cây màu) với tỷ lệ bệnh trung bình là 12,3%; bệnh nhẹ hơn trên đất thịt nhẹ (luân canh với lúa nƣớc) với tỷ lệ bệnh trung bình là 2,7%. Môi trƣờng đặc hiệu TZCA phù hợp để phân lập và nhận biết vi khuẩn R. solanacearum với đặc trƣng khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng ngà, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt hồng. Do số lƣợng củ giống lạc trong tập đoàn mẫu giống lạc và con lai qua các thế hệ hạn chế, chỉ đủ cho thí nghiệm lây nhiễm một isolate vi khuẩn nên mặc dù cả 6 isolate thí nghiệm đều có độc tính, nhƣng đề tài chỉ chọn isolate vi khuẩn SS1 có độc tính để làm nguồn lây nhân tạo do isolate SS1 thuộc biovar 3 là biovar phổ biến nhất và isolate SS1 đƣợc thu thập tại Sóc Sơn, Hà Nội tiện lợi cho việc thu thập bổ sung nguồn bệnh để lây nhiễm bệnh nhân tạo. 60 3.2. Nghiên cứu biovar và đa dạng di truyền vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc Nghiên cứu, xác định biovar, nòi của vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc là một trong những nội dung quan trọng, là cơ sở khoa học để bố trí giống kháng bệnh trong quản lý hiệu quả bệnh HXVK. 3.2.1. Xác định biovar, nòi một số isolate vi khuẩn R. solanacearum Từ các mẫu bệnh héo xanh trên cây lạc đã thu thập đƣợc tiến hành phân lập và thử các phản ứng ôxy hóa 6 nguồn các bon khác nhau để xác định các biovar theo phƣơng pháp mô tả của Hayward (1964) (với ba loại đƣờng: lactose, maltose, cellobiose và ba loại rƣợu: sorbitol, manitol, dulcitol). Kết quả phản ứng đƣợc thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012-2013) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ký hiệu Nơi thu mẫu HT1*(HT3) Hà Tĩnh HT4 HT5 HT6 HT8 HT9 NA1 NA2 NA3 NA4 NA7 TH1 TH2 TH3 TH4 NQ1 NQ2 NQ3 Hà Tĩnh Hà Tĩnh Hà Tĩnh Hà Tĩnh Hà Tĩnh Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Thanh Hóa Thanh Hóa Thanh Hóa Thanh Hóa Nho Quan, NB Nho Quan, NB Nho Quan, NB Phản ứng với đƣờng đôi Lac Mal Cel tose tose lobiose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Phản ứng với rƣợu 6 các bon Sorbi Mani Dulci tol tol tol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bio var 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 3 3 3 3 4 3 3 4 61 STT Ký hiệu Nơi thu mẫu 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 NQ4 NQ5 NQ6 LS1 LS2 LS3 YT3 YT5 BV1 BV2 BV3 ST1 ST2 ST3 CĐ1 CĐ2 CĐ3 CĐ4 CM1 CM2 CM3 ĐFY1 ĐFY2 ĐFY3 ĐFY4 PC1 PC2 PC3 SS1 SS2 SS3 BN1 BN2 BN3 BN4 BG1 BG2 Nho Quan, NB Nho Quan, NB Nho Quan, NB Lạc Sơn, HB Lạc Sơn, HB Lạc Sơn, HB Yên Thủy, HB Yên Thủy, HB Ba Vì, HN Ba Vì, HN Ba Vì, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Sơn Tây, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Chƣơng Mỹ, HN Sóc Sơn, HN Sóc Sơn, HN Sóc Sơn, HN Sóc Sơn, HN Sóc Sơn, HN Sóc Sơn, HN Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Giang Bắc Giang Phản ứng với đƣờng đôi Lac Mal Cel tose tose lobiose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Phản ứng với rƣợu 6 các bon Sorbi Mani Dulci tol tol tol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bio var 4 4 3 3 3 3 4 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 3 3 3 4 4 3 3 3 3 3 4 3 4 3 62 STT Ký hiệu 56 57 58 59 60 61 BG3 BG4 VY1 VY2 VY3 VY4 Nơi thu mẫu Bắc Giang Bắc Giang Việt Yên, BG Việt Yên, BG Việt Yên, BG Việt Yên, BG Phản ứng với đƣờng đôi Lac Mal Cel tose tose lobiose + + + + + + + + + + + + + + + + + + Phản ứng với rƣợu 6 các bon Sorbi Mani Dulci tol tol tol + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bio var Ghi chú: *: số gốc là HT3 + có phản ứng; - không có phản ứng; HT: Hà Tĩnh; NA: Nghệ An; TH: Thanh Hóa; NQ: Nho Quan, Ninh Bình; LS: Lạc Sơn, Hòa Bình; YT: Yên Thủy, Hòa Bình; BV: Ba Vì, Hà Nội; ST: TX Sơn Tây, Hà Nội; CĐ: Cổ Đông, Sơn Tây, Hà Nội; CM: Thị trấn Chương Mỹ, Hà Nội; ĐFY: Đông Phương Yên, Chương Mỹ - Hà Nội; PC: Phú Cường, Sóc Sơn Hà Nội; SS: Thị Trấn Sóc Sơn, Hà Nội; BN: Bắc Ninh; BG: Bắc Giang; VY: Việt Yên, Bắc Giang. Hình 3.4. Xác định biovar các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 3 3 3 3 3 3 63 Kết quả xác định biovar của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thu thập và phân lập từ một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam cho thấy có 49 isolate phản ứng với cả 6 nguồn các bon (3 loại đƣờng gồm: lactose, maltose, cellobiose và 3 loại rƣợu gồm: sorbitol, manitol, dulcitol) nên thuộc biovar 3 (chiếm 80,3% số mẫu). Có 12 isolate chỉ phản ứng với 3 loại rƣợu gồm sorbitol, manitol, dulcitol mà không phản ứng với 3 loại đƣờng gồm: lactose, maltose, cellobiose nên thuộc biovar 4 (chiếm 19,7% số mẫu). Nhƣ vậy trong tổng số 61 isolate vi khuẩn phân tích, tỷ lệ biovar 3 phổ biến nhất (chiếm 80,3%). Theo Buddenhagen và Kelman (1964), He et al. (1983) vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở vùng đất thấp của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc nòi 1. Nòi 1 có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae) và một số cây họ đậu (Leguminoseae). Các tác giả Nguyễn Xuân Hồng và cs. (1997), Đỗ Tấn Dũng (1999), Nguyễn Thị Yến và cs. (2002) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. Nhƣ vậy so với kết quả xác định nòi và biovar nguồn vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam những năm 1997-1999, sau khoảng 15 năm đến nay biovar, nòi vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc vẫn không thay đổi thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1. 3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc thuộc các biovar khác nhau Để có cơ sở nhân nuôi nguồn vi khuẩn phục vụ đánh giá bệnh nhân tạo dòng, giống lạc, đề tài đã tiến hành thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố nhƣ môi trƣờng nuôi cấy, nhiệt độ và pH môi trƣờng đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc thuộc các biovar khác nhau nhƣ thế nào. Các isolate thuộc các biovar vi khuẩn R. solanacearum thí nghiệm bao gồm: biovar 3 (HT3, NA1, TH1, SS1), biovar 4 (BG1, LS1). 3.2.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp giúp vi khuẩn phát triển tốt, ít bị giảm độc tính. Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 64 trên môi trƣờng TZCA và SPA, ngoài việc quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc, đã theo dõi sự phát triển đƣờng kính khuẩn lạc của các biovar 3 và biovar 4 (bảng 3.5). Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) Đƣờng kính khuẩn lạc trên các môi trƣờng nuôi cấy (mm) Isolate vi 24 giờ Biovar khuẩn TZCA 48 giờ SPA TZCA 72 giờ SPA TZCA SPA HT3 3 1,77±0,07 1,89 0,07 4,84±0,17 4,95±0,10 6,52±0,07 6,78±0,10 NA1 3 1,77±0,05 1,87 0,07 4,83±0,07 4,94±0,11 6,54±0,11 6,77±0,09 TH1 3 1,78±0,10 1,86 0,07 4,84±0,11 4,94±0,07 6,52±0,10 6,78±0,16 SS1 3 1,76±0,10 1,88 0,01 4,83±0,13 4,93±0,11 6,52±0,07 6,77±0,05 BG1 4 1,76±0,07 1,87 0,09 4,82±0,09 4,95±0,07 6,52±0,14 6,78±0,11 LS1 4 1,78±0,10 1,86 0,05 4,83±0,10 4,96±0,10 6,53±0,09 6,79±0,09 Đƣờng kính trung bình của biovar 3 Đƣờng kính trung bình của biovar 4 1,77 1,88 4,84 4,94 6,53 6,78 1,77 1,87 4,83 4,96 6,53 6,79 Kết quả cho thấy, khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum biovar 3 và biovar 4 đều phát triển tốt trên môi trƣờng TZCA và SPA. Sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn là khác nhau đƣợc quyết định bởi hệ men của vi khuẩn R. solanacearum trên môi trƣờng nuôi cấy. Đƣờng kính khuẩn lạc tăng trong thời gian từ 24 giờ đến 72 giờ nuôi cấy. Ở thời điểm 24 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng TZCA, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều đạt 1,77 mm; còn trên môi trƣờng SPA các chỉ số này lần lƣợt là 1,88 mm và 1,87 mm. Ở thời điểm 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng TZCA, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 là 4,84 mm và biovar 4 là 4,83 mm; còn trên môi trƣờng SPA, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều đạt 4,96 mm. Ở thời điểm 72 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng TZCA, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều đạt 6,53 mm; còn trên môi trƣờng SPA các chỉ số này lần lƣợt là 6,78 mm và 6,79 mm. 65 Nhƣ vậy, đƣờng kính của các khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum biovar 3 và biovar 4 cơ bản không có sự khác biệt ở cùng loại môi trƣờng, trong cùng thời gian nuôi cấy. Khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trƣờng SPA ở trong cùng thời gian nuôi cấy có đƣờng kính lớn hơn trên môi trƣờng TZCA. Do vậy, môi trƣờng SPA thích hợp dùng cho nhân sinh khối vi khuẩn. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ là một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến sự phân bố, phát sinh, phát triển, gây hại của vi khuẩn R. solanacearum hại lạc. Thí nghiệm 4 mức nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của vi khuẩn R. solanacearum trên môi trƣờng SPA (bảng 3.6). Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển khuẩn lạc của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trường SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) Isolate vi khuẩn Biovar Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) sau nuôi cấy 72 giờ 20oC 25oC 30oC 35oC HT3 3 4,88 0,09 6,21 0,20 6,57 0,09 5,62 0,07 NA1 3 4,87 0,07 6,22 0,07 6,56 0,02 5,64 0,12 TH1 3 4,88 0,07 6,22 0,11 6,57 0,07 5,63 0,09 SS1 3 4,87 0,07 6,23 0,11 6,57 0,12 5,63 0,11 BG1 4 4,88 0,07 6,22 0,13 6,58 0,11 5,62 0,05 LS1 4 4,89 0,09 6,23 0,04 6,56 0,05 5,63 0,07 4,88 6,22 6,57 5,63 4,89 6,23 6,57 5,63 Đƣờng kính trung bình của biovar 3 Đƣờng kính trung bình của biovar 4 Kết quả thí nghiệm cho thấy, đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum của các biovar 3 và biovar 4 đều phát triển từ mức nhiệt độ 20oC và đạt cao nhất ở mức nhiệt độ 30oC, tuy nhiên ở mức nhiệt độ 35oC thì lại giảm, cụ thể: Ở mức nhiệt độ 20oC, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của vi khuẩn R. solanacearum biovar 3 đạt 4,88 mm, còn chỉ số này của biovar 4 đạt 4,89mm. Mức nhiệt độ 25oC, đƣờng kính 66 khuẩn lạc trung bình của biovar 3 đạt 6,22 mm, còn chỉ số này của biovar 4 đạt 6,23 mm. Ở mức nhiệt độ 30oC, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều đạt mức cao nhất là 6,57mm. Tuy nhiên ở mức nhiệt độ 35 oC, đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều giảm xuống, chỉ còn đạt 5,63 mm. Nhƣ vậy, đƣờng kính của các khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum biovar 3 và biovar 4 cơ bản không có sự khác biệt ở cùng mức nhiệt độ. Mức nhiệt độ 30oC thích hợp nhất cho sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu và mô tả của Kelman (1954), Hayward (1994). 3.2.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Thí nghiệm tìm hiểu ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum hại lạc đƣợc tiến hành ở các mức pH khác nhau từ 6,5 đến 8,0 (bảng 3.7). Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc trên môi trường SPA (Viện Bảo vệ thực vật, năm 2012) Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) sau nuôi cấy 72 giờ Isolate vi Biovar pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 khuẩn HT3 3 5,67 0,04 6,67 0,07 7,02 0,05 6,88 0,05 5,43 0,13 NA1 3 5,68 0,11 6,67 0,10 7,00 0,07 6,89 0,07 5,42 0,09 TH1 3 5,65 0,11 6,67 0,05 7,01 0,15 6,88 0,09 5,43 0,07 SS1 3 5,66 0,07 6,67 0,07 7,01 0,05 6,88 0,09 5,43 0,07 BG1 4 5,66 0,07 6,68 0,07 7,01 0,12 6,88 0,11 5,43 0,10 LS1 4 5,65 0,05 6,66 0,14 7,00 0,10 6,87 0,09 5,44 0,09 Đƣờng kính trung bình của biovar 3 Đƣờng kính trung bình của biovar 4 5,67 6,67 7,01 6,88 5,43 5,66 6,67 7,01 6,88 5,44 67 Kết quả thí nghiệm cho thấy, đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum của các biovar 3 và biovar 4 đều phát triển từ mức pH 6,0 đến mức pH 7,0 và giảm dần từ mức pH 7,5 đến mức pH 8,0. Ở mức pH 6,0 đƣờng kính khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum trung bình của biovar 3 và biovar 4 lần lƣợt đạt 5,67 mm và 5,66 mm. Mức pH 6,5 đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều tăng và đạt 6,67 mm. Ở mức pH 7,0 đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đạt mức cao nhất là cùng 7,01 mm. Tuy nhiên ở mức pH 7,5 đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của biovar 3 và biovar 4 đều giảm xuống cùng đạt 6,88 mm và tiếp tục giảm ở mức pH 8,0 đƣờng kính khuẩn lạc trung bình của vi khuẩn R. solanacearum biovar 3 và biovar 4 thấp nhất chỉ còn đạt lần lƣợt là 5,43 mm và 5,44 mm. Kết quả cho thấy đƣờng kính của khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum các biovar 3 và biovar 4 cơ bản không có sự khác biệt ở cùng mức pH. Nhƣ vậy mức pH 7,0 thích hợp nhất cho sự phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc. 3.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum bằng phân tích ADN 3.2.3.1. Kết quả tách chiết ADN vi khuẩn R. solanacearum Từ nguồn vật liệu 61 isolate vi khuẩn đã tách chiết ADN thành công 56 mẫu đƣa vào nghiên cứu (ADN 5 isolate tách chiết không đạt yêu cầu). ADN tách chiết đƣợc có vạch băng đậm, rõ nét, không bị tạp nhiễm hay gẫy đứt đoạn, do đó đủ tiêu chuẩn cho các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.5). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Hình 3.5. Kết quả tách chiết ADN một số isolate vi khuẩn R. solanacearum 68 3.2.3.2. Kết quả phân tích các isolate vi khuẩn với các mồi RAPD Sản phẩm PCR với 10 mồi RAPD của các isolate vi khuẩn R. solanacearum đƣợc thể hiện trên bảng 3.8, hình 3.6 và hình 3.7. Bảng 3.8. Mức độ đa hình của 10 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân tích với các isolate vi khuẩn R. solanacearum (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) STT Tên mồi Số phân đoạn ADN đƣợc nhân bản 1 OPAB5 17 2 OPAL8 17 3 OPAK14 22 4 OPB7 15 5 OPC2 16 6 OPC15 8 7 OPE17 30 8 OPE18 11 9 OPE19 23 10 OPE20 17 Sản phẩm PCR-RAPD khi phân tích với 10 mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di trên gel polyacrylamide để phân tích đa hình ADN của 56 isolate vi khuẩn nghiên cứu. Số phân đoạn ADN nhân bản dao động từ 8 đến 30 phân đoạn, tổng số phân đoạn ADN nhân bản đƣợc là 176. Trong số 10 mồi phân tích, số phân đoạn ADN nhân bản đƣợc với mồi OPE17 nhiều nhất (30 phân đoạn) và ít nhất là mồi OPC15 (8 phân đoạn). Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy tất cả 10 mồi nghiên cứu đều cho đa hình. Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi so sánh giữa các isolate với nhau trong cùng một mồi. 69 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPB7 (M: thang ADN chuẩn 1kb, Fermentas, giếng 1 - 56 : 56 isolate vi khuẩn nghiên cứu) Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum với mồi OPC2 (M: thang ADN chuẩn 1kb, Fermentas, giếng 1 - 56 : 56 isolate vi khuẩn nghiên cứu) Nhƣ vậy sản phẩm PCR-RAPD khi phân tích với 10 mồi RAPD ngẫu nhiên đƣợc điện di trên gel agarose để phân tích đa hình ADN của 56 isolate vi khuẩn có mức đa hình khá cao. 3.2.3.3. Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn R. solanacearum Dựa trên kết quả phân tích của 10 mồi nghiên cứu với 56 isolate vi khuẩn, đã xây dựng đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 56 isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc (hình 3.8). Hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất đƣợc ghi nhận giữa (isolate CM2 và isolate CM3) và (isolate BG4 và isolate VY2). Biểu đồ quan hệ di truyền cho thấy, hệ số tƣơng đồng của 56 isolate vi khuẩn dao động từ 0,740 đến 0,990 và 56 isolate vi khuẩn đƣợc chia thành 2 nhóm chính. 70 Nhóm vi khuẩn HT3 HT4 NA2 NA4 NQ2 LS1 LS3 HT5 HT6 HT8 BV1 DFY3 CD1 CD2 CD3 CD4 NA1 NA3 NA7 TH1 TH2 TH3 CM1 CM2 CM3 DFY2 DFY4 SS3 BV3 BG1 BG3 BG4 VY2 VY3 VY1 VY4 TH4 BN3 ST1 ST2 ST3 BN1 BN4 BN2 NQ6 LS2 YT3 YT5 BV2 NQ1 NQ3 NQ4 NQ5 PC1 PC2 SS2 0.74 0.80 0.86 Coefficient 0.93 Nhóm II.10 Nhóm II.9 Nhóm II.8 Nhóm II.7 Nhóm II.6 Nhóm II.5 Nhóm II.4 Nhóm II.3 Nhóm II.2 Nhóm II.1 Nhóm I 0.99 Hình 3.8. Quan hệ di truyền giữa các isolate vi khuẩn héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2012) 71 Nhóm I gồm 3 isolate: PC1, PC2 và SS2. Hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất trong nhóm là 0,955 (giữa isolate PC1 và PC2). Nhóm II gồm 53 isolate vi khuẩn còn lại và đƣợc chia thành 10 nhóm phụ: Nhóm II.1 gồm 4 isolate: NQ1, NQ3, NQ4 và NQ5. Isolate NQ1 và NQ3 có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất trong nhóm là 0,887. Nhóm II.2 gồm 5 isolate: NQ6, LS2, YT3, YT5 và BV2. Trong đó isolate BV2 phân thành một nhánh riêng biệt. Nhóm II.3 gồm 8 isolate: TH4, BN3, ST1, ST2, ST3, BN1, BN4 và BN2. Hệ số tƣơng đồng di truyền trong nhóm dao động từ 0,846 (giữa isolate TH4 và BN3) đến 0,946 (giữa isolate ST2 và ST3). Nhóm II.4 bao gồm 8 isolate: BV3, BG1, BG3, BG4, VY2, VY3, VY1 và VY4. Trong đó hai isolate BG4 và VY2 có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất trong nhóm là 0,990. Kết quả ghi nhận isolate BV3 phân thành một nhánh riêng biệt so với các isolate còn lại. Nhóm II.5 gồm 6 isolate: CM1, CM2, CM3, ĐFY2, ĐFY4 và SS3. Hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất trong nhóm là 0,990 (giữa isolate CM2 và CM3). Nhóm II.6 gồm 6 isolate: NA1, NA3, NA7, TH1, TH2 và TH3. Hệ số tƣơng đồng di truyền trong nhóm dao động từ 0,927 (giữa isolate TH1 và TH2) đến 0,935 (giữa isolate NA1 và NA3). Nhóm II.7 gồm 4 isolate: CĐ1, CĐ2, CĐ3 và CĐ4. Trong đó hai isolate CĐ1 và CĐ2 có hệ số tƣơng đồng cao nhất trong nhóm là 0,964 còn hai isolate CĐ3 và CĐ4 có hệ số tƣơng đồng di truyền trong nhóm là 0,899. Nhóm II.8 gồm 2 isolate BV1 và ĐFY3 có hệ số tƣơng đồng di truyền là 0,851. Đây cũng là nhóm có số isolate ít nhất trong các nhóm. Nhóm II.9 gồm 3 isolate HT5, HT6 và HT8. Nhóm II.10 bao gồm 7 isolate còn lại là: HT3, HT4, NA2, NA4, NQ2, LS1 và LS3. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các isolate trong nhóm dao động từ 0,869 (giữa isolate LS1 và LS3) đến 0,934 (giữa isolate HT3 và HT4). 72 Kết quả phân tích 56 isolate vi khuẩn với 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy tƣơng đồng di truyền giữa chúng khá cao. Xét về mặt địa lý thấy rằng những isolate đƣợc phân lập ở cùng một địa phƣơng hoặc từ những vùng lân cận nhau thƣờng nằm cùng một phân nhóm gần nhau và có mối quan hệ di truyền gần, thậm chí có thể cùng xuất xứ từ một isolate (tƣơng đồng di truyền tới 99%) nhƣ isolate CM2 và CM3 (Chƣơng Mỹ, Hà Nội), isolate BG4 và VY2 (Bắc Giang). Tuy nhiên, cũng có những isolate không cùng đƣợc phân lập tại một vùng địa lý nhƣng lại thuộc cùng 1 nhóm nhƣ isolate NQ6 (Nho Quan, Ninh Bình), isolate LS2 (Lạc Sơn, Hòa Bình) với các isolate YT3, YT5 (Yên Thủy, Hòa Bình), BV2 (Ba Vì, Hà Nội). Điều này chứng tỏ các isolate vi khuẩn R. solanacearum có quan hệ khá gần và một số isolate vi khuẩn phân bố ở các vùng địa lý khác nhau nhƣng cũng gần nhau về mặt di truyền. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của thí nghiệm này cũng phù hợp với các kết quả đã công bố trƣớc đây. Theo nghiên cứu của Đinh Thị Phòng và cs. (2008) khi đánh giá đa dạng di truyền ADN của 6 isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc R. solanacearum Smith đƣợc thu thập từ các địa phƣơng: Hòa Bình, Hà Tây (cũ), Hải Dƣơng với 20 mồi RAPD thì độ tƣơng đồng di truyền giữa các isolate vi khuẩn từ 0,710 đến 0,980. Mức tƣơng đồng di truyền của 44 isolate vi khuẩn R. solanacearum thuộc nòi 1 biovar 3 khi đánh giá với 30 mồi RAPD là 70%. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc tại các địa phƣơng khác nhau ở Việt Nam là cơ sở để đƣa ra các biện pháp phòng chống thích hợp. 3.2.4. Sự phân bố các biovar và đa dạng di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam 3.2.4.1. Sự phân bố của biovar một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam Kết quả phân tích phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam đƣợc thể hiện qua bảng 3.9. 73 Bảng 3.9. Phân bố biovar vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) STT Tỉnh Biovar 3 Số lƣợng isolate Số lƣợng Tỷ lệ (%) Biovar 4 Số lƣợng Tỷ lệ (%) 1 Hà Tĩnh 6 6 100 0 0,0 2 Nghệ An 5 4 80,0 1 20,0 3 Thanh Hóa 4 3 75,0 1 25,0 4 Ninh Bình 6 3 50,0 3 50,0 5 Hòa Bình 5 4 80,0 1 20,0 6 Hà Nội 23 19 82,6 4 17,4 7 Bắc Ninh 4 3 75,0 1 25,0 8 Bắc Giang 8 7 87,5 1 12,5 Tổng số 61 49 80,3 12 19,7 Qua bảng cho thấy: Biovar 3 của vi khuẩn R. solanacearum phân bố với tỷ lệ cao nhất ở Hà Tĩnh (100%), tiếp đến là Bắc Giang (87,5%), Hà Nội (82,6%), Nghệ An và Hòa Bình (cùng 80,0%), Thanh Hóa và Bắc Ninh (cùng 75,0%), thấp nhất là ở Ninh Bình (50,0%). Còn biovar 4 phân bố nhiều nhất ở Ninh Bình (50,0%), tiếp đến là Thanh Hóa và Bắc Ninh (cùng 25,0%), Hòa Bình và Nghệ An (cùng 20,0%), Hà Nội (17,4%) và Bắc Giang (12,5%). Nguồn vi khuẩn R. solanacearum ở Hà Tĩnh phân lập đƣợc chỉ có biovar 3 (chiếm 100%), không có biovar 4, còn lại các địa phƣơng khác đều có cả biovar 3 và biovar 4. 3.2.4.2. Sự phân bố nhóm di truyền một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam Phân bố nhóm di truyền của một số isolate vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam đƣợc thể hiện trên bảng 3.10. 74 Bảng 3.10. Phân bố của các nhóm vi khuẩn R. solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) Tên Số Tỷ lệ nhóm isolate (%) 1 I 3 5,4 PC1, PC2 và SS2. 2 II.1 4 7,1 NQ1, NQ3, NQ4 và NQ5. 3 II.2 5 8,9 NQ6, LS2, YT3, YT5 và BV2. 4 II.3 8 14,3 TH4, ST1, ST2, ST3, BN1, BN2, BN3, BN4. 5 II.4 8 14,3 BV3, BG1, BG3, BG4, VY1, VY2, VY3, VY4. 6 II.5 6 10,7 CM1, CM2, CM3, ĐFY2, ĐFY4 và SS3. 7 II.6 6 10,7 NA1, NA3, NA7, TH1, TH2 và TH3. 8 II.7 4 7,1 CĐ1, CĐ2, CĐ3 và CĐ4. 9 II.8 2 3,6 BV1 và ĐFY3. 10 II.9 3 5,4 HT5, HT6 và HT8. 11 II.10 7 12,5 HT3, HT4, NA2, NA4, NQ2, LS1 và LS3. Tổng cộng 56 100 STT Tên isolate Ghi chú: HT: Hà Tĩnh; NA: Nghệ An; TH: Thanh Hóa; NQ: Nho Quan, Ninh Bình; LS: Lạc Sơn, Hòa Bình; YT: Yên Thủy, Hòa Bình; BV: Ba Vì, Hà Nội; ST: TX Sơn Tây, Hà Nội; CĐ: Cổ Đông, Sơn Tây, Hà Nội; CM: Thị trấn Chương Mỹ, Hà Nội; ĐFY: Đông Phương Yên, Chương Mỹ - Hà Nội; PC: Phú Cường, Sóc Sơn - Hà Nội; SS: Thị Trấn Sóc Sơn, Hà Nội; BN: Bắc Ninh; BG: Bắc Giang; VY: Việt Yên, Bắc Giang. Kết quả cho thấy nhóm đa dạng di truyền nhóm II có 53/56 isolate vi khuẩn (chiếm 94,6%), trong khi nhóm I chỉ có 03/56 isolate vi khuẩn (chiếm 5,4%). Nhóm II phân thành 10 nhóm phụ (từ II.1 đến II.10), trong đó nhóm phụ II.3 và II.4 nhiều nhất đều có 08/56 isolate vi khuẩn (chiếm 14,3%). Số nhóm phụ có isolate vi khuẩn chiếm tỷ lệ trung bình là II.5 (chiếm 10,7%), II.6 (chiếm 10,7%), II.10 (chiếm 12,5%); các nhóm phụ có tỷ lệ thấp hơn là II.8 (chiếm 3,6%), II.9 (chiếm 5,4%), II.1 và II.7 (cùng chiếm 7,1%), II.2 (chiếm 8,9%). Dựa các kết quả trên, đề tài đã tiến hành phân nhóm đa dạng của biovar các isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc theo các vùng thu thập (bảng 3.11). 75 Bảng 3.11. Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam (năm 2012) Nơi thu mẫu Nhóm đa dạng STT Ký hiệu 1 HT3 Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh 3 II.10 2 HT4 Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh 3 II.10 3 HT5 Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh 3 II.9 4 HT6 Hà Tĩnh 3 II.9 5 HT8 Hà Tĩnh 3 II.9 6 NA1 Nghi Lộc, Nghệ An 3 II.6 7 NA2 Nghi Lộc, Nghệ An 3 II.10 8 NA3 Nghi Lộc, Nghệ An 3 II.6 9 NA4 Hƣng Nguyên, Nghệ An 4 II.10 10 NA7 Hƣng Nguyên, Nghệ An 3 II.6 11 TH1 Thanh Hóa 3 II.6 12 TH2 Thanh Hóa 3 II.6 13 TH3 Thanh Hóa 3 II.6 14 TH4 Thanh Hóa 4 II.3 15 NQ1 Nho Quan, Ninh Bình 3 II.1 16 NQ2 Nho Quan, Ninh Bình 3 II.10 17 NQ3 Nho Quan, Ninh Bình 4 II.1 18 NQ4 Nho Quan, Ninh Bình 4 II.1 19 NQ5 Nho Quan, Ninh Bình 4 II.1 20 NQ6 Nho Quan, Ninh Bình 3 II.2 21 LS1 Lạc Sơn, Hòa Bình 3 II.10 22 LS2 Lạc Sơn, Hòa Bình 3 II.2 23 LS3 Lạc Sơn, Hòa Bình 3 II.10 24 YT3 Yên Thủy, Hòa Bình 4 II.2 25 YT5 Yên Thủy, Hòa Bình 3 II.2 26 BV1 Ba Vì, Hà Nội 3 II.8 27 BV2 Ba Vì, Hà Nội 3 II.2 28 BV3 Ba Vì, Hà Nội 3 II.4 29 ST1 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.3 Biovar di truyền 76 Nơi thu mẫu Nhóm đa dạng STT Ký hiệu 30 ST2 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.3 31 ST3 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.3 32 CĐ1 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.7 33 CĐ2 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.7 34 CĐ3 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.7 35 CĐ4 Sơn Tây, Hà Nội 3 II.7 36 CM1 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 3 II.5 37 CM2 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 3 II.5 38 CM3 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 3 II.5 39 ĐFY2 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 4 II.5 40 ĐFY3 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 3 II.8 41 ĐFY4 Chƣơng Mỹ, Hà Nội 3 II.5 42 PC1 Sóc Sơn, Hà Nội 3 I 43 PC2 Sóc Sơn, Hà Nội 4 I 44 SS2 Sóc Sơn, Hà Nội 3 I 45 SS3 Sóc Sơn, Hà Nội 3 II.5 46 BN1 Bắc Ninh 3 II.3 47 BN2 Bắc Ninh 3 II.3 48 BN3 Bắc Ninh 4 II.3 49 BN4 Bắc Ninh 3 II.3 50 BG1 Bắc Giang 4 II.4 51 BG3 Bắc Giang 3 II.4 52 BG4 Bắc Giang 3 II.4 53 VY1 Việt Yên, Bắc Giang 3 II.4 54 VY2 Việt Yên, Bắc Giang 3 II.4 55 VY3 Việt Yên, Bắc Giang 3 II.4 56 VY4 Việt Yên, Bắc Giang 3 II.4 Biovar di truyền Ghi chú: HT: Hà Tĩnh; NA: Nghệ An; TH: Thanh Hóa; NQ: Nho Quan, Ninh Bình; LS: Lạc Sơn, Hòa Bình; YT: Yên Thủy, Hòa Bình; BV: Ba Vì, Hà Nội; ST: TX Sơn Tây, Hà Nội; CĐ: Cổ Đông, Sơn Tây, Hà Nội; CM: Thị trấn Chương Mỹ, Hà Nội; ĐFY: Đông Phương Yên, Chương Mỹ - Hà Nội; PC: Phú Cường, Sóc Sơn - Hà Nội; SS: Thị Trấn Sóc Sơn, Hà Nội; BN: Bắc Ninh; BG: Bắc Giang; VY: Việt Yên, Bắc Giang. Các isolate: HT9, SS1, BG2 (biovar 3), ĐPY1, PC3 (biovar 4) không đạt. 77 Kết quả trên cho thấy có mối liên hệ giữa các biovar và nhóm di truyền qua phân tích RAPD. Trong 56 isolate vi khuẩn phân tích, các biovar của vi khuẩn R. solanacearum phân bố khác nhau ở các địa phƣơng. Biovar 3 của vi khuẩn R. solanacearum phân bố với tỷ lệ cao nhất ở Hà Tĩnh, Bắc Giang, Hà Nội và Nghệ An, Hòa Bình (80,0% đến 100%), các tỉnh khác từ 50,0%-75,0%. Biovar 4 phân bố nhiều nhất ở Ninh Bình (50,0%) và phân bố ở các tỉnh khác với tỷ lệ thấp (12,5% đến 25,0%). Địa phƣơng có 1 nhóm là Bắc Giang (II.4) và Bắc Ninh (II.3); địa phƣơng có 2 nhóm là Hà Tĩnh (II.9, II.10); Nghệ An (II.6, II.10); Thanh Hóa (II.3, II.6); Hòa Bình (II.2, II.10); địa phƣơng có 3 nhóm là Ninh Bình (II.1, II.2 và II.10) và Hà Nội có 7 nhóm (I, II.2, II.3, II.4, II.5, II.7 và II.8). Hà Tĩnh là địa phƣơng duy nhất vi khuẩn R. solanacearum chỉ có biovar 3, không có biovar 4, còn lại các địa phƣơng khác có cả biovar 3 và biovar 4. Nhƣ vậy nếu xem xét mối liên hệ giữa các biovar và nhóm di truyền cho thấy có mối liên hệ tƣơng đồng giữa các biovar và nhóm di truyền qua phân tích RAPD. Trong số 56 isolate, biovar vi khuẩn R. solanacearum khá đa dạng ở Hà Nội (có cả biovar 3, biovar 4 và 7 nhóm phụ về đa dạng di truyền). Các isolate thể hiện sự đa dạng ở mức trung bình tại Ninh Bình (có 2 loại biovar 3 và biovar 4 và có 3 nhóm phụ về đa dạng di truyền) và tại các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hòa Bình (có 2 loại biovar 3, biovar 4 và có 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền); Bắc Ninh, Bắc Giang có 2 loại biovar 3 và biovar 4, nhƣng chỉ có 1 nhóm phụ về đa dạng di truyền. Trong 56 isolate vi khuẩn, Hà Tĩnh là địa phƣơng vi khuẩn R. solanacearum ít đa dạng hơn (chỉ có 1 loại biovar 3 và có 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền). Tổng hợp kết quả nghiên cứu biovar, nòi và đa dạng di truyền thấy rằng 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum phân lập từ cây lạc bị bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam thuộc biovar 3 và biovar 4, trong đó có 80,3% isolate vi khuẩn thuộc biovar 3 và 19,7% isolate vi khuẩn thuộc biovar 4 và thuộc nòi 1. Sự ảnh hƣởng của một số yếu tố (môi trƣờng nuôi cấy, nhiệt độ, pH) đến phát triển khuẩn lạc của isolate vi khuẩn không có sự khác biệt giữa 2 biovar 3 và biovar 4. Bằng phân tích RAPD, 56 isolate vi khuẩn đƣợc chia thành 2 nhóm chính. Nhóm I gồm 3 isolate (PC1, PC2 và SS2) chiếm 5,4% và nhóm II gồm 53 isolate vi 78 khuẩn với 10 nhóm phụ khác nhau chiếm 94,6% với hệ số tƣơng đồng dao động từ 0,740 đến 0,990. Nhƣ vậy, các isolate vi khuẩn R. solanacearum có quan hệ khá gần nhau về mặt di truyền, đặc biệt, các isolate vi khuẩn trong cùng một vùng ở quy mô tỉnh (Thanh Hoá, Nghệ An và Bắc Giang) lại có quan hệ di truyền rất gần nhau (tƣơng đồng di truyền tới 100%). Trong 56 isolate, vi khuẩn R. solanacearum khá đa dạng ở Hà Nội (có cả biovar 3, biovar 4 và 7 nhóm phụ về đa dạng di truyền); tiếp theo là Ninh Bình (có cả biovar 3, biovar 4 và 3 nhóm phụ về đa dạng di truyền); đa dạng ở mức trung bình tại Nghệ An, Thanh Hóa, Hòa Bình (có cả biovar 3, biovar 4 và có 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền); các tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang (có cả biovar 3, biovar 4 nhƣng chỉ có 1 nhóm phụ về đa dạng di truyền). Riêng tỉnh Hà Tĩnh (chỉ có biovar 3 và có 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền mà không có biovar 4). 3.3. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc, dòng lai và dòng triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng, giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc mẫu giống kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.1.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo Do số lƣợng củ giống lạc trong tập đoàn mẫu giống lạc hạn chế, chỉ đủ cho thí nghiệm lây nhiễm một isolate vi khuẩn nên đề tài chỉ chọn isolate vi khuẩn SS1 có độc tính, thuộc biovar 3 là biovar phổ biến nhất trong số 61 isolate vi khuẩn phân tích để làm nguồn lây nhân tạo đánh giá khả năng chống chịu của các mẫu giống lạc. Nguồn vi khuẩn đƣợc nhân trên môi trƣờng SPA và lây nhiễm nhân tạo kết hợp bổ sung dịch vi khuẩn từ nguồn bệnh thu thập ở Sóc Sơn, Hà Nội trên tập đoàn mẫu giống lạc nhằm chọn các mẫu giống lạc có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Kết quả cho thấy giống đối chứng nhiễm bệnh (ICGV3704) có tỷ lệ cây chết cao nhất, trong khi giống đối chứng kháng bệnh (Gié Nho Quan) hầu nhƣ không có cây bị bệnh (bảng 3.12 và hình 3.9). 79 Bảng 3.12. Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK của tập đoàn mẫu giống lạc (Thanh Trì, năm 2012 - 2013) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Tên mẫu giống ICGV00351 L18 O506.2 O713.24.1 ICGV6022 BW62 LO5 L19 CG 38 Sen lai L17 ICGV01239 O401.57.1 L15 Dòng lai 14 ICGV98370 L21 T38 TD 207 9805.7.1 L08 ICGV 970019 ICGV01232 ICGV01238 ICGV89104 L12 ICGV92118 O909.1 ICG 11515 L16 VAG36 Năm 2012 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu bệnh HXVK (%) 55,2 S 48,0 MS 40,0 MS 9,1 HR 24,6 MR 28,6 MR 60,0 S 35,7 MS 26,9 MR 33,3 MS 22,2 MR 20,7 MR 25,9 MR 39,4 MS 28,3 MR 93,3 HS 34,3 MS 30,4 MS 36,4 MS 60,0 S 47,1 MS 56,7 S 29,0 MR 27,8 MR 91,3 HS 60,7 S 70,4 S 70,0 S 60,7 S 24,3 MR 31,0 MS Năm 2013 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 62,5 S 36,2 MS 42,1 MS 8,6 HR 26,7 MR 25,2 MR 72,1 S 42,6 MS 22,8 MR 38,4 MS 25,3 MR 23,6 MR 22,7 MR 42,1 MS 21,8 MR 100 HS 45,3 MS 35,0 MS 41,7 MS 65,3 S 42,6 MS 65,1 S 24,6 MR 26,5 MR 100 HS 70,5 S 81,1 S 76,3 S 58,8 S 22,4 MR 41,2 MS 80 STT 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 Tên mẫu giống Dòng lai 2 O816.7 L22 L26 O401.65.1 VAG 03.2 ICGV01241 Sen thắt BW79.4 L23 MDRF5.176 ICG 5051 L14 BW15 Dòng lai 1 ICG 4911 O702.3 BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 Gié Nho Quan ICGV3704 Năm 2012 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu bệnh HXVK (%) 25,0 MR 30,8 MS 34,5 MS 47,6 MS 46,2 MS 19,3 R 26,7 MR 61,5 S 45,6 MS 31,3 MS 65,5 S 28,6 MR 50,0 MS 10,0 HR 30,6 MS 40,0 MS 21,1 MR MR 27,5 R 18,5 28,8 MR R 18,5 26,5 MR R 17,5 R 18,5 25,1 MR MR 28,2 29,2 MR R 15,5 MR 25,8 23,0 MR 10,1 R 90,5 HS Năm 2013 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 27,1 MR 32,6 MS 38,5 MS 41,2 MS 43,6 MS 16,1 R 23,7 MR 65,8 S 48,3 MS 45,2 MS 75,1 S 21,8 MR 45,6 MS 9,1 HR 38,2 MS 45,6 MS 28,7 MR MR 22,5 R 16,8 25,1 MR R 16,8 25,8 MR R 12,5 R 15,3 25,8 MR MR 22,7 24,3 MR R 18,6 MR 25,4 26,5 MR 12,4 R 100 HS Ghi chú: HR: Kháng cao; R: Kháng; MR: Kháng trung bình; MS: Nhiễm trung bình; S: Nhiễm; HS: Nhiễm nặng. 81 Kết quả bảng 3.12 cho thấy, có 02/63 mẫu giống (O713.24.1, BW15) có mức kháng cao (chiếm 3,2%); có 07/63 mẫu giống (VAG 03.2, Gié Nho Quan, BWP-2, BWP-4, BWP-6, BWP-7, BWP-11) có mức kháng (chiếm 11,1%); có 22/63 mẫu giống có mức kháng trung bình (chiếm 34,9%); có 19/63 mẫu giống có mức nhiễm trung bình (chiếm 30,1%); có 10/63 mẫu giống có mức nhiễm (chiếm 15,9%) và có 03/63 mẫu giống (ICGV3704-chuẩn nhiễm, ICGV89104, ICGV98370) có mức nhiễm nặng (chiếm 4,8%). Đây là cơ sở để chọn các mẫu giống có khả năng kháng bệnh làm vật liệu nhằm chọn tạo các giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn phục vụ cho sản xuất. A B Hình 3.9. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc bằng lây nhân tạo (năm 2013) (A: sau lây 30 ngày; B: sau lây 45 ngày) 3.3.1.2. Đánh giá tập đoàn mẫu giống lạc có tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử Kế thừa kết quả đề tài cấp Nhà nƣớc "Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng kỹ thuật chỉ thị ADN", đã sử dụng đƣợc 3 chỉ thị phân tử SSR gồm pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, có độ tin cậy cao để phân tích, chọn lọc mẫu giống lạc mang gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Hai giống lạc gồm Gié Nho Quan và BW15 thể hiện mức kháng bệnh héo xanh vi khuẩn cao khi lây nhiễm nhân tạo đƣợc sử dụng làm giống đối chứng kháng bệnh. Giống ICGV3704 có mức nhiễm bệnh cao trong lây nhiễm bệnh nhân tạo đƣợc sử dụng làm đối chứng nhiễm bệnh. Kết quả phân tích đƣợc thể hiện qua bảng 3.13 và các hình 3.10, hình 3.11 và hình 3.12. a. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử pPGPseq3F5 chọn lọc các mẫu giống lạc trong tập đoàn có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Kết quả trên hình 3.10 ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 82 pPGPseq3F5 ở kích thƣớc 219 bp, tƣơng ứng với vệt băng của mẫu giống BW15 (số 45) có vệt băng tƣơng đƣơng nhƣ giống đối chứng kháng bệnh Gié Nho Quan, có khá nhiều mẫu giống cũng mang băng tƣơng tự nhƣ mẫu giống: L16 (số 30), VAG36 (số 31), Dòng lai 2 (số 32), O816.7 (số 33), L22 (số 34), VAG03.2 (số 37), ICGV01241 (số 38), L23 (số 41), ICG5051 (số 43), Dòng lai1 (số 46), O702.3 (số 48) và mẫu giống BWP-1 (số 49). Nhƣ vậy, các mẫu giống này có khả năng kháng bệnh HXVK. 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 M 300 bp Hình 3.10. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 25 mẫu giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên mẫu giống 25: ICGV 89104, 26: L12, 27: ICGV 92118, 28: O909.1, 29: ICG 11515, 30: L16, 31: VAG36, 32: Dòng lai 2, 33: O816.7, 34: L22, 35: L26, 36: O401.65.1, 37: VAG03.2, 38: ICGV01241, 39: Sen thắt, 40: BW79.4, 41: L23, 42: MDRF5.176, 43: ICG5051, 44: L14, 45: BW15, 46: Dòng lai1, 47: ICG4911, 48: O702.3, 49: BWP-1. b. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử GA161 chọn lọc các mẫu giống lạc trong tập đoàn có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 200 bp Hình 3.11. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR Chỉ thị GA161 với 25 mẫu giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên mẫu giống 26: L12, 27: ICGV 92118, 28: O909.1, 29: ICG 11515, 30: L16, 31: VAG36, 32: Dòng lai 2, 33: O816.7, 34: L22, 35: L26, 36: O401.65.1, 37: VAG03.2, 38: ICGV01241, 39: Sen thắt, 40: BW79.4, 41: L23, 42: MDRF5.176, 43: ICG5051, 44: L14, 45: BW15, 46: Dòng lai1, 47: ICG4911, 48: O702.3, 49: Gié Nho Quan, 50: ICGV3704. 83 Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với chỉ thị GA161 ở kích thƣớc 226 bp, trên hình 3.11 cho thấy tƣơng ứng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh Gié Nho Quan (số 49) có một số mẫu giống cũng mang băng tƣơng tự nhƣ mẫu giống: ICG 11515 (số 29), L16 (số 30), VAG36 (số 31), Dòng lai 2 (số 32), O816.7 (số 33), L22 (số 34), VAG03.2 (số 37), ICGV01241 (số 38), Sen thắt (số 39), L23 (số 41), ICG5051 (số 43), BW15 (số 45), Dòng lai1 (số 46) và mẫu giống O702.3 (số 48). Từ kết quả này xác định các mẫu giống này có khả năng kháng bệnh HXVK. c. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử 7G2 chọn lọc các mẫu giống lạc trong tập đoàn có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Từ hình 3.12 ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 ở kích thƣớc 386 bp, thấy rằng tƣơng ứng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh Gié Nho Quan (số 50) có một số mẫu giống cũng mang băng tƣơng tự nhƣ mẫu giống: L16 (số 30), VAG36 (số 31), Dòng lai 2 (số 32), O816.7 (số 33), L22 (số 34), VAG03.2 (số 37), ICGV01241 (số 38), L23 (số 41), ICG5051 (số 43), BW15 (số 45), Dòng lai1 (số 46) và mẫu giống O702.3 (số 48). Nhƣ vậy các mẫu giống này có khả năng kháng bệnh HXVK. M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 400 bp Hình 3.12. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 25 mẫu giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên mẫu giống 26: L12, 27: ICGV 92118, 28: O909.1,29: ICG 11515, 30: L16, 31: VAG36, 32: Dòng lai 2, 33: O816.7, 34: L22, 35: L26,36: O401.65.1, 37: VAG03.2, 38: ICGV01241, 39: Sen thắt, 40: BW79.4, 41: L23, 42: MDRF5.176, 43: ICG5051, 44: L14, 45: BW15, 46: Dòng lai1, 47: ICG4911, 48: O702.3, 49: ICGV3704, 50: Gié Nho Quan. d. Tổng hợp kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các mẫu giống lạc trong tập đoàn có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Tổng hợp kết quả ứng dụng 3 chỉ thị phân tử chọn lọc các mẫu giống lạc trong tập đoàn có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn thể hiện trên bảng 3.13. 84 Bảng 3.13. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK tập đoàn mẫu giống lạc (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2013) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Tên mẫu giống ICGV 00351 L18 O506.2 O713.24.1 ICGV6022 BW62 LO5 L19 CG 38 Sen lai L17 ICGV01239 O401.57.1 L15 Dòng lai 14 ICGV 98370 L21 T38 TD 207 9805.7.1 L08 ICGV 970019 ICGV01232 ICGV01238 ICGV 89104 L12 ICGV 92118 O909.1 ICG 11515 L16 VAG36 Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 Tổng số 0 0 0 3 3 3 0 3 3 3 3 3 3 3 3 0 3 3 3 0 0 0 3 3 0 0 0 0 1 3 3 85 STT 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 Tên mẫu giống Dòng lai 2 O816.7 L22 L26 O401.65.1 VAG 03.2 ICGV01241 Sen thắt BW79.4 L23 MDRF5.176 ICG 5051 L14 BW15 Dòng lai 1 ICG 4911 O702.3 BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 Gié Nho Quan ICGV3704 Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 Ghi chú: 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết. Tổng số 3 3 3 0 0 3 3 1 0 3 0 3 0 3 3 0 3 3 0 3 1 3 3 3 3 0 2 3 3 3 3 0 86 Qua bảng 3.13 cho thấy từ các ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR 3 chỉ thị pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 khi phân tích với hai chỉ thị pPGPseq3F5 và 7G2, tƣơng ứng với vệt băng của 2 giống đối chứng kháng bệnh (Gié Nho Quan và BW15) cùng có 39/63 mẫu giống cũng mang băng tƣơng tự (chiếm 61,9%); khi phân tích với chỉ thị GA161 có 41/63 mẫu giống cũng mang băng tƣơng tự (chiếm 65,1%). Trong số các mẫu giống đánh giá, có 38/63 mẫu giống mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với cả 3 chỉ thị nghiên cứu (chiếm 60,3%); có 01/63 mẫu giống (BWP-10) mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 2 chỉ thị (chiếm 1,6%); có 03/63 mẫu giống (ICG11515, Sen thắt và BWP-4) mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 1 trong 3 chỉ thị (chiếm 4,8%); còn lại 21/63 mẫu giống không mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị (chiếm 33,3%). Các mẫu giống có khả năng kháng bệnh thông qua mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu là nguồn vật liệu tốt để lai tạo chọn lọc giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.3.1.3. Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc Đề tài đã tiến hành đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của tập đoàn mẫu giống lạc vụ Xuân trong năm 2012 và năm 2013 để kết hợp với các đặc tính kháng bệnh trên cơ sở lây nhiễm bệnh nhân tạo và sử dụng chỉ thị liên kết với tính trạng héo xanh vi khuẩn chọn lọc các mẫu giống lạc vừa mang gen kháng vừa có năng suất cao để định hƣớng trong quá trình chọn tạo giống cho sản xuất. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.14. Kết quả cho thấy, các giống lạc có số quả chắc trên cây khá lớn. Số quả chắc/cây trung bình qua 2 năm dao động từ 8,0 quả/cây đến 13,1 quả/cây, cao nhất là mẫu giống BWP-12 (13,1 quả/cây), tiếp đến là các mẫu giống BWP-1, BWP-9, BWP-10 đều đạt 12,5 quả/cây, thấp nhất là mẫu giống ICG5051 có số quả trung bình 2 năm chỉ đạt 8,0 quả/cây. Trong các mẫu giống thí nghiệm có 31/63 mẫu giống có số quả chắc trung bình 2 năm đạt từ 10 quả/cây trở lên (chiếm 49,2%), trong đó có 9/63 mẫu giống có số quả chắc trung bình 2 năm đạt trên 11 quả/cây (chiếm 14,3%). Có 32/63 mẫu giống có số quả chắc trung bình 2 năm dƣới 10 quả/cây (chiếm 50,8%). 87 Bảng 3.14. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2012-2013) Số quả chắc/cây Tên mẫu STT (quả) giống Năm Năm 2012 2013 1 ICGV 00351 8,5 9,4 2 L18 9,7 8,9 3 O506.2 10,3 10,5 4 O713.24.1 9,0 9,7 5 ICGV6022 8,7 9,0 6 BW62 9,5 9,8 7 LO5 9,8 10,3 8 L19 10,6 10,4 9 CG 38 10,3 9,4 10 Sen lai 9,8 10,2 11 L17 9,8 9,1 12 ICGV01239 8,9 9,6 13 O401.57.1 10,5 10,2 14 L15 10,2 9,7 15 Dòng lai 14 10,0 10,6 16 ICGV 98370 8,7 8,6 17 L21 10,5 9,5 18 T38 10,1 10,8 19 TD 207 10,2 10,4 20 9805. 7. 1 8,5 9,2 21 L08 8,9 9,1 22 ICGV 970019 8,6 8,1 23 ICGV01232 9,2 9,7 24 ICGV01238 9,4 8,4 25 ICGV 89104 8,7 9,7 26 L12 10,1 10,6 27 ICGV 92118 8,6 9,5 28 O909.1 9,2 9,5 29 ICG 11515 8,3 9,1 30 L16 9,5 9,1 31 VAG36 9,2 9,8 Khối lƣợng Khối lƣợng Tỷ lệ Năng suất 100 quả 100 hạt hạt/quả thực thu (g) (g) (%) (tạ/ha) Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm 2012 2013 2012 2013 2012 2013 2012 2013 148,0 147,4 49,3 50,7 70,7 70,2 28,2 31,0 164,0 163,7 62,1 63,0 71,1 70,8 35,6 32,6 153,9 154,1 59,5 58,7 72,1 72,2 35,5 36,2 163,6 162,7 60,7 60,1 72,5 71,8 33,0 35,4 152,7 153,1 50,4 49,8 71,1 72,0 29,8 30,9 147,9 150,2 57,3 58,0 71,0 71,5 31,5 33,0 147,3 147,5 54,5 55,2 73,1 72,4 32,3 34,0 155,9 156,2 59,5 60,6 71,7 71,8 37,0 36,4 146,5 147,1 45,6 46,2 70,2 70,8 33,8 31,0 153,3 154,4 65,3 66,1 70,7 70,4 33,6 35,3 156,7 157,5 64,8 64,4 73,2 72,7 34,4 32,1 144,9 145,0 42,5 43,1 70,4 70,1 28,9 31,2 154,8 155,3 62,1 61,9 72,1 71,9 36,4 35,5 152,0 151,6 57,0 56,7 71,0 71,5 34,7 32,9 152,3 152,6 50,6 50,5 73,0 72,6 34,1 36,2 151,3 151,7 51,3 51,6 70,6 70,3 29,5 29,2 152,0 152,6 55,6 55,5 70,6 71,0 35,8 32,5 152,7 152,8 60,6 61,2 71,8 71,4 34,5 37,0 158,2 156,9 59,9 60,4 70,4 70,1 36,1 36,6 151,8 152,5 51,6 51,7 70,0 70,6 28,9 31,4 170,2 168,7 63,4 64,1 73,3 73,1 33,9 34,4 149,1 150,3 51,3 50,5 70,4 70,6 28,7 27,3 147,6 146,7 48,5 49,0 71,3 71,6 30,4 31,9 149,4 150,0 51,2 50,8 71,0 71,4 31,4 28,2 150,5 149,8 50,8 51,3 71,2 71,4 29,3 32,5 151,6 151,7 55,3 55,1 72,9 72,1 34,3 36,0 146,9 147,1 50,5 49,8 71,5 72,1 28,3 31,3 157,7 155,4 60,0 58,7 71,6 71,8 32,5 33,1 153,9 153,4 53,5 52,7 71,0 71,0 28,6 31,3 157,7 158,5 57,7 56,8 72,9 72,3 33,5 32,3 149,1 150,3 53,5 53,6 70,6 70,3 30,7 33,0 88 Số quả chắc/cây Tên mẫu STT (quả) giống Năm Năm 2012 2013 32 Dòng lai 2 9,5 8,7 33 O816.7 9,2 9,6 34 L22 10,8 10,2 35 L26 9,3 9,7 36 O401.65.1 9,8 10,1 37 VAG 03.2 10,1 10,7 38 ICGV01241 10,1 9,4 39 Sen thắt 9,8 10,3 40 BW79.4 10,2 9,7 41 L23 9,9 9,4 42 MDRF5. 176 10,5 10,7 43 ICG 5051 7,8 8,2 44 L14 8,8 9,5 45 BW15 10,3 10,6 46 Dòng lai 1 10,4 11,1 47 ICG 4911 8,4 9,0 48 O702.3 10,0 10,7 49 BWP-1 12,2 12,8 50 BWP-2 9,2 8,3 51 BWP-3 10,7 10,4 52 BWP-4 9,2 8,5 53 BWP-5 9,4 9,8 54 BWP-6 11,3 11,1 55 BWP-7 11,5 12,3 56 BWP-8 12,3 11,7 57 BWP-9 12,4 12,5 58 BWP-10 12,2 12,8 59 BWP-11 12,2 11,6 60 BWP-12 14,1 12,0 61 BWP-13 12,2 11,8 62 Gié Nho Quan 10,4 10,6 63 ICGV3704 8,8 9,3 CV% 6,4 6,2 LSD0,05 1,03 1,00 Khối lƣợng Khối lƣợng Tỷ lệ Năng suất 100 quả 100 hạt hạt/quả thực thu (g) (g) (%) (tạ/ha) Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm 2012 2013 2012 2013 2012 2013 2012 2013 149,6 150,0 50,3 49,6 71,1 71,2 31,8 29,2 145,6 146,1 59,3 60,6 70,6 70,5 30,0 31,4 151,3 152,3 59,8 60,2 71,0 70,5 36,4 34,8 168,5 167,2 65,6 66,0 73,0 72,5 35,1 36,3 159,0 158,6 60,0 60,6 71,2 71,6 34,9 35,9 147,8 148,2 50,5 51,0 71,5 72,0 33,4 35,5 151,9 152,4 56,6 55,9 70,4 70,5 34,4 32,1 148,0 147,8 51,3 52,4 70,1 70,0 32,5 34,1 148,0 150,2 63,7 64,5 72,1 71,8 33,8 32,6 154,0 155,2 53,6 54,0 71,4 71,8 34,2 32,7 155,0 155,5 45,0 45,5 70,2 70,0 36,4 37,3 154,5 155,0 50,3 51,1 72,0 71,8 27,0 28,5 154,2 154,9 57,8 57,3 71,2 71,6 30,4 33,0 154,2 155,3 62,5 62,6 70,5 70,6 35,6 36,9 152,0 152,5 58,7 57,7 70,7 70,4 35,4 37,9 147,7 146,5 50,3 50,0 71,0 71,7 27,8 29,5 156,9 157,5 61,1 62,5 70,6 71,0 35,1 37,7 154,3 154,7 60,6 61,2 71,0 71,2 38,2 39,4 152,8 153,2 60,3 59,8 70,2 70,6 35,3 34,5 153,0 153,6 57,9 58,1 74,0 73,5 34,1 32,7 122,0 123,4 46,8 45,5 70,3 70,5 30,1 31,6 137,3 138,1 54,4 55,6 71,2 71,6 36,2 36,8 144,7 143,9 58,8 59,3 74,6 73,8 34,6 34,3 167,7 166,5 65,0 66,1 73,0 72,7 36,1 37,3 156,1 157,2 60,2 60,8 74,4 74,2 35,3 34,8 151,2 152,1 60,1 61,0 75,2 75,0 35,0 35,6 159,4 150,5 63,0 62,9 70,7 71,2 35,6 36,2 155,0 154,8 60,4 60,7 72,2 72,3 38,2 37,6 152,2 153,0 58,6 59,2 71,8 71,5 38,2 35,5 167,3 166,1 65,6 64 73,3 72,9 35,4 35,1 88,4 87,8 50,5 51,1 70,7 70,5 20,6 20,8 138,6 137,9 46,3 47,0 71,7 71,4 27,3 28,7 4,6 5,0 6,1 5,8 5,6 6,0 11,17 12,13 5,52 5,13 2,97 3,24 89 Hình 3.13. Thí nghiệm tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013) Khối lƣợng 100 quả cao nhất là mẫu giống L08 trung bình 2 năm đạt 169,5g, tiếp đến là mẫu giống L26 đạt 167,9g và mẫu giống BWP-7 đạt 167,1g, thấp nhất là giống Gié Nho Quan chỉ đạt 88,1g. Có 42/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm đạt trên 150g (chiếm 66,7%), trong đó có 06/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm đạt trên 160g (chiếm 9,5%). Còn lại 21/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm dƣới 150g (chiếm 33,3%). Khối lƣợng 100 hạt cao nhất là mẫu giống L26 trung bình 2 năm đạt 65,8g, tiếp đến là giống Sen lai đạt 65,7g và mẫu giống BWP-7 đạt 65,6g, thấp nhất là mẫu giống ICGV01239 chỉ đạt 42,8g. Có 57/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm đạt trên 50g (chiếm 90,5%), trong đó có 24/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm đạt trên 60g (chiếm 38,1%). Có 06/63 mẫu giống có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm dƣới 50g (chiếm 9,5%). 90 Các mẫu giống có tỷ lệ hạt/quả đạt trên 70%, trong đó mẫu giống BWP-9 có tỷ lệ hạt/quả trung bình 2 năm cao nhất đạt 75,1%, tiếp đến là mẫu giống BWP-8 đạt 74,3% và mẫu giống BWP-6 đạt 74,2%, thấp nhất là mẫu giống MDRF5.176 và Sen thắt cùng chỉ đạt 70,1%. Năng suất thực thu của mẫu giống BWP-1 trung bình 2 năm cao nhất đạt 38,8 tạ/ha, tiếp đến là mẫu giống BWP-11 đạt 37,9 tạ/ha và 02 mẫu giống BWP-12, MDRF5.176 cùng có năng suất đạt 36,9 tạ/ha; thấp nhất là giống Gié Nho Quan chỉ đạt 20,7 tạ/ha. Có 23/63 mẫu giống có năng suất thực thu trung bình 2 năm trên 35 tạ/ha (chiếm 36,5%), trong đó có 12/63 mẫu giống có năng suất thực thu trung bình 2 năm trên 36 tạ/ha (chiếm 19,0%). Có 40/63 mẫu giống đạt năng suất thực thu trung bình 2 năm dƣới 35 tạ/ha (chiếm 63,5%) và 09/63 mẫu giống có năng suất thực thu trung bình 2 năm dƣới 30 tạ/ha (chiếm 14,3%). Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và một số đặc điểm nông sinh học của tập đoàn 63 mẫu giống lạc cho thấy có 26 mẫu giống lạc có ƣu thế làm nguồn vật liệu trong chọn giống (bảng 3.15). Kết quả trên bảng 3.15 cho thấy có 26 mẫu giống lạc có khả năng kháng bệnh HXVK trong lây bệnh nhân tạo kết hợp với phân tích bằng 3 chỉ thị phân tử. Cả 26 mẫu giống lạc khi phân tích bằng 3 chỉ thị phân tử pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 đều thể hiện khả năng kháng bệnh khi đều mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh và cả 26 mẫu giống cũng đều thể hiện khả năng chống chịu bệnh HXVK khi lây bệnh nhân tạo ở mức kháng cao, mức kháng đến mức kháng trung bình. Trong số 26 mẫu giống có ƣu thế về tính kháng bệnh HXVK, có 10 mẫu giống (BWP-1, BWP-5, BWP-7, BWP-8, BWP-11, BWP-12, BWP-13, BW15, dòng lai 14 và O401.57.1) vừa có khả năng kháng bệnh, vừa có năng năng suất cao (trung bình 2 năm trên 35 tạ/ha) là nguồn vật liệu tốt phục vụ công tác chọn tạo giống. 91 Bảng 3.15. Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực của thu một số mẫu giống lạc trong tập đoàn (năm 2012-2013) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Tên mẫu giống O713.24.1 BW15 VAG 03.2 BWP-6 BWP-7 Mức độ chống Chỉ thị liên kết với tính chịu bệnh trạng kháng bệnh HXVK HXVK Năm Năm pPGPseq GA161 7G2 2012 2013 3F5 HR HR 1 1 1 HR HR 1 1 1 Năng suất thực thu (tạ/ha) Năm 2012 33,0 35,6 Năm 2013 35,4 36,9 R R R R R R 1 1 1 1 1 1 1 1 1 33,4 34,6 36,1 35,5 34,3 37,3 BWP-11 Gié Nho Quan ICG 5051 ICGV01238 ICGV01239 R R MR MR MR R R MR MR MR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 38,2 20,6 27,0 31,4 28,9 37,6 20,8 28,5 28,2 31,2 ICGV6022 Dòng lai 2 MR MR MR MR 1 1 1 1 1 1 29,8 31,8 30,9 29,2 ICGV01232 BW62 CG 38 L16 L17 ICGV01241 BWP-3 BWP-8 Dòng lai 14 BWP-13 O401.57.1 BWP-5 BWP-12 BWP-1 MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR MR 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 30,4 31,5 33,8 33,5 34,4 34,4 34,1 35,3 34,1 35,4 36,4 36,2 38,2 38,2 31,9 33,0 31,0 32,3 32,1 32,1 32,7 34,8 36,2 35,1 35,5 36,8 35,5 39,4 Ghi chú: HR: Kháng cao; R: Kháng; MR: Kháng trung bình. 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết. 92 3.3.2. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.2.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo Để xác định dòng lạc kháng bệnh HXVK, đề tài đã chọn 50 dòng lạc từ 16 tổ hợp lai đơn và 3 giống đối chứng gồm MD7 (giống sản xuất), Gié Nho Quan (chuẩn kháng) và giống ICGV3704 (chuẩn nhiễm) tiến hành đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo với isolate vi khuẩn SS1 có độc tính, thuộc biovar 3 là biovar phổ biến nhất của vi khuẩn trong số 61 isolate thu thập (bảng 3.16). Bảng 3.16. Đánh khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Thanh Trì, năm 2014) STT Tên dòng, giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1306.9 1306.10 1306.4 1306.2 1308.9 1308.4 1308.2 1308.5 1217.4 1217.3 1217.2 1211.2 1211.15 1211.1 1219.4 1219.7 1219.5 1213.1 1213.11 1213.13 Tỷ lệ bệnh (%) 24,8 32,5 18,4 14,6 34,8 35,5 36,8 37,3 24,8 28,4 32,5 32,8 38,4 38,4 42,5 24,6 13,6 22,8 36,2 35,7 Mức độ chống chịu bệnh HXVK MR MS R R MS MS MS MS MR MR MS MS MS MS MS MR R MR MS MS 93 STT Tên dòng, giống 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 1214.13 1214.5 1214.7 1214.14 1212.5 1212.7 1212.1 1204.5 1204.3 1204.2 1207.3 1207.1 1204.6 1201.3 1201.1 1209.7 1209.4 1209.9 1209.2 1316.32 1316.33 1316.36 1315.43 1315.44 1315.45 1315.46 1317.181 1317.182 1317.183 1317.184 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) Tỷ lệ bệnh (%) 42,8 42,4 38,4 32,6 36,8 32,6 22,5 42,8 24,6 23,7 26,4 21,6 38,4 32,7 28,3 23,7 32,8 38,4 21,7 38,4 45,2 42,8 28,2 21,8 22,7 28,4 35,8 23,7 42,8 28,4 18,2 12,4 100 Mức độ chống chịu bệnh HXVK MS MS MS MS MS MS MR MS MR MR MR MR MS MS MR MR MS MS MR MS MS MS MR MR MR MR MS MR MS MR R R HS Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; MS: Nhiễm trung bình; HS: Nhiễm nặng; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 94 Kết quả cho thấy 03/50 dòng (1219.5, 1306.2 và 1306.4) có mức kháng (chiếm 6,0%), có 19/50 dòng có mức kháng trung bình (chiếm 38,0%). Còn lại 28/50 dòng có mức nhiễm trung bình (chiếm 56,0%). Giống đối chứng MD7 và Gié Nho Quan đều phản ứng với bệnh ở mức kháng, còn giống ICGV3704 nhiễm nặng đối với bệnh HXVK. Các dòng có mức kháng bệnh từ trung bình trở lên có thể chọn lọc tiếp để phát triển thành dòng, giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.3.2.2. Xác định các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn có tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử Tất cả 50 dòng trong quần thể phân ly đƣợc đánh giá tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử. Đánh giá đƣợc thực hiện nhờ sự có mặt của băng đặc trƣng của chỉ thị phân tử có khả năng nhận biết giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, khi so sánh với cây chỉ thị có tính kháng và nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn. Đ bệnh héo xanh vi khuẩn cao, giống ICGV3704 là giống mẫn cảm với bệnh héo xanh vi khuẩn và giống L14 là giống đối chứng sản xuất bệnh héo xanh vi khuẩn điều kiện ngoại cảnh nhƣ: khôn .. bệnh héo xanh vi khuẩn chỉ thị phân tử SSR liên kết đã chọn lọc (pPGPseq3F5, GA161 và 7G2). Kết quả thể hiện ở bảng 3.17. Kết quả bảng 3.17 thấy rằng từ các ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với 3 chỉ thị, khi phân tích với chỉ thị pPGPseq3F5, có 13/50 dòng mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 26,0%); phân tích với chỉ thị GA161, có 16/50 dòng mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 32,0%); phân tích với chỉ thị 7G2, có 14/50 dòng mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 28,0%). 95 Bảng 3.17. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) Chỉ thị liên kết với tính trạng STT kháng bệnh HXVK Tên dòng, giống Tổng số pPGPseq3F5 GA161 7G2 1 2 3 1306.9 1306.10 1306.4 0 0 0 0 1 1 0 0 0 4 1306.2 0 0 0 5 1308.9 0 0 0 6 7 8 9 10 1308.4 1308.2 1308.5 1217.4 1217.3 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 11 12 13 1217.2 1211.2 1211.15 0 0 0 1 0 1 1 1 1 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1211.1 1219.4 1219.7 1219.5 1213.1 1213.11 1213.13 1214.13 1214.5 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 2 3 1 1 1 0 0 1 23 24 25 26 27 28 29 1214.7 1214.14 1212.5 1212.7 1212.1 1204.5 1204.3 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 2 1 0 0 3 2 0 1 1 0 0 0 0 1 2 1 2 1 2 96 STT Tên dòng, giống Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 Tổng số 30 1204.2 1 1 1 3 31 1207.3 0 1 0 1 32 1207.1 0 0 0 0 33 1204.6 0 0 1 1 34 1201.3 1 0 1 2 35 1201.1 1 0 1 2 36 1209.7 0 1 0 1 37 1209.4 0 1 0 1 38 1209.9 0 1 0 1 39 1209.2 0 0 0 0 40 1316.32 0 0 0 0 41 1316.33 0 0 0 0 42 1316.36 0 0 0 0 43 1315.43 0 0 0 0 44 1315.44 0 0 0 0 45 1315.45 0 0 0 0 46 1315.46 0 0 0 0 47 1317.181 0 0 0 0 48 1317.182 0 0 0 0 49 1317.183 0 0 0 0 50 1317.184 0 0 0 0 51 L14 (ĐCSX) 0 0 0 0 52 Gié Nho Quan (ĐCKB) 1 1 1 3 53 ICGV3704 (ĐCNB) 0 0 0 0 Ghi chú: 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Trong số các dòng đánh giá, có 03/50 dòng (1219.7; 1204.5 và 1204.2) mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu (chiếm 6,0%); có 09/50 dòng mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với 2 chỉ thị (chiếm 18,0%); có 16/50 dòng mang băng tƣơng tự 97 nhƣ giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với 1 trong 3 chỉ thị (chiếm 32,0%); còn lại 22/50 dòng không mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh với cả 3 chỉ thị nghiên cứu (chiếm 44,0%). Hai giống đối chứng (L14 và ICGV3704) không mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu, trong khi giống Gié Nho Quan liên kết với cả 3 chỉ thị phân tử nghiên cứu. Các dòng lạc mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với 3 chỉ thị nghiên cứu tiếp tục đánh giá để xác định các đặc tính tốt phục vụ chọn tạo giống mới. 3.3.2.3. Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn Kết quả đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của 50 dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn vụ Xuân năm 2014 để kết hợp với các đặc tính kháng bệnh trên cơ sở lây nhiễm bệnh nhân tạo và sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng khánh bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc các dòng giống lạc vừa mang gen kháng vừa có năng suất cao để định hƣớng trong quá trình chọn tạo giống cho sản xuất đƣợc thể hiện ở bảng 3.18. Trong năm 2014, số quả chắc/cây cao nhất là dòng 1209.7 đạt 14,1 quả/cây, tiếp đến là dòng 1219.7 đạt 13,4 quả/cây và dòng 1213.11 đạt 13,1 quả/cây, thấp nhất là dòng 1315.45 chỉ đạt 9,4 quả/cây; trong 50 dòng thí nghiệm có 40/50 dòng có số quả chắc đạt trên 10 quả/cây (chiếm 80,0%), trong đó có 21/50 dòng có số quả chắc đạt trên 11 quả/cây (chiếm 42,0%). Còn lại 10/50 dòng có số quả chắc dƣới 10 quả/cây (chiếm 20,0%). Các giống đối chứng L14, ICGV3704 chỉ đạt 9,5 quả/cây, giống Gié Nho Quan đạt 10,5 quả chắc/cây. Khối lƣợng 100 quả cao nhất là dòng 1209.2 đạt 157,2g, tiếp đến là dòng 1209.9 đạt 156,3g, có 02 dòng 1212.1 và 1209.4 cùng đạt 155,1g, thấp nhất là dòng 1306.2 chỉ đạt 145,4g. Có 45/50 dòng có khối lƣợng 100 quả đạt trên 150g (chiếm 90,0%). Còn lại 05/50 dòng có khối lƣợng 100 quả dƣới 150g (chiếm 10,0%). Các giống đối chứng L14 đạt 150g, giống ICGV3704 đạt 130,5g, giống Gié Nho Quan chỉ đạt 88,2g thấp hơn so với các dòng thí nghiệm. 98 Bảng 3.18. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) STT Tên dòng, giống 1 1306.9 1306.10 2 3 Số quả Khối Khối Tỷ lệ Năng chắc/cây lƣợng 100 lƣợng 100 hạt/quả suất quả hạt thực thu (quả) (g) (g) (%) (tạ/ha) 12,0 152,4 56,6 69,0 35,5 11,0 150,1 54,5 70,0 33,7 1306.4 1306.2 1308.9 1308.4 1308.2 1308.5 12,3 10,4 9,8 10,3 11,8 9,6 150,7 145,4 150,2 150,7 150,4 152,1 56,6 48,8 51,4 45,5 50,2 56,8 69,5 70,2 71,0 70,0 74,0 71,3 36,2 30,6 31,7 33,1 42,1 31,5 12 1217.4 1217.3 1217.2 1211.2 10,6 10,7 10,4 11,2 150,3 150,0 149,5 151,4 61.7 53,2 41,0 65,5 70,3 71,0 72,0 72,0 30,1 37,7 32,5 33,4 13 1211.15 9,8 154,2 68,9 71,3 32,8 14 1211.1 1219.4 1219.7 1219.5 1213.1 1213.11 1213.13 1214.13 10,7 12,1 13,4 12,6 11,5 13,1 12,4 10,7 150,4 153,2 154,1 152,6 150,1 152,7 152,5 151,6 52,5 50,0 68,6 44,7 63,5 55,3 61,2 45,6 70,0 71,3 71,8 72,0 70,6 70,0 72,0 70,0 33,1 36,1 41,6 40,5 35,7 37,3 38,6 35,2 1214.5 1214.7 1214.14 1212.5 1212.7 1212.1 12,0 11,8 10,7 9,8 10,4 10,5 154,3 153,2 150,2 148,7 150,4 155,1 56,8 58,8 46,8 51,3 52,5 55,0 72,3 70,2 71,0 71,0 71,2 68,8 35,7 34,6 33,8 32,1 35,8 38,4 4 5 6 7 8 9 10 11 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 99 STT Tên dòng, giống 28 1204.5 1204.3 1204.2 29 30 31 Số quả Khối Khối Tỷ lệ Năng chắc/cây lƣợng 100 lƣợng 100 hạt/quả suất quả hạt thực thu (quả) (g) (g) (%) (tạ/ha) 9,6 150,3 51,1 70,1 34,2 10,7 148,7 48,8 71,0 33,6 9,8 151,7 61,2 70,2 33,5 33 1207.3 1207.1 1204.6 10,2 10,5 10,7 150,7 153,5 150,5 59,2 57,8 40,5 71,0 71,0 70,8 32,7 34,6 35,3 34 1201.3 12,6 150,7 48,6 71,0 36,3 35 1201.1 11,0 154,3 61,2 70,8 36,7 36 1209.7 14,1 150,4 56,6 71,2 40,7 37 1209.4 12,3 155,1 54,6 70,5 39,7 38 1209.9 11,6 156,3 49,7 70,6 38,5 39 1209.2 12,7 157,2 63,1 69,5 36,2 40 1316.32 11,3 150,6 48,8 70,7 35,2 41 1316.33 10,4 153,2 54,1 71,0 35,6 42 1316.36 9,8 151,7 59,9 70,8 34,7 43 1315.43 10,8 154,2 53,2 71,6 36,2 44 1315.44 10,4 150,1 55,6 72,4 37,9 45 1315.45 9,4 152,3 57,5 70,5 33,8 46 1315.46 10,9 152,7 56,8 70,0 38,4 47 1317.181 9,6 150,7 58,6 71,0 33,6 48 1317.182 9,7 148,5 55,6 70,2 32,8 49 1317.183 10,7 152,0 61,2 71,5 33,7 50 1317.184 11,2 150,7 56,7 70,8 34,5 51 L14 (ĐCSX) 9,5 150,0 57,3 70,5 31,8 52 Gié Nho Quan (ĐCKB) 10,5 88,2 50,2 72,1 22,5 53 ICGV3704 (ĐCNB) 9,5 130,5 46,1 71,5 27,8 CV% 5,4 6,6 5,2 - 6,4 LSD0,05 0,95 15,97 4,58 - 3,60 32 Ghi chú: ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 100 Khối lƣợng 100 hạt cao nhất là dòng 1211.15 đạt 68,9g, tiếp đến là dòng 1219.7 đạt 68,6g và dòng 1211.2 đạt 65,5g, thấp nhất là dòng 1204.6 chỉ đạt 40,5g. Trong tổng số 50 dòng nghiên cứu, có 39/50 dòng (chiếm 78,0%) có khối lƣợng 100 hạt đạt trên 50g, trong đó có 10/50 dòng (chiếm 20,0%) có khối lƣợng 100 hạt đạt trên 60g, có 11/50 dòng (chiếm 22,0%) có khối lƣợng 100 hạt dƣới 50g. Các giống đối chứng có khối lƣợng 100 hạt từ 46,1g đến 57,3g. Tỷ lệ hạt/quả cao nhất là dòng 1308.2 đạt 74,0%, tiếp đến là dòng 1315.44 đạt 72,4% và dòng 1214.5 đạt 72,3%, thấp nhất là dòng 1212.1 chỉ đạt 68,8%. Trong tổng số 50 dòng nghiên cứu, có 46/50 dòng (chiếm 92,0%) có có tỷ lệ hạt/quả đạt trên 70%, có 04/50 dòng (chiếm 8,0%) có tỷ lệ hạt/quả đạt dƣới 70%. Các giống đối chứng đều có tỷ lệ hạt/quả trên 70%. Năng suất thực thu của tất cả 50 dòng từ 16 tổ hợp lai đơn đều đạt khá cao. Dòng 1308.2 có năng suất cao nhất đạt 42,1 tạ/ha, tiếp đến là dòng 1219.7 đạt 41,6 tạ/ha và dòng 1209.7 đạt 40,7 tạ/ha, thấp nhất là dòng 1217.4 chỉ đạt 30,1 tạ/ha. Trong tổng số 50 dòng nghiên cứu, có 26/50 dòng năng suất đạt trên 35 tạ/ha (chiếm 52,0%). Còn lại 24/50 dòng có năng suất từ dƣới 35 tạ/ha (chiếm 48,0%). Các giống đối chứng có năng suất từ 22,5 tạ/ha (giống Gié Nho Quan) đến 31,8 tạ/ha (giống L14). Từ kết quả đánh giá nhân tạo khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn kết hợp với sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc các dòng có khả năng kháng bệnh và đánh giá đặc tính nông sinh học của 50 dòng từ 16 tổ hợp lai đơn đã lựa chọn đƣợc 07 dòng lạc (1306.4, 1217.3, 1219.7, 1219.5, 1213.1, 1201.1, 1209.7) có khả năng kháng bệnh HXVK và có năng suất cao (35,7-41,6 tạ/ha) để tiếp tục chọn lọc các năm tiếp theo (bảng 3.19). Nhƣ vậy tỷ lệ dòng từ tổ hợp lai đơn đạt yêu cầu kháng bệnh trong đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử và có năng suất cao khá thấp (có 07/50 dòng đạt 14,0%) (bảng 3.19). Kết quả trên bảng 3.19 cho thấy: trong đánh giá bệnh nhân tạo, có 02 dòng (1306.4, 1219.5) có phản ứng với bệnh HXVK ở mức kháng, 05 dòng còn lại có phản ứng với bệnh HXVK ở mức kháng trung bình. Khi chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, có 01 dòng (1219.7) có khả năng kháng bệnh khi mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu, có 01 dòng (1201.1) mang 101 băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh phân tích với 2 chỉ thị, 05 dòng mang băng tƣơng tự nhƣ giống đối chứng kháng bệnh phân tích với 1 trong 3 chỉ thị nghiên cứu. Về năng suất thực thu, cả 07 dòng đạt năng suất từ 35,7 - 41,6 tạ/ha; trong đó có 03 dòng (1219.7, 1209.7 và 1219.5) có năng suất khá cao (40,5 - 41,6 tạ/ha). Bảng 3.19. Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai đơn (năm 2014) STT Tên dòng Mức độ Chỉ thị liên kết với tính trạng Năng suất chống chịu kháng bệnh HXVK thực thu bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 (tạ/ha) 1 1306.4 R 0 1 0 36,2 2 1219.5 R 1 0 0 40,5 3 1213.1 MR 1 0 0 35,7 4 1201.1 MR 1 0 1 36,7 5 1217.3 MR 0 1 0 37,7 6 1209.7 MR 0 1 0 40,7 7 1219.7 MR 1 1 1 41,6 Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết. 3.3.3. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng lạc kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.3.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo Trong số các nguồn vật liệu chọn tạo giống lạc kháng bệnh HXVK, các dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy đƣợc thực hiện giữa các nguồn vật liệu có khả năng chống chịu bệnh HXVK với nguồn vật liệu có đặc tính nông sinh học tốt. Đánh giá các dòng về khả năng chống chịu bệnh và đặc điểm nông sinh học giúp cho việc chọn lọc để phát triển thành các giống lạc triển vọng có hiệu quả. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của 26 dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy và 03 giống đối chứng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo qua 2 năm (2013-2014) đƣợc thể hiện trên bảng 3.20. 102 Bảng 3.20. Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Thanh Trì, năm 2013-2014) STT Tên dòng, giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 HX14 HX15 HX16 HX17 HX18 HX19 HX21 HX22 HX23 HX24 HX25 HX26 HX27 HX31 HX32 HX33 HX34 HX38 HX36 HX37 HX35 HX39 HX40 HX41 HX42 HX43 L14 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) Năm 2013 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 34,5 MS 26,0 MR 28,8 MR 28,4 MR 39,8 MS 26,6 MR 25,5 MR 27,9 MR 26,2 MR 28,5 MR 27,8 MR 28,3 MR 27,5 MR 23,1 MR 15,0 R 38,3 MS 25,4 MR 27,0 MR 45,2 MS 15,0 R 18,5 R 27,2 MR 28,0 MR 28,8 MR 22,0 MR 23,3 MR 48,6 MS 10,8 R 100 HS Năm 2014 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 32,8 MS 24,6 MR 22,4 MR 26,4 MR 36,4 MS 26,4 MR 22,8 MR 28,4 MR 24,6 MR 28,2 MR 24,6 MR 26,8 MR 24,6 MR 28,2 MR 16,2 R 38,4 MS 28,2 MR 24,8 MR 38,4 MS 12,6 R 16,8 R 26,4 MR 22,4 MR 22,4 MR 20,5 MR 21,5 MR 36,2 MS 12,4 R 100 HS Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; MS: Nhiễm trung bình; S: Nhiễm; HS: Nhiễm nặng; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 103 Kết quả bảng 3.20 cho thấy có 03/26 dòng (HX32, HX37 và HX35) kháng (chiếm 11,5%). Có 19/26 dòng kháng trung bình (chiếm 73,1%); có 04/26 dòng nhiễm trung bình (chiếm 15,4%). Trong khi giống đối chứng ICGV3704 nhiễm nặng, giống L14 nhiễm trung bình còn giống Gié Nho Quan có mức kháng với bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.3.3.2. Xác định các dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy có tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử ADN của các dòng lạc từ tổ hợp lai hồi quy đƣợc đánh giá với 3 chỉ thị phân tử SSR liên kết đã chọn lọc (pPGPseq3F5, GA161 và 7G2). Kết quả thể hiện ở bảng 3.21. Qua bảng 3.21 cho thấy phân tích với chỉ thị pPGPseq3F5 có 07/26 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 26,9%); phân tích với chỉ thị GA161 có 09/26 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 34,6%); phân tích với chỉ thị 7G2 có 12/26 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 46,2%). Trong 26 dòng nghiên cứu, không có dòng nào mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị; có 05/26 dòng (HX15, HX23, HX26, HX27 và HX43) mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 2 chỉ thị nghiên cứu (chiếm 19,2%); có 18/26 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 1 trong 3 chỉ thị đã sử dụng (chiếm 69,2%); còn lại 03/26 dòng không mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị (chiếm 11,5%). Trong 03 giống đối chứng, giống Gié Nho Quan liên kết với cả 3 chỉ thị; giống L14 và giống ICGV3704 không mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh khi phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu. Các dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với các chỉ thị nghiên cứu tiếp tục đƣợc lựa chọn để đánh giá qua các năm tiếp theo để chọn lọc, phát triển thành dòng triển vọng. 104 Bảng 3.21. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Tên dòng, giống HX14 HX15 HX16 HX17 HX18 HX19 HX21 HX22 HX23 HX24 HX25 HX26 HX27 HX31 HX32 HX33 HX34 HX38 HX36 HX37 HX35 HX39 HX40 HX41 HX42 HX43 L14 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 Tổng số 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 0 3 0 Ghi chú: 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 105 3.3.3.3. Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng từ một số tổ hợp lai hồi quy Trong đánh giá đặc điểm nông học của các dòng lạc, đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc kết hợp với các đặc tính kháng bệnh trên cơ sở lây nhiễm bệnh nhân tạo và sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng héo xanh vi khuẩn chọn lọc các dòng lạc vừa mang gen kháng vừa có năng suất cao để định hƣớng trong quá trình chọn tạo giống cho sản xuất là yêu cầu quan trọng. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.22. Về số quả chắc/cây trung bình qua 2 năm của các dòng đều đạt từ 10 quả/cây trở lên, cao nhất là dòng HX14 đạt 12,0 quả/cây, tiếp đến 02 dòng HX27 và HX22 cùng đạt 11,9 quả/cây, thấp nhất là dòng HX40 có số quả trung bình 2 năm đạt 10,2 quả/cây. Trong các dòng thí nghiệm có 12/26 dòng có số quả chắc trung bình 2 năm đạt trên 11 quả/cây (chiếm 46,2%). Còn lại 14/26 dòng có số quả chắc trung bình 2 năm dƣới 11 quả/cây (chiếm 53,8%); Giống Gié Nho Quan (đối chứng) đạt 10,4 quả chắc/cây; giống ICGV3704 và giống L14 có số quả chắc thấp hơn các dòng thí nghiệm dƣới 10 quả chắc/cây. Về khối lƣợng 100 quả cao nhất là dòng HX27 trung bình 2 năm đạt 153,4g, tiếp đến là dòng HX32 đạt 151,6g và dòng 0803.1.1 đạt 151,4g, thấp nhất là dòng HX39 chỉ đạt 137,9g. Có 09/26 dòng có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm đạt trên 150g (chiếm 34,6%). Còn lại 17/26 dòng có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm dƣới 150g (chiếm 65,4%). Giống đối chứng Gié Nho Quan có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm chỉ đạt 88,1g. Về khối lƣợng 100 hạt của 26 dòng tham gia thí nghiệm đều đạt trên 50g, cao nhất là dòng HX24 trung bình 2 năm đạt 63,2g, tiếp đến là dòng HX17 đạt 63,0g và dòng HX27 đạt 62,8g, thấp nhất là dòng HX37 chỉ đạt 50,2g. Có 05/26 (chiếm 19,2%) dòng có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm đạt trên 60g. Có 21/26 (chiếm 80,8%) dòng có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm dƣới 60g. Giống đối chứng L14 đạt 57,8g, Gié Nho Quan đạt 50,7g, còn giống ICGV3704 có khối lƣợng trung bình 100 hạt thấp nhất, chỉ đạt 46,7g. 106 Bảng 3.22. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) Số quả Khối lƣợng Khối lƣợng Tỷ lệ chắc/cây 100 quả 100 hạt hạt/quả Tên STT (quả) (g) (g) (%) dòng, giống Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm Năm 2013 2014 2013 2014 2013 2014 2013 2014 1 HX14 12,2 11,8 140,3 143,1 50,7 53,2 70,2 71,1 2 HX15 11,4 10,4 150,8 148,2 59,3 60,0 68,1 69,5 3 HX16 11,0 11,3 150,6 149,3 51,3 50,6 72,1 72,5 4 HX17 10,3 10,2 149,3 147,2 62,8 63,1 67,4 68,5 5 HX18 11,7 11,9 150,3 149,2 54,5 53,0 70,8 71,2 6 HX19 10,1 10,4 140,6 142,4 52,4 53,3 70,1 69,0 7 HX21 11,4 11,6 145,2 147,7 58,1 59,2 70,9 69,5 8 HX22 12,0 11,8 151,2 150,4 54,1 53,3 76,2 74,0 9 HX23 11,0 10,8 152,2 150,0 58,5 60,3 73,4 71,0 10 HX24 10,7 10,8 142,0 144,1 64,3 62,1 66,4 68,0 11 HX25 10,9 10,8 148,4 149,6 58,7 59,0 74,1 72,0 12 HX26 11,3 10,7 152,2 150,1 58,1 56,8 74,3 72,5 13 HX27 11,9 11,8 153,8 152,9 64,0 61,6 68,2 70,5 14 HX31 10,9 10,8 152,1 150,1 56,4 56,0 68,8 67,5 15 HX32 11,5 11,5 150,4 152,7 56,8 55,1 69,5 70,0 16 HX33 10,5 10,5 149,7 147,5 62,3 60,9 70,1 72,0 17 HX34 11,5 10,9 152,3 150,4 50,4 52,0 70,8 71,2 18 HX38 10,9 10,3 149,5 145,1 57,1 56,6 68,3 70,4 19 HX36 11,3 11,6 143,7 152,3 59,1 58,8 68,5 71,0 20 HX37 10,5 10,5 144,1 147,2 51,1 49,2 70,1 69,5 21 HX35 10,3 10,8 144,7 145,1 52,8 55,2 71,4 71,3 22 HX39 10,4 10,2 138,4 137,4 62,6 61,7 74,2 71,0 23 HX40 10,2 10,2 142,4 144,9 54,6 53,5 69,1 71,2 24 HX41 10,9 10,6 142,2 145,5 55,9 57,3 63,3 70,5 25 HX42 11,1 11,2 147,2 144,5 57,2 56,5 71,1 69,2 26 HX43 11,2 11,2 151,3 150,1 53,6 52,7 71,1 70,8 L14 27 8,6 9,0 154,6 150,0 58,0 57,6 71,1 71,3 (ĐCSX) 28 29 Gié Nho Quan (ĐCKB) 10,3 ICGV3704 8,9 (ĐCNB) CV% 5,3 LSD0,05 0,94 Năng suất thực thu (tạ/ha) Năm Năm 2013 2014 37,3 36,8 41,6 38,3 30,4 31,0 38,3 37,6 36,6 36,9 36,1 37,2 35,7 36,0 36,6 35,9 31,5 30,8 33,9 34,6 35,1 35,7 41,6 39,5 33,6 33,2 40,5 39,8 31,8 32,3 38,9 38,5 37,4 36,0 39,9 37,5 32,2 33,8 37,8 38,4 36,4 38,8 33,4 32,8 36,7 37,2 38,5 38,3 35,3 34,7 36,1 34,9 31,3 32,6 10,5 88,5 87,7 50,3 51,1 70,6 70,1 20,3 20,6 9,5 138,3 137,5 46,1 47,3 71,6 71,5 27,2 28,4 6,0 1,06 5,0 11,78 5,3 12,51 5,7 5,25 4,8 4,41 - - 5,4 3,11 5,6 3,20 Ghi chú: ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 107 Tỷ lệ hạt/quả đạt trung bình 2 năm cao nhất là dòng HX22 đạt 75,1%, tiếp đến là dòng HX26 đạt 73,4% và dòng HX25 đạt 73,1%, thấp nhất là dòng HX41 chỉ đạt 66,9%. Trong tổng số 26 dòng, có 15/26 dòng có tỷ lệ hạt/quả đạt trung bình 2 năm đạt trên 70% (chiếm 57,7%). Còn lại 11/26 dòng có tỷ lệ hạt/quả đạt trung bình 2 năm đạt dƣới 70% (chiếm 42,3%). Các giống đối chứng có tỷ lệ hạt/quả đều đạt từ 70% trở lên. Về năng suất thực thu của các dòng đều đạt khá cao, trong đó dòng HX26 có năng suất trung bình 2 năm cao nhất đạt 40,6 tạ/ha, tiếp đến là dòng HX31 đạt 40,2 tạ/ha và dòng HX15 đạt 40,0 tạ/ha; thấp nhất là dòng HX16 chỉ đạt 30,7 tạ/ha. Có 19/26 dòng có năng suất thực thu trung bình 2 năm trên 35 tạ/ha (chiếm 73,1%). Còn lại 07/26 dòng có năng suất thực thu trung bình 2 năm dƣới 35 tạ/ha (chiếm 26,9%). Các giống đối chứng có năng suất trung bình 2 năm thấp, giống L14 đạt 32 tạ/ha; giống ICGV3704 đạt 27,8 tạ/ha, giống Gié Nho Quan chỉ đạt 20,5 tạ/ha. Tổng hợp kết quả đánh giá về khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn qua lây bệnh nhân tạo kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử để xác định dòng có khả năng kháng bệnh và đánh giá đặc tính nông sinh học của 26 dòng từ một số tổ hợp lai hồi quy, đã chọn lọc đƣợc 14 dòng lạc (HX35, HX37, HX25, HX21, HX22, HX43, HX34, HX40, HX17, HX41, HX38, HX15, HX31 và HX26) vừa có khả năng kháng bệnh HXVK vừa có một số đặc tính nông sinh học tốt để tiếp tục chọn lọc trong các năm tiếp theo. Nhƣ vậy tỷ lệ các dòng có khả năng kháng bệnh cả trong đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử và có năng suất trung bình 2 năm cao (35,4-40,6 tạ/ha) của các dòng từ tổ hợp lai hồi quy khá cao (có 14/26 dòng đạt 53,8%). Nếu so với các dòng từ một số tổ hợp lai đơn thì tỷ lệ chọn lọc các dòng có khả năng kháng bệnh HXVK và có năng suất cao của các dòng từ một số tổ hợp lai hồi quy cao hơn 39,8% (bảng 3.23). Qua bảng 3.23 thấy rằng cả 14 dòng đều có khả năng kháng bệnh HXVK và đều có năng suất cao trên 35 tạ/ha. Trong số các dòng, có 02/14 dòng (gồm HX35 và HX37) có phản ứng với bệnh HXVK ở mức kháng khi đánh giá bệnh nhận tạo, còn lại 12/14 dòng có phản ứng kháng trung bình với bệnh HXVK khi đánh giá 108 bệnh nhận tạo. Có 02/14 dòng (HX15 và HX26) mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 2 chỉ thị nghiên cứu; còn lại 12/14 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 1 chỉ thị nghiên cứu. Đây là các dòng có đặc tính tốt có thể tiếp tục đánh giá để lựa chọn dòng có năng suất cao và có khả năng kháng bệnh HXVK ổn định để phát triển ra sản xuất. Bảng 3.23. Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc từ tổ hợp lai hồi quy (năm 2013-2014) Mức độ STT Tên dòng chống chịu bệnh HXVK Năm Năm 2013 2014 Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK Năng suất thực thu (tạ/ha) pPGPseq3F5 7G2 GA161 Năm Năm 2013 2014 1 HX35 R R 0 1 0 36,4 38,8 2 HX37 R R 0 1 0 37,8 38,4 3 HX25 MR MR 0 1 0 35,1 35,7 4 HX21 MR MR 0 0 1 35,7 36,0 5 HX22 MR MR 0 1 0 36,6 35,9 6 HX43 MR MR 1 0 0 36,1 37,2 7 HX34 MR MR 0 1 0 37,4 36,0 8 HX40 MR MR 0 0 1 36,7 37,2 9 HX17 MR MR 1 0 0 38,3 37,6 10 HX41 MR MR 0 0 1 38,5 38,3 11 HX38 MR MR 0 1 0 39,9 37,5 12 HX15 MR MR 1 0 1 41,6 38,3 13 HX31 MR MR 0 0 1 40,5 39,8 14 HX26 MR MR 0 1 1 41,6 39,5 Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình. 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết. 109 3.3.4. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc ưu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng có khả năng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.4.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc ưu tú bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo Để tiếp tục chọn lọc nguồn vật liệu có khả năng chống chịu bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum hại lạc gây ra, đề tài đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm nhân tạo đối với 13 dòng lạc ƣu tú kế thừa từ nguồn vật liệu của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ chọn lọc từ các năm trƣớc và 3 giống đối chứng trong vụ Xuân năm 2014. Kết quả thể hiện qua bảng 3.24. Bảng 3.24. Đánh giá khả năng kháng bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc ưu tú (Thanh Trì, năm 2014) STT Tên dòng, giống Tỷ lệ bệnh (%) Mức độ chống chịu bệnh HXVK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1003.7 0811.10 1010.6 1009.8 1004.3 1010.5 1004.4 1008.9 1004.5 1004.8 1010.4 28,2 18,6 24,5 24,5 26,8 24,8 28,4 28,4 24,6 38,8 24,8 MR R MR MR MR MR MR MR MR MS MR 12 13 14 15 16 1003.4 1003.3 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) 14,5 28,6 14,6 12,8 100 R MR R R HS Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; MS: Nhiễm trung bình; HS: Nhiễm nặng. ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 110 Qua bảng 3.24 thấy rằng 02/13 dòng (0811.10 và 1003.4) có mức kháng khi đánh giá nhân tạo (chiếm 23,1%); có 10/13 dòng kháng trung bình (chiếm 76,9%); có 1 dòng 1004.8 nhiễm trung bình. Trong khi 2 giống đối chứng MD7 và Gié Nho Quan có phản ứng kháng khi đánh giá nhân tạo, còn giống ICGV3704 nhiễm nặng với bệnh héo xanh vi khuẩn. 3.3.4.2. Xác định các dòng lạc ưu tú có tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử Tất cả 13 dòng lạc ƣu tú và 3 giống đối chứng đƣợc đánh giá tính kháng bệnh héo xanh vi khuẩn ở mức độ phân tử thông qua chọn lọc bằng 3 chỉ thị đã đƣợc xác định là có liên quan chặt với tính kháng bệnh HXVK. Kết quả chọn lọc đƣợc thể hiện trong hình 3.14, hình 3.15 và hình 3.16, bảng 3.25. a) Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử pPGPseq3F5 chọn lọc các dòng lạc ưu tú có khả năng kháng bệnh HXVK Từ ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với chỉ thị pPGPseq3F5 ở kích thƣớc 219 bp trên hình 3.14 thấy rằng tƣơng ứng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh Gié Nho Quan (số 14) có một số dòng cũng mang băng tƣơng tự nhƣ: dòng 0811.10 (số 2), 1009.8 (số 4), 1004.4 (số 7), 1004.8 (số 10), 1010.4 (số 11), 1003.4 (số 12) và dòng 1003.3 (số 13). Vì vậy các dòng này có khả năng kháng bệnh HXVK. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 300 bp  Hình 3.14. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên dòng, giống 1: 1003.7, 2: 0811.10, 3: 1010.6, 4: 1009.8, 5: 1004.3, 6: 1010.5, 7: 1004.4, 8: 1008.9, 9: 1004.5, 10: 1004.8, 11: 1010.4, 12: 1003.4, 13: 1003.3, 14: Gié Nho Quan, 15: MD7, 16: ICGV3704. b) Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử GA161 chọn lọc các dòng lạc ưu tú có khả năng kháng bệnh HXVK Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với chỉ thị GA161 ở kích thƣớc 386 bp trên hình 3.15 cho thấy tƣơng ứng với vệt băng của giống đối chứng 111 kháng bệnh Gié Nho Quan (số 14) có một số dòng cũng mang băng tƣơng tự nhƣ: dòng 1003.7 (số 1), 1010.6 (số 3), 1010.5 (số 6), 1004.4 (số 7), 1008.9 (số 8), 1004.5 (số 9), 1004.8 (số 10) và dòng 1003.4 (số 12). Vì vậy các dòng này có khả năng kháng bệnh HXVK. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 300 bp  Hình 3.15. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên dòng, giống 1: 1003.7, 2: 0811.10, 3: 1010.6, 4: 1009.8, 5: 1004.3, 6: 1010.5, 7: 1004.4, 8: 1008.9, 9: 1004.5, 10: 1004.8, 11: 1010.4, 12: 1003.4, 13: 1003.3, 14: Gié Nho Quan, 15: MD7, 16: ICGV3704. c) Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử 7G2 chọn lọc các dòng lạc ưu tú có khả năng kháng bệnh HXVK Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với chỉ thị 7G2 ở kích thƣớc 386 bp trên hình 3.16 cho thấy tƣơng ứng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh Gié Nho Quan (số 14) có một số dòng cũng mang băng tƣơng tự nhƣ: dòng 1003.7 (số 1), 0811.10 (số 2), 1010.6 (số 3), 1009.8 (số 4), 1004.3 (số 5), 1010.5 (số 6), 1008.9 (số 8) và dòng 1004.5 (số 9). Từ kết quả này xác định các dòng này có khả năng kháng bệnh HXVK. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 400 bp  Hình 3.16. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên dòng, giống 1: 1003.7, 2: 0811.10, 3: 1010.6, 4: 1009.8, 5: 1004.3, 6: 1010.5, 7: 1004.4, 8: 1008.9, 9: 1004.5, 10: 1004.8, 11: 1010.4, 12: 1003.4, 13: 1003.3, 14: Gié Nho Quan, 15: MD7, 16: ICGV3704. 112 d. Tổng hợp kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các dòng lạc ưu tú có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Tổng hợp kết quả ứng dụng 3 chỉ thị phân tử chọn lọc các dòng lạc ƣu tú có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn thể hiện trên bảng 3.25. Bảng 3.25. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc ưu tú (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) STT Tên dòng, giống Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 1 1003.7 0 1 1 2 3 4 5 6 0811.10 1010.6 1009.8 1004.3 1010.5 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 7 8 1004.4 1008.9 1 0 1 1 0 1 9 10 11 12 13 14 15 16 1004.5 1004.8 1010.4 1003.4 1003.3 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 Tổng số 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 3 0 Ghi chú: 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Qua bảng 3.25 cho thấy khi phân tích với 2 chỉ thị 7G2 và chỉ thị GA161 cùng có 08/13 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 61,5%); với chỉ thị pPGPseq3F5 có 07/13 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh (chiếm 53,8%). Trong tổng số 13 dòng nghiên cứu, không có dòng nào mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với cả 3 chỉ thị đã sử dụng; có 10/13 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 2 chỉ thị đã sử dụng (chiếm 113 76,9%); còn lại 03/13 dòng mang băng tƣơng tự giống đối chứng kháng bệnh với 1 chỉ thị đã sử dụng (chiếm 23,1%). Giống đối chứng Gié Nho Quan liên kết với cả 3 chỉ thị; giống MD7 liên kết với 1 chỉ thị là pPGPseq3F5, còn giống ICGV3704 không liên kết khi phân tích với cả 3 chỉ thị nghiên cứu. 3.3.4.3. Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc ưu tú Để chọn đƣợc dòng lạc vừa có khả năng kháng bệnh HXVK, vừa có đặc điểm nông học tốt, đề tài đã đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của 13 dòng lạc ƣu tú và 03 giống đối chứng trong vụ Xuân năm 2014 (bảng 3.26). Bảng 3.26. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc ưu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) STT Tên dòng, giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1003.7 0811.10 1010.6 1009.8 1004.3 1010.5 1004.4 1008.9 1004.5 1004.8 1010.4 1003.4 1003.3 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) CV% LSD0,05 Số quả chắc/cây (quả) 10,8 10,5 13,3 12,8 12,3 13,0 11,8 13,8 14,3 10,5 9,8 10,8 13,0 11,2 10,3 9,1 6,1 1,19 Khối lƣợng 100 quả (g) 153,8 140,2 155,0 153,8 156,7 145,5 133,8 148,8 162,3 141,8 148,8 156,6 152,9 156,8 81,2 138,5 5,2 12,60 Khối lƣợng 100 hạt (g) 50,0 55,1 48,1 67,1 67,1 58,8 59,6 55,8 42,0 69,6 57,4 51,1 63,6 51,2 33,6 47,1 5,3 4,89 Tỷ lệ hạt/quả (%) 65,0 70,5 70,0 71,5 73,5 70,2 71,0 70,0 72,0 69,7 63,5 71,5 72,5 72,1 71,5 71,3 - Năng suất thực thu (tạ/ha) 38,7 39,6 40,5 37,8 38,4 36,9 38,4 39,5 38,7 37,6 38,2 36,6 38,7 32,3 20,7 27,5 5,5 3,33 Ghi chú: ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 114 Về số quả chắc/cây của các dòng ƣu tú dao động từ 9,8 quả/cây đến 14,3 quả/cây. Dòng 1004.5 có số quả chắc cao nhất đạt 14,3 quả/cây, tiếp đến là dòng 1008.9 đạt 13,8 quả/cây và dòng 1010.6 đạt 13,3 quả/cây, thấp nhất là dòng 1010.4 chỉ đạt 9,8 quả/cây; giống đối chứng ICGV3704 có số quả thấp hơn cả, chỉ đạt 9,1 quả chắc/cây. Khối lƣợng 100 quả cao nhất là dòng 1004.5 đạt 162,3g, tiếp đến là dòng 1004.3 đạt 156,7g và dòng 1003.4 đạt 156,6g, thấp nhất là dòng 1004.4 chỉ đạt 133,8g. Trong tổng số 13 dòng nghiên cứu, có 07/13 dòng có khối lƣợng 100 quả đạt từ 150g trở lên (chiếm 53,8%) và có 06/13 dòng có khối lƣợng 100 quả đạt dƣới 150g (chiếm 46,2%). Giống đối chứng Gié Nho Quan có khối lƣợng 100 quả thấp hơn cả, chỉ đạt 81,2g. Khối lƣợng 100 hạt cao nhất là có dòng 1004.8 đạt 69,6g, tiếp đến là 2 dòng 1004.3 và 1009.8 cùng đạt 67,1g, thấp nhất là dòng 1004.5 chỉ đạt 42,0g. Trong tổng số 13 dòng nghiên cứu, có 04/13 dòng (1009.8, 1004.3, 1004.8 và 1003.3) có khối lƣợng 100 hạt từ 60g trở lên (chiếm 30,8%); có 11/13 dòng có khối lƣợng 100 hạt từ 50g trở lên (chiếm 84,6%); có 02/16 dòng có khối lƣợng 100 hạt đạt dƣới 50g (chiếm 15,4%). Giống đối chứng Gié Nho Quan có khối lƣợng 100 hạt đạt thấp hơn cả, chỉ đạt 33,6g. Tỷ lệ hạt/quả của dòng 1004.3 cao nhất đạt 73,5%; tiếp đến là dòng 1003.3 đạt 72,5%, thấp nhất là dòng 1010.4 chỉ đạt 63,5%. Trong tổng số 13 dòng nghiên cứu, có 03/13 dòng có tỷ lệ hạt/quả đạt dƣới 70% (chiếm 23,1%); còn lại 10/13 dòng có tỷ lệ hạt/quả đạt trên 70% (chiếm 76,9%). Các giống đối chứng đều có tỷ lệ hạt/quả đạt trên 70%. Về năng suất thực thu của 13 dòng đạt khá cao (36,6-40,5 tạ/ha) và cao hơn năng suất của các giống đối chứng. Dòng 1010.6 có năng suất cao nhất đạt 40,5 tạ/ha, tiếp đến là dòng 0811.10 đạt 39,6 tạ/ha và dòng 1008.9 đạt 39,5 tạ/ha, thấp nhất là dòng 1003.4 đạt 36,6 tạ/ha; các giống đối chứng đều có năng suất thấp hơn các dòng lạc ƣu tú (đạt từ 20,7 tạ/ha đến 32,3 tạ/ha). Từ kết quả đánh giá nhân tạo khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc dòng kháng bệnh và đánh giá đặc tính nông sinh học của 13 dòng lạc ƣu tú cho thấy cả 13 dòng (1003.7, 0811.10, 1010.6, 115 1009.8, 1004.3, 1010.5, 1004.4, 1008.9, 1004.5, 1004.8, 1010.4, 1003.4 và 1003.3) đều có khả năng kháng bệnh HXVK đồng thời có năng suất cao (từ 36,6 tạ/ha đến 40,5 tạ/ha) nên sẽ tiếp tục chọn lọc trong các năm tiếp theo (bảng 3.27). Bảng 3.27. Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc ưu tú (năm 2014) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tên dòng 1003.4 0811.10 1010.5 1004.8 1009.8 1010.4 1004.3 1004.4 1003.7 1004.5 1003.3 1008.9 1010.6 Mức độ Chỉ thị liên kết với tính trạng Năng suất chống chịu kháng bệnh HXVK thực thu bệnh HXVK pPGPseq3F5 GA161 7G2 (tạ/ha) R R MR MS MR MR MR MR MR MR MR MR MR 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 36,6 39,6 36,9 37,6 37,8 38,2 38,4 38,4 38,7 38,7 38,7 39,5 40,5 Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết. 3.3.5. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo và chọn lọc dòng kháng bệnh HXVK bằng chỉ thị phân tử 3.3.5.1. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo Kế thừa các dòng lạc đã đƣợc chọn lọc từ tập đoàn giống lạc các năm trƣớc của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, đề tài đã tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK trên nền lây nhiễm bệnh nhân tạo, chọn lọc các dòng có khả năng kháng bệnh bằng chỉ thị phân tử và triển khai thí nghiệm so sánh chính quy để xác định các dòng có đặc tính tốt nhất từ 13 dòng triển vọng. 116 Kết quả đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo trong 2 năm (2013-2014) với giống đối chứng sản xuất là giống MD7, đối chứng kháng bệnh HXVK là Gié Nho Quan, đối chứng nhiễm bệnh HXVK là giống ICGV3704 đƣợc thể hiện trên bảng 3.28. Bảng 3.28. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh HXVK bằng lây bệnh nhân tạo của các dòng lạc triển vọng (Thanh Trì, năm 2013-2014) STT Tên dòng, giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) Năm 2013 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 19,7 MR 26,4 MR 18,3 MR 16,2 MR 25,4 MR 16,2 MR 14,5 MR 22,7 MR 19,0 MR 26,5 MR 28,4 MR 8,7 R 18,6 MR 21,2 MR 10,1 R 90,5 HS Năm 2014 Tỷ lệ Mức độ bệnh chống chịu (%) bệnh HXVK 22,8 MR 18,3 R 24,8 MR 18,3 R 24,3 MR 13,8 R 13,8 R 25,8 MR 28,4 MR 22,8 MR 19,2 R 22,8 MR 28,4 MR 14,5 MR 12,8 R 100 HS Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình; HS: Nhiễm nặng; ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Kết quả bảng 3.28 cho thấy qua đánh giá bệnh nhân tạo, năm 2013 có 01 dòng (BWP-12) phản ứng với bệnh HXVK ở mức kháng, các dòng còn lại có mức kháng trung bình. Năm 2014, có 05 dòng (BWP-2, BWP-4, BWP-6, BWP-7, BWP11) có mức kháng, các dòng còn lại có mức kháng trung bình. Giống đối chứng Gié Nho Quan phản ứng với bệnh HXVK ở mức kháng, giống MD7 kháng trung bình, giống ICGV3704 nhiễm nặng. 117 3.3.5.2. Xác định dòng lạc triển vọng có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử Kết quả sử dụng 3 chỉ thị liên kết để chọn lọc khả năng kháng bệnh HXVK của 13 dòng lạc triển vọng và 03 giống đối chứng đƣợc thể hiện trên hình ảnh điện di gel polyacrylamide với một số chỉ thị (hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19). a. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử pPGPseq3F5 chọn lọc các dòng lạc triển vọng có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 300 bp Hình 3.17. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên dòng, giống 1: BWP-1, 2: BWP-2, 3: BWP-3, 4: BWP-4, 5: BWP-5, 6: BWP-6, 7: BWP-7, 8: BWP-8, 9: BWP-9, 10: BWP-10, 11: BWP-11, 12: BWP-12, 13: BWP-13, 14: Gié Nho Quan, 15: ICGV3704, 16: BW15. Kết quả trên hình 3.17 ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị pPGPseq3F5 ở kích thƣớc 219 bp thấy rằng trùng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh HXVK Gié Nho Quan (số 14), các dòng có vệt băng tƣơng tự là: BWP-1 (số 1), BWP-3 (số 3), BWP-5 (số 5), BWP-6 (số 6), BWP-7 (số 7), BWP-8 (số 8), BWP-10 (số 10), BWP-11 (số 11), BWP-12 (số 12) và dòng BWP-13 (số 13). Nhƣ vậy sử dụng chỉ thị pPGPseq3F5 chọn đƣợc các dòng BWP-1, BWP-3, BWP-5, BWP-6, BWP-7, BWP-8, BWP-10, BWP-11, BWP-12 và dòng BWP-13 có khả năng kháng bệnh HXVK. b. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử GA161 chọn lọc các dòng lạc triển vọng có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Từ hình 3.18 ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 ở kích thƣớc 219 bp thấy rằng trùng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh HXVK Gié Nho Quan (số 14), các dòng có vệt băng tƣơng tự là: BWP-1 (số 1), 118 BWP-3 (số 3), BWP-5 (số 5), BWP-6 (số 6), BWP-7 (số 7), BWP-8 (số 8), BWP-10 (số 10), BWP-11 (số 11), BWP-12 (số 12), BWP-13 (số 13). Nhƣ vậy sử dụng chỉ thị GA161 chọn đƣợc các dòng BWP-1, BWP-3, BWP-5, BWP-6, BWP-7, BWP-8, BWP-10, BWP-11, BWP-12 và dòng BWP-13 có khả năng kháng bệnh HXVK. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 300 bp Hình 3.18. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị GA161 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs). Tên dòng, giống 1: BWP-1, 2: BWP-2, 3: BWP-3, 4: BWP-4, 5: BWP-5, 6: BWP-6, 7: BWP-7, 8: BWP-8, 9: BWP-9, 10: BWP-10, 11: BWP-11, 12: BWP-12, 13: BWP-13, 14: Gié Nho Quan, 15: ICGV3704, 16: BW15. c. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử 7G2 chọn lọc các dòng lạc triển vọng có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Phân tích kết quả trên hình 3.19 ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 ở kích thƣớc 386 bp thấy rằng trùng với vệt băng của giống đối chứng kháng bệnh HXVK Gié Nho Quan (số 14), các dòng có vệt băng tƣơng tự là: BWP-1 (số 1), BWP-3 (số 3), BWP-4 (số 4), BWP-5 (số 5), BWP-6 (số 6), BWP-7 (số 7), BWP-8 (số 8), BWP-11 (số 11), BWP-12 (số 12) và dòng BWP-13 (số 13). Vì vậy, các dòng này có khả năng kháng bệnh HXVK. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 400 bp Hình 3.19. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR chỉ thị 7G2 với 16 dòng, giống lạc M: thang ADN chuẩn 100 bp (Biolabs); Tên dòng, giống 1: BWP-1, 2: BWP-2, 3: BWP-3, 4: BWP-4, 5: BWP-5, 6: BWP-6, 7: BWP-7, 8: BWP-8, 9: BWP-9, 10: BWP-10, 11: BWP-11, 12: BWP-12, 13: BWP-13, 14: Gié Nho Quan, 15: ICGV3704, 16: BW15. 119 d. Tổng hợp kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các dòng lạc triển vọng có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Tổng hợp kết quả phân tích ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR với 3 chỉ thị (pPGPseq3F5, GA161 và 7G2), kết quả thể hiện ở bảng 3.29. Bảng 3.29. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bệnh HXVK của các dòng lạc triển vọng (Viện Công nghệ Sinh học, năm 2014) Chỉ thị liên kết với tính trạng kháng STT bệnh HXVK Tên dòng, giống pPGPseq3F5 GA161 7G2 1 2 3 BWP-1 BWP-2 BWP-3 1 0 1 1 0 1 1 0 1 4 5 6 BWP-4 BWP-5 BWP-6 0 1 1 0 1 1 1 1 1 7 8 BWP-7 BWP-8 1 1 1 1 1 1 9 10 11 12 13 14 15 16 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) BW15 (ĐCKB) 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 Tổng số 3 0 3 1 3 3 3 3 0 2 3 3 3 3 0 3 Ghi chú: 1: Có chỉ thị liên kết; 0: Không có chỉ thị liên kết; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Từ kết quả bảng 3.29 thấy rằng trong số 13 dòng triển vọng, sử dụng 3 chỉ thị phân tử có 10 dòng mang băng đặc trƣng giống băng của giống đối chứng kháng Gié Nho Quan khi phân tích với cả 3 chỉ thị; 01 dòng (BWP-10) mang băng đặc trƣng của giống đối chứng kháng Gié Nho Quan khi phân tích với cả 2 chỉ thị (pPGPseq3F5 và GA161); 01 dòng (BWP-4) mang băng đặc trƣng giống băng của giống đối chứng 120 kháng Gié Nho Quan với 1 chỉ thị 7G2, còn 02 dòng (BWP-2 và BWP-9) không mang băng đặc trƣng giống băng của giống đối chứng kháng Gié Nho Quan với cả 3 chỉ thị nghiên cứu. 3.3.5.3. Đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của các dòng lạc triển vọng a. Một số đặc điểm hình thái của các dòng lạc triển vọng Một số đặc điểm hình thái của các dòng lạc triển vọng đƣợc trình bày ở bảng 3.30. Bảng 3.30. Một số đặc điểm nông học của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Tên dòng, giống BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan (ĐCKB) ICGV3704 (ĐCNB) Thời gian gieomọc (ngày) 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 Thời Thời gian gian mọcsinh ra hoa trƣởng (ngày) (ngày) 36 120 35 120 35 120 35 120 35 120 36 120 36 120 35 120 35 120 36 120 35 120 35 120 36 120 36 120 36 120 36 120 Chiều cao cây (cm) 29,3 29,2 24,9 45,4 43,8 35,0 35,3 26,7 27,3 29,0 26.3 34,8 33,5 30,5 28,7 39,7 Số cành cấp 1/cây (cành) 4,0 4,2 4,0 4,0 4,0 4,5 4,5 4,0 3,8 4,5 4,0 4,0 4,2 4,3 4,5 4,3 Số cành cấp 2/cây (cành) 3,0 2,5 3,0 2,0 2,3 2,7 2,2 2,0 2,8 3,3 2,6 2,8 2,0 2,5 3,0 1,8 Ghi chú: ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Qua bảng 3.30 cho thấy, các dòng lạc triển vọng và giống đối chứng đều có thời gian từ gieo đến mọc là 18 ngày, thời gian ra hoa của các dòng triển vọng và 121 giống đối chứng bình quân từ 35 đến 36 ngày. Thời gian sinh trƣởng của các dòng triển vọng và giống đối chứng đều là 120 ngày. Về chiều cao cây: dòng BWP-4 và dòng BWP-5 có chiều cao thân chính đạt cao nhất, lần lƣợt là 45,4 cm và 43,8 cm, thấp nhất dòng BWP-3 chỉ đạt 24,9 cm. Về số cành cấp 1/cây, có 3 dòng (BWP-6, BWP-7, BWP-10) có số cành cấp 1/cây đạt cao nhất (4,5 cành); thấp nhất là dòng lạc BWP-9 (3,8 cành). Về số cành cấp 2/cây, dòng BWP-10 có số cành cấp 2/cây đạt cao nhất (3,3 cành); thấp nhất trên giống đối chứng ICGV3704 chỉ đạt 1,8 cành. b. Tình hình bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng Tình hình bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng đƣợc trình bày ở bảng 3.31. Bảng 3.31. Mức độ nhiễm một số bệnh hại chính của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) STT Tên dòng, giống 1 BWP-1 2 BWP-2 3 BWP-3 4 BWP-4 5 BWP-5 6 BWP-6 7 BWP-7 8 BWP-8 9 BWP-9 10 BWP-10 11 BWP-11 12 BWP-12 13 BWP-13 14 MD7 (ĐCSX) 15 Gié Nho Quan (ĐCKB) 16 ICGV3704 (ĐCNB) Bệnh đốm nâu Bệnh đốm đen 3 3 2 2 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 2 2 3 3 2 2 2 3 3 3 2 2 2 3 ĐVT: Điểm Bệnh rỉ sắt 6 4 5 6 5 5 4 6 6 5 5 4 4 5 6 5 Ghi chú: Đối với bệnh rỉ sắt, bệnh đốm nâu và bệnh đốm đen: Điểm 1 (TLB 5-25% diện tích lá bị hại), Điểm 7 (TLB >25-50% diện tích lá bị hại), Điểm 9 (TLB >50% diện tích lá bị hại); ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. Kết quả bảng 3.31 cho thấy đối với bệnh hại lá (đốm nâu, đốm đen, rỉ sắt), tất cả các dòng lạc thí nghiệm đều nhiễm từ nhẹ đến nhiễm trung bình các bệnh hại lá, trong 122 đó mức độ bệnh đốm nâu, đốm đen dao động từ điểm 2- 3, bệnh rỉ sắt nhiễm nặng hơn bệnh đốm nâu, đốm đen (điểm 4 - 6). c. Đánh giá một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng Thông qua các chỉ tiêu về các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu sẽ giúp các nhà chọn giống lựa chọn các dòng, giống lạc tốt theo từng mục đích cụ thể nhƣ số quả chắc/cây, khối lƣợng 100 quả, khối lƣợng 100 hạt, tỷ lệ hạt/quả hay năng suất,... Kết quả thí nghiệm qua 2 năm (2013-2014) đƣợc trình bày ở bảng 3.32. Bảng 3.32. Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tên dòng, giống BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 MD7 (ĐCSX) Gié Nho Quan 15 (ĐCKB) ICGV3704 16 (ĐCNB) CV% LSD0,05 Số quả chắc/cây (quả) Năm Năm 2013 2014 8,9 12,2 6,2 8,5 9,8 10,5 10,0 8,6 7,3 9,2 7,0 11,3 8,4 12,4 6,8 12,3 7,7 12,4 10,1 12,2 9,1 11,3 10,4 14,2 9,8 12,4 9,7 10,4 12,1 16,2 Khối lƣợng Khối lƣợng 100 quả 100 hạt (g) (g) Năm Năm Năm Năm 2013 2014 2013 2014 158,7 148,9 57,5 60,6 130,8 152,8 51,6 60,3 168,4 153,0 56,6 57,9 142,0 122,6 56,8 46,8 138,9 137,9 58,4 54,4 145,2 144,7 56,4 58,8 164,6 167,7 57,1 65,0 143,4 156,1 46,8 60,2 149,3 151,2 46,8 60,1 154,0 159,4 65,8 63,0 172,8 155,0 62,9 60,4 151,5 152,2 58,8 58,6 170,0 167,3 75,0 65,6 145,5 143,4 53,6 51,2 78,1 76,7 35,2 32,3 Tỷ lệ hạt/quả (%) Năm Năm 2013 2014 71,8 71,0 72,2 70,2 75,2 74,0 73,9 70,3 69,4 71,2 71,6 74,6 69,9 73,0 74,5 74,4 76,1 75,2 71,0 70,7 71,1 72,2 70,6 71,8 73,6 73,3 72,3 72,1 75,8 78,9 Năng suất thực thu (tạ/ha) Năm Năm 2013 2014 41,9 37,8 26,1 34,1 35,8 33,2 35,6 30,8 28,0 35,6 28,4 34,6 35,1 36,4 25,8 35,2 25,2 35,0 32,1 35,9 40,1 37,4 31,5 36,3 35,4 35,7 30,8 32,3 21,2 19,7 10,0 11,1 121,0 123,6 37,7 38,4 73,4 75,0 22,1 23,9 6,9 6,6 1,04 1,28 6,5 5,92 5,1 4,74 4,1 5,3 10,04 12,80 - - 5,7 6,5 2,93 3,64 Ghi chú:ĐCSX: Đối chứng sản xuất; ĐCKB: đối chứng kháng bệnh; ĐCNB: đối chứng nhiễm bệnh. 123 Kết quả qua bảng 3.32 cho thấy: Về số quả chắc/cây trung bình 2 năm cao nhất là dòng BWP-12 đạt 12,3 quả, tiếp đến là dòng BWP-10 đạt 11,2 quả/cây và dòng BWP-13 đạt 11,1 quả/cây, thấp nhất là dòng BWP-2 chỉ đạt 7,4 quả chắc/cây. Các giống đối chứng đều có số quả chắc/cây trung bình 2 năm đạt trên 10 quả/cây, cao nhất là giống Gié Nho Quan đạt 14,2 quả chắc/cây. Khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm cao nhất là dòng BWP-13 đạt 168,7g, tiếp đến là dòng BWP-7 đạt 166,2g và dòng BWP-11 đạt 163,9g, thấp nhất là dòng BWP-4 chỉ đạt 132,3g, các giống đối chứng có khối lƣợng 100 quả trung bình 2 năm đạt dƣới 150g, trong đó giống Gié Nho Quan thấp nhất chỉ đạt 77,4g. Về khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm cao nhất là dòng BWP-13 đạt 70,3g, tiếp đến là dòng BWP-10 đạt 64,4g và dòng BWP-11 đạt 61,7g, thấp nhất là dòng BWP-4 chỉ đạt 51,8g, các giống đối chứng có khối lƣợng 100 hạt trung bình 2 năm đạt thấp, trong đó giống Gié Nho Quan thấp nhất chỉ đạt 33,8g. Tỷ lệ hạt/quả là chỉ tiêu khá quan trọng vừa thể hiện tỷ lệ nhân cao hoặc thấp và gián tiếp nói lên mức độ vỏ của quả mỏng hay dày. Tỷ lệ hạt/quả của các dòng đạt từ 70,3% đến 75,7% tức là vỏ quả tƣơng đối mỏng, trong đó cao nhất là dòng BWP-9 đạt 75,7%, thấp nhất là dòng BWP-2 đạt 70,3%. Các giống đối chứng có tỷ lệ hạt/quả trung bình 2 năm đạt trên 72% trở lên, đặc biệt trong đó giống đối chứng Gié Nho Quan có tỷ lệ hạt/quả cao hơn cả là 77,4%. Về năng suất thực thu trung bình 2 năm cao nhất là dòng BWP-1 đạt 39,9 tạ/ha, tiếp đến là dòng BWP-11 đạt 38,8 tạ/ha và dòng BWP-7 đạt 35,8 tạ/ha, thấp nhất là 02 dòng (BWP-2 và BWP-9) có năng suất thực thu trung bình 2 năm cùng đạt 30,1 tạ/ha. Giống đối chứng ICGV3704 chỉ đạt 23,0 tạ/ha và giống Gié Nho Quan chỉ đạt 20,5 tạ/ha. Kết hợp kết quả đánh giá bệnh nhân tạo và chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, có 04 dòng lạc triển vọng (BWP-1, BWP-7, BWP-11, BWP-13) vừa có khả năng kháng bệnh, vừa có năng suất cao (35,7-37,8 tạ/ha) (bảng 3.33). 124 Bảng 3.33. Khả năng kháng bệnh HXVK và năng suất thực thu của các dòng lạc triển vọng (năm 2013-2014) STT Mức độ chống Chỉ thị liên kết với tính Năng suất chịu bệnh trạng kháng bệnh thực thu HXVK HXVK (tạ/ha) Tên dòng Năm Năm pPGPse 2013 2014 q3F5 GA161 7G2 Năm Năm 2013 2014 1 BWP-13 MR MR 1 1 1 35,4 35,7 2 BWP-7 MR R 1 1 1 35,1 36,4 3 BWP-11 MR R 1 1 1 40,1 37,4 4 BWP-1 MR MR 1 1 1 41,9 37,8 Ghi chú: R: Kháng; MR: Kháng trung bình. 1: Có chỉ thị liên kết. Từ các kết quả trên, đề tài đã chọn 2 dòng lạc BWP-1 và BWP-11 có năng suất cao nhất trong số các dòng so sánh và hơn giống đối chứng, có khả năng kháng bệnh HXVK trên nền lây nhiễm nhân tạo, đƣợc chọn lọc bằng 3 chỉ thị liên kết với khả năng kháng bệnh HXVK để tham gia vào mạng lƣới khảo nghiệm giống Quốc gia và đặt tên chính thức cho dòng BWP-1 là giống L28 và dòng BWP-11 là giống L29. Giống lạc L28 Cây và củ giống lạc L29 Hình 3.20. Giống lạc L28 và L29 (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) 125 3.3.6. Kết quả khảo nghiệm Quốc gia giống lạc triển vọng Kết quả khảo nghiệm các giống lạc ở phía Bắc vụ Xuân năm 2014 đƣợc thực hiện tại Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia. 3.3.6.1. Tình hình bệnh hại chính của các giống lạc triển vọng khảo nghiệm Tình hình bệnh hại chính của các giống lạc triển vọng khảo nghiệm Quốc gia trong vụ Xuân năm 2014 đƣợc trình bày ở bảng 3.34. Kết quả thu đƣợc, các giống lạc L21, L28, L29, Q2A0 và Q2A3 bị nhiễm bệnh rỉ sắt ở mức nhẹ (điểm 1-3), các giống còn lại bị nhiễm ở mức trung bình (điểm 3-5). Hầu hết các giống bị bệnh đốm nâu hại nhẹ (điểm 1-3), hai giống L29 và CNC1 bị bệnh đốm nâu ở mức trung bình (điểm 3-5). Bệnh đốm đen, các giống bị nhiễm bệnh đốm đen ở mức nhẹ (điểm 1-3), riêng giống CNC1 nhiễm ở mức trung bình (điểm 3-5). Bảng 3.34. Tình hình bệnh hại chính và khả năng chịu hạn của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) STT Tên giống Rỉ sắt (điểm) Đốm nâu (điểm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L14 (Đ/c) L21 L22 L28 L29 CNC1 CNC3 CNC4 Q2A0 Q2A3 Q2A6 3-5 1-3 3-5 1-3 1-3 3-5 3-5 3-5 1-3 1-3 3-5 1-3 1-3 1-3 1-3 3-5 3-5 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 Đốm đen (điểm ) 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 3-5 1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 Héo xanh vi khuẩn (điểm) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Thối Thối Thối Chịu đen cổ trắng quả hạn rễ thân (điểm) (điểm) (điểm) (điểm) 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 1-2 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 1 1 1 2-3 Ghi chú: Đối với bệnh HXVK, bệnh thối đen cổ rễ, bệnh thối trắng thân và bệnh thối quả: Điểm 1 (TLB 50%). Đối với bệnh rỉ sắt, bệnh đốm nâu và bệnh đốm đen: Điểm 1 (TLB 5-25% diện tích lá bị hại), Điểm 7 (TLB >2550% diện tích lá bị hại), Điểm 9 (TLB >50% diện tích lá bị hại). 126 Tất cả các giống khảo nghiệm có tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn, bệnh thối đen cổ rễ, bệnh trắng thân, bệnh thối quả ở mức nhẹ (điểm 1); khả năng chịu hạn: Các giống khảo nghiệm có khả năng chịu hạn khá (điểm 2-3), riêng giống L29 có khả năng chống chịu khá nhất (điểm 1-2). 3.3.6.2. Năng suất của các giống lạc triển vọng được khảo nghiệm Năng suất của các giống lạc triển vọng khảo nghiệm trong vụ Xuân năm 2014 đƣợc trình bày ở bảng 3.35. Bảng 3.35. Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) Năng suất tại các địa điểm khảo nghiệm (tạ/ha) STT Tên giống Hà Nội Từ Văn Liêm Điển Nghệ Hải Vĩnh Thái An Dƣơng Phúc Bình Trung bình 1 L14 (đối chứng) 32,9 33,6 29,2 30,4 16,4 34,5 28,5 2 L21 36,9 29,0 30,8 29,1 16,4 37,9 28,4 3 L22 38,2 32,7 32,3 31,3 16,9 45,8 30,3 4 L28 36,9 36,4 33,8 29,1 27,1 47,3 32,7 5 L29 35,1 35,7 28,2 31,6 28,9 43,6 31,9 6 CNC1 36,9 26,1 25,7 30,3 13,8 40,4 27,1 7 CNC3 44,0 30,6 29,2 30,1 19,1 37,0 30,6 8 CNC4 34,7 24,4 31,3 27,6 27,6 41,7 29,1 9 Q2A0 25,3 - 30,3 27,2 16,0 - 24,7 10 Q2A3 30,7 - 28,2 30,2 15,6 - 26,1 11 Q2A6 30,2 34,3 26,1 27,6 17,8 40,6 27,2 CV% 5,5 5,1 5,6 5,2 6,0 6,1 LSD0,05 3,27 1,59 2,84 2,64 2,01 2,50 - Số liệu thu đƣợc thể hiện trên bảng 3.35 cho thấy, giống lạc L28 và L29 tại các điểm khảo nghiệm đều có năng suất cao hơn so với giống đối chứng L14 ở mức có ý nghĩa tại các điểm Hà Nội, Hải Dƣơng, Vĩnh Phúc và Thái Bình. Giống L28 có năng suất cao nhất so với các giống khảo nghiệm ở các địa điểm Từ Liêm, Văn Điển (Hà 127 Nội), Nghệ An và Thái Bình. Đặc biệt tại Thái Bình, năng suất 02 giống L28 và L29 cao vƣợt trội lần lƣợt đạt 43,6 tạ/ha và 47,3 tạ/ha. Tính trung bình tại các điểm khảo nghiệm, các giống lạc L28 và L29 đều có năng suất lần lƣợt là 32,7 tạ/ha và 31,9 tạ/ha, còn các giống lạc khảo nghiệm khác có năng suất trung bình thấp hơn từ 24,7 tạ/ha đến 30,6 tạ/ha, trong đó giống đối chứng L14 có năng suất đạt trung bình đạt 28,5 tạ/ha. Có 03/6 điểm khảo nghiệm đạt năng suất cao (từ 35,1 đến 47,3 tạ/ha). Nhƣ vậy qua khảo nghiệm Quốc gia cho thấy 02 giống lạc L28 và L29 có khả năng chống chịu bệnh HXVK và có năng suất cao hơn so giống đối chứng và so với các giống khảo nghiệm khác. 128 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Trong vụ Xuân năm 2012, bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum gây hại khá phổ biến ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam với tỷ lệ từ 2,7% đến 23,3%. Bệnh hại phổ biến và gây hại nặng trên cây lạc trồng ở vùng đất đồi gò (tỷ lệ bệnh 21,6%) và gây hại khá nặng trên đất chuyên màu (tỷ lệ bệnh 12,3%); bệnh nhẹ hơn khi lạc trồng trên các đất thịt nhẹ, đất luân canh với lúa nƣớc (tỷ lệ bệnh 2,7%). 1.2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của 61 isolate vi khuẩn R. solanacearum thu thập từ một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam xác định đƣợc 61 isolate vi khuẩn đều thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1, trong đó có 80,3% isolate thuộc biovar 3 và 19,7% isolate thuộc biovar 4. Bằng phân tích phân tử RAPD, các isolate vi khuẩn phân tích đƣợc chia thành 2 nhóm chính (nhóm I và nhóm II) và khá gần nhau về mặt di truyền (với hệ số tƣơng đồng dao động từ 0,74 đến 0,99), trong đó nhóm I chiếm 5,4%, nhóm II chiếm 94,6% và chia làm 10 nhóm phụ khác nhau. 1.3. Phân tích sự phân bố của isolate vi khuẩn R. solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc đã xác định đƣợc vi khuẩn R. solanacearum khá đa dạng ở Hà Nội (có cả biovar 3, biovar 4 và 7 nhóm phụ về đa dạng di truyền); đa dạng ở mức trung bình tại Ninh Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Hòa Bình (có 2 loại biovar 3 và biovar 4, có 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền); Bắc Ninh, Bắc Giang (có 2 loại biovar 3 và biovar 4, có 1 nhóm phụ về đa dạng di truyền); ít đa dạng hơn ở Hà Tĩnh (chỉ có biovar 3 và 2 nhóm phụ về đa dạng di truyền). 1.4. Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn và đặc điểm nông học tập đoàn mẫu giống lạc, xác định có 02/63 mẫu giống kháng cao (chiếm 3,2%), 07/63 mẫu giống kháng (chiếm 11,1%), 22/63 mẫu giống kháng trung bình (chiếm 34,9%), 19/63 mẫu giống nhiễm trung bình (chiếm 30,1%), 10/63 mẫu giống nhiễm (chiếm 15,9%) và 03/63 mẫu giống nhiễm nặng (chiếm 4,8%). Kết hợp ứng dụng 3 chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính 129 trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn đã chọn lọc đƣợc 26 mẫu giống lạc có khả năng kháng bệnh HXVK (từ kháng trung bình đến kháng cao, liên kết với chỉ thị phân tử) để làm vật liệu chọn tạo giống kháng bệnh. 1.5. Kết hợp đánh giá bệnh nhân tạo với chọn lọc bằng 3 chỉ thị phân tử SSR (pPGPseq3F5, GA161 và 7G2) liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK và đánh giá đặc điểm nông học của các dòng lai, xác định đƣợc 7 dòng từ tổ hợp lai đơn có năng suất cao (35,7 tạ/ha đến 41,6 tạ/ha); 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi quy có năng suất cao (35,4 tạ/ha đến 40,6 tạ/ha); 13 dòng lạc ƣu tú có năng suất cao (36,6 tạ/ha đến 40,5 tạ/ha) vừa có khả năng kháng bệnh HXVK mức kháng trung bình đến kháng và năng suất cao để tiếp tục chọn lọc trong những năm tiếp theo. 1.6. Từ 13 dòng lạc triển vọng, chọn đƣợc 4 dòng (BWP-1, BWP-7, BWP-11 và BWP-13) vừa có khả năng kháng bệnh HXVK (kháng trung bình đến kháng), vừa có năng suất cao (35,7-37,8 tạ/ha), trong đó có 2 dòng (BWP-1 và BWP-11) đƣợc đặt tên chính thức là giống L28 và giống L29 tƣơng ứng, có khả năng kháng bệnh, năng suất cao nhất (37,4-37,8 tạ/ha) và có chất lƣợng tốt, tỷ lệ nhân cao (71,072,2%) để khảo nghiệm Quốc gia. 1.7. Kết quả khảo nghiệm Quốc gia đã xác định 2 giống lạc triển vọng L28 và L29 vừa có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, vừa có năng suất cao hơn đối chứng ở mức có ý nghĩa, có 3/6 điểm khảo nghiệm đạt năng suất cao (từ 35,147,3 tạ/ha) để phát triển trong sản xuất. 2. Đề nghị 2.1. Sử dụng nguồn vật liệu 26 mẫu giống lạc trong tập đoàn cùng các dòng lạc triển vọng và 3 chỉ thị phân tử (pPGPseq3F5, GA161 và 7G2) liên kết với tính trạng kháng bệnh HXVK trong chọn tạo giống lạc kháng bệnh. 2.2. Tiếp tục chọn lọc, phát triển dòng lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn từ 07 dòng từ tổ hợp lai đơn; 14 dòng lạc từ các tổ hợp lai hồi; 13 dòng lạc ƣu tú có khả năng kháng bệnh HXVK đã chọn lọc đƣợc. 2.3. Thử nghiệm phát triển các giống lạc triển vọng L28 và L29 ở các vùng sinh thái về khả năng kháng bệnh, tính thích ứng và khả năng nhân rộng, đặc biệt là ở các địa phƣơng thƣờng bị bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại. 130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Ngọ Văn Ngôn, Nguyễn Văn Viết, Hà Viết Cƣờng, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Vân (2014), “Xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc ở miền Bắc Việt Nam” Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 6/2014, tr. 108-115. 2. Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Thị Vân, Lê Thị Bích Thủy, Nguyễn Mạnh Hùng, Ngọ Văn Ngôn, Ngô Thị Thùy Linh (2014), “Kết quả nghiên cứu xác định biovar và đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 7/2014, tr. 9-15. 3. Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Thị Vân, Lê Thị Bích Thủy, Hà Viết Cƣờng, Nguyễn Mạnh Hùng, Ngọ Văn Ngôn, Nguyễn Văn Thắng, Nguyễn Xuân Thu, Ngô Thị Thùy Linh (2015), “Đánh giá khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith tập đoàn giống lạc bằng lây nhiễm nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử SSR”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 2/2015, tr. 49-56. 4. Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Văn Thắng, Nguyễn Thị Vân, Lê Thị Bích Thủy, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Xuân Thu, Ngô Thị Thùy Linh, Ngọ Văn Ngôn, Tạ Hồng Lĩnh (2015), “Kết quả nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, chuyên đề “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp”, tháng 6/2015, tr. 45-52. 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO A/ Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2010), Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng, QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành tại Thông tƣ số 71/2010/TT-BNNPTNT, ngày 10 tháng 12 năm 2010. 2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2011), Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống lạc, QCVN 01-57: 2011/BNNPTN ban hành Thông tƣ số 48 /2011/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng 7 năm 2011. 3. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam (Phan Thị Thúy Hiền dịch), ACIAR, 210 trang. 4. Lƣu Minh Cúc (2009), Sử dụng chỉ thị vi vệ tinh trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm lá muộn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) phục vụ công tác chọn tạo giống, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 5. Đỗ Tấn Dũng (1995), “Tính phổ biến của bệnh vi khuẩn gây bệnh héo rũ (bacterial wilt) một số cây trồng cạn vùng Hà Nội và phụ cận”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 2: 38 - 42. 6. Đỗ Tấn Dũng (1999), Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith. hại một số cây trồng ở ngoại thành Hà Nội và vùng phụ cận, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 181 trang. 7. Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản, Nguyễn Thị Chinh (2006), “Nghiên cứu sử dụng Bacillus nhằm nâng cao năng suất và hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn đối với cây lạc” Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 10(2): 16-21. 8. Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Liễu (1993), “Một số kết quả nghiên cứu bệnh hại lạc và xác định nguồn gen chống chịu bệnh héo ở miền Bắc Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Bảo vệ thực vật, 24 - 25 tháng 3, 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 16-17. 9. Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Liễu, Phạm Huy Chƣơng (1995), “Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn”, Kết quả nghiên cứu khoa học cây đậu đỗ 1991 - 1995, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 133-137. 10. Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Liễu (1997), “Kết quả nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum ở miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 6: 27-31. 132 11. Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Viết (2002), “Giống lạc MD7 kháng bệnh héo xanh vi khuẩn. Tuyển tập các công trình khoa học kỹ thuật nông nghiệp 2001-2002”, Bộ Nông nghiệp và PTNT, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, 2002, tr. 79-86. 12. Izrainxki V.P. (1988), Hướng dẫn nghiên cứu bệnh vi khuẩn thực vật (Hà Minh Trung và Nguyễn Văn Hành dịch), NXB Nông nghiệp Hà Nội và NXB Matxcova, 260 trang. 13. Lê Nhƣ Kiểu, Trần Quang Minh, Lê Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Huân (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacaerum gây bệnh héo xanh lạc và vừng” Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 48(3); 33-42. 14. Kiraly Z., Klement Z., Solymosy và Voros J. (1983), Những phương pháp nghiên cứu bệnh cây (Vũ Khắc Nhượng và Hà Minh Trung dịch), NXB Nông nghiệp Hà Nội, 148 trang. 15. Nguyễn Văn Liễu, Nguyễn Xuân Hồng, Trần Đình Long, và Mehan, V.K. (1995), “Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở miền Bắc Việt Nam và chiến lƣợc phòng chống”, Kết quả nghiên cứu khoa học cây đậu đỗ 1991 - 1995, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 138-141. 16. Nguyễn Văn Liễu (1998), “Xác định nguồn gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trong tập đoàn các giống lạc hiện có ở Việt Nam và bước đầu sử dụng chúng trong công tác chọn giống chống bệnh”, Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. 17. Vũ Văn Liết (2009), Thí nghiệm và phân tích thống kê nghiên cứu di truyền chọn giống cây trồng, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 18. Nguyễn Thị Ly, Phan Bích Thu (1991), “Một số kết quả nghiên cứu bệnh vi khuẩn héo xanh hại lạc”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 6: 14 - 16. 19. Nguyễn Thị Ly, Phan Bích Thu (1993), “Nguyên nhân gây bệnh chết héo lạc ở miền Bắc Việt Nam”, Báo cáo khoa học tại Hội nghị Khoa học Bảo vệ thực vật 24 - 25 tháng 3, 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1993, tr. 15-16. 20. Mehan V.K., Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Ly (1991), “Kết quả điều tra xác định nguyên nhân gây hiện tƣợng chết ẻo lạc và đậu đỗ ở Việt Nam”, Tiến bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 105 - 109. 21. Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Hài, Lê Duy Thành, Trần Văn Dƣơng, Nguyễn Văn Thắng (2005), “Đa hình genome tập đoàn mẫu giống lạc có phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn bằng chỉ thị phân tử SSR” Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 - Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1321 - 1324. 22. Đinh Thị Phòng, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thị Yến (2008), “Đa dạng ADN genome các chủng vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum) gây bệnh héo xanh cây lạc bằng kỹ thuật RADP”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 6: 43 - 50. 133 23. Lê Lƣơng Tề (1997a), Giáo trình bệnh cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1997. 24. Lê Lƣơng Tề (1997b), “Ảnh hƣởng của một số yếu tố sinh thái đối với bệnh héo rũ vi khuẩn hại lạc ở vùng đất bạc màu trung du Bắc bộ”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 4: 5 - 8. 25. Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng (2010), “Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc vùng Hà Nội, phụ cận và biện pháp phòng chống”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 8(5): 772-779. 26. Đoàn Thị Thanh, Nguyễn Xuân Hồng, Vũ Triệu Mân (1995), “Nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas solanacearum trên một số cây ký chủ ở miền Bắc Việt Nam”, Các công trình của Nghiên cứu sinh, quyển 5, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 273 - 278. 27. Đặng Thái Thuận, Trần Huệ Tâm, Võ Thị Phƣơng (1968), “Bệnh chết ẻo lạc ở Nghệ An”, Tạp chí KHKT Nông nghiệp, 78: 338-343. 28. Nguyễn Văn Tuất (1997), “Phƣơng pháp chẩn đoán, giám định nấm và vi khuẩn gây bệnh hại cây trồng”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Nguyễn Văn Tuất và cộng sự (2007), “Nghiên cứu tính đa dạng của quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh Rastonia solanacearum Smith hại vừng, lạc”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2007- Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Đại học Quy Nhơn, NXB Khoa học và kỹ thuật, tháng 10/2007, tr. 611-615. 30. Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Huy Chung, Lê Tuấn Tỳ, Nguyễn Mạnh Hùng, Đinh Thị Phƣợng, Đỗ Tiến Phát (2008), “Phân tích đa dạng di truyền một số isolate vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc (Ralstonia solanacearum Smith) và tuyển chọn giống kháng bệnh”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 2: 44-49. 31. Nguyễn Thị Vân, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn VănTuất, Lê Tuấn Tú, Nguyễn Xuân Hồng (2013), “Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật canh tác và mô hình sản xuất thử giống lạc mới TK10 năng suất cao và chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith” Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất, ngày 5/9/2013 tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, trang 999-1008. 32. Nguyễn Văn Viết và Phan Duy Hải (2010), “Nghiên cứu xác định bệnh hại chủ yếu và sự tích lũy nguồn bệnh gây chết cây trong canh tác lạc trên đất dốc đồi núi và khả năng hạn chế bằng quản lý dịch hại tổng hợp”, Hội thảo Quốc gia bệnh cây và Sinh học phân tử, NXB Nông nghiệp, tr. 85-89. 33. Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2002), “Thành phần nòi, biovar vi khuẩn gây héo xanh cây trồng cạn”, Hội thảo Quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử. NXB Nông nghiệp, 2002, tr. 64 - 66. 34. Tổng cục Thống kê (2013), “Số liệu thống kê nông nghiệp, lâm nghiệp và thủy sản” http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=390vàidmid=3vàItemID=12919 134 B) Tài liệu tiếng Anh 35. Agrios G.N. (2008), Plant pathology, Amsterdam, Elsevier Academic Press, pp. 647-649. 36. Allen C., Prior P. and Hayward A.C. (2005), “Bacterial wilt disease and the RS species complex” The American Phytopathological Society, 3340 Pilot Knob Road, St. Paul, Minnesota, U.S.A. 37. Anitha K., Gunjotikar G.A., Chakrabarty S.K., Singh S.D., Sarath B.B., Rao P. and Varaprasad K.S. (2003), “Interception of bacterial wilt, Burkholderia solanacearum in groundnut germplasm imported from Australia”, Journal of Oilseeds Research, 20: 101-104. 38. Barkley N.A., Dean R.E., Pittman R.N., Wang M.L., Holbrook C.C. and Pederson G.A. (2007), “Genetic diversity of cultivated and wild-type peanuts evaluated with M13-tailed SSR markers and sequencing” Genetic Research, 89: 93-106. 39. Bera S.K., Chandrashekar A.B., Patel S., Sojitra V.K. and Maurya A. (2014), “Identification of stable sources for surrogate traits in Arachis glabrata and marker-trait association for tolerance to water deficit stress”, Turkish Journal of Botany, 38: 309-324. 40. Bo-Shou L., Yong L., Dong L., Sheng-Yu W., Jia-Quan H., Xiao-Ping R., HuiFang J. and Li-Ying Y. (2010), “Germplasm with high oil content and resistance to Aspergillus flavus and bacterial wilt developed from peanut recombinant inbred lines”, Acta Agronomica Sinica, 36(8): 1296-1301. 41. Buddenhagen I.W. and Kelman A. (1964), “Biological and physiologycal aspect pf bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum” Annual Review of Phytopathology, 2: 203-230. 42. Budiman M.A., Jones J.I.T., Citek R.W., Warek U., Bedell J.A. and Knapp S.J. (2006), “Methylation-filtered and shotgun genomic sequences for diploid and tetraploid peanut taxa”, http://www.ncbi. nlm.nih.gov (truy cập ngày 8 tháng 8 2014). 43. Burow M.D., Simpson C.E., Starr J.L. and Paterson A.H. (2001), “Transmission genetics of chromatin from a synthetic amphiploid in cultivated peanut (A. hypogaea L.): broadening the gene pool of a monophyletic polyploid species”, Genetics, 159: 823 - 837. 44. Busolo-Bulafu C.M,. Mehan V.K. and Hayward A.C. (1993), “Present status of groundnut bacterial wilt research in Uganda”, Groundnut bacterial wilt. Mehan VK (ed.) Proceedings of the Second Working Group Meeting, 2 Nov. 1992, Tainan, Taiwan: Asian Vegetable Res. & Developm. Center, pp. 11-14. 45. Butranu W., Yinasawapun S. and Srithongchai W. (1994), “Status of groundnut bacterial wilt research in Thailand”, Bacterial wilt in Asia, Proceedings of the Third working Group meeting, 4 - 5 July 1994, ICRISAT, India, pp. 129 - 133. 135 46. Chandrashekara K.N. and Prasnnakumar M.K. (2010), “New host plants for Ralstonia solanacearum from India”, Plant Pathology, 59(6): 11 - 78. 47. Chen B.Y., Jiang H.F, Ren X.P., Liao B.S. and Huang J.Q. (2008), “Identification and molecular traits of Arachis species with resistance to bacterial wilt”, Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 23(3): 170 - 175. 48. Chuang T.W., Xiu Z.W., Yeu Y.T. Dian X.C., Feng G.C., Jian C.Z. and Shan L.Y. (2009), “Field screenging of groundnut genotypes for resistence to bacterial wilt in Shandong province in China”, Jounrnal of SAT Agricultural, 7: 1 - 5. 49. Denny T.P. (2006), “Plant pathogenic Ralstonia species”, Plant associated bacteria, pp. 573-644, Springer, Dordrecht, the Netherlands. 50. Ding Y.F., Wang C.T., Tang Y.Y., Wang X.Z., Wu Q., Hu D.Q., Yu H.T., Zhang J.C., Cui F.G., Song G.S., Gao H.Y., Yu S.L. (2012), “Isolation and analysis of differentially expressed genes from peanut in response to challenge with Ralstonia solanacearum”, Electronic Journal of Biotechnology, 15(5): 2-10. 51. Dwivedi S.L., Crouch J.H., Nigam S.N., Ferguson M.E. and Paterson A.H. (2003), “Molecular breeding of groundnut for enhanced productivity and food security in the semi- arid tropics: opportunities and challenges”, Advances in Agronomy, 80: 153-221. 52. FAO (2013), FAOSTAT database, http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx 53. Fegan M. and Prior P. (2005), “How complex is the „Ralstonia solanacearum species complex‟?”, Bacterial wilt the disease and the Ralstonia solanacearum species complex (C. Allen, P. Prior, A.C. Hayward, ed.), The American Phytopathological Society, St. Paul, MN, USA, pp. 449-462. 54. Ferguson M.E., Burow M.D., Schultz S.R., Bramel P.J., Paterson A.H., Kresovich S. and Mitchell S. (2004), “Microsatellite identification and characterization in peanut (A. hypogaea L.)”, Theoretical and Applied Genetics, 108: 1064-1070. 55. Garcia G.M., Stalker H.T. and Kochert G. (1995), “Introgression analysis of an interspecific hybrid population in peanuts (Arachis hypogaea L.) using RFLP and RAPD markers”, Genome, 38: 166-176. 56. Gautami B., Ravi K., Nasaru M.L., Hoisington D.A. and Varshney R.K. (2009), “Nouvel set of groundnut SSR makers for germplasm annalyis and interspecific transferability”, International Journal of Intergrative Biology, 7(2): 100-106. 57. Genin S. and Denny T.P. (2012), “Pathogenomics of the Ralstonia solanacearum species complex”, Annual Review of Phytopathology, 50: 67-89. 136 58. Gillings M. and Fahy P. (1993), “Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum biovar 2 and N2 assessed using restriction endoglucanase analysis of total genomic DNA”, Plant Pathology, 42: 744-753. 59. Gimenes M.A., Hoshino A.A., Barbosa A.V., Palmieri D.A. and Lopes C.R. (2007), “Characterization and transferability of microsatellite markers of the cultivated peanut (Arachis hypogaea)”, BMC Plant Biology, 7: 9-21. 60. Goswami B.R., Kamdar J.H. and Bera S.K. (2013), “Molecular diversity and association of simple sequence repeat markers with kernel mass in cultivated groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Autralasian Journal of Crop Science, 7(8):1152-1159. 61. Guo B.Z., Chen X.P., Hong Y.B., Liang X.Q., Dang P., Brenneman T., Holbrook C.C. and Culbreath A. (2009), “Analysis of gene expression profiles in leaf tissues of cultivated peanuts and development of EST-SSR markers and gene discovery”, International Journal of Plant Genomics, 3: 1 - 14. 62. Halward T.M., Stalker H.T., LaRue E.A. and Kochert G. (1991), “Genetic variation detectable with molecular markers among unadapted germplasm resources of cultivated peanut and wild species”, Genome, 34: 1013 - 1020. 63. Halward T.M., Stalker H.T and Kochert G. (1993), “Development of an RFLP map in diploid peanut species” Theoretical and Applied Genetics, 87: 379 - 384. 64. Hayward A.C. (1964), “Characteristics of Pseudomonas solanacerarum”, Journal of Applied Bacteriology, 27: 265 - 277. 65. Hayward A.C. (1990), “Diagnosis, distribution and status of groundnut bacterial wilt”, ACIAR Proceedings No 31, pp. 12 - 17. 66. Hayward A.C. (1994), “The hosts of Pseudomonas solanacearum”, CAB International, p. 9-24. 67. Hayward A.C. (1995a), “Phenotypic methods for the differentiation of Pseudomonas solanacearum”, Biovar and supplementary observations, Intechniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum and for resistance screening against groundnut bacterial wilt, Edited by V.K. Mehan and D.McDonal, ICRISAT, India, p. 27-28. 68. Hayward A.C. (1995b), “Systematics and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria”, Horita M., Tsuchiya K. (eds). Genetic diversity of Japanese strains of Ralstonia solanacearum, Phytopathology, 91: 399-407. 69. He L.Y, Sequera L. and Kelman A. (1983), “Characteristics of strains of Pseudomonas solanacearum from China”, Plant Disease, 67: 1357 - 1362. 70. He L.Y. (1986), “Bacterial wilt in the People‟s republic of China” Bacterial wilt, ACIAR Proceedings, No 13, pp. 40 - 48. 137 71. He L.Y. (1990), “Control of bacterial wilt of groundnut in China with emphasis on cultural and biological methods”, Bacterial wilt of groundnut, ACIAR Proceedings, No 31, pp. 20 - 25. 72. He G., Meng R., Newman M., Gao G., Pittman R.N. and Prakash C.S. (2003), “Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.)”, BMC Plant Biology, 3: 3-9. 73. He G., Meng R., Gao H., Guo B., Gao G., Newman M., Pittman R.N. and Prakash C.S. (2005), “Simple sequence repeat markers for botanical varieties of cultivated peanut (Arachis hypogaea L.)”, Euphytica, 142: 131-136. 74. Holbrook C.C., Akins P.O., Chu Y.and Guo B. (2011), “Impact of molecular genetic research on peanut cultivar development”, Agronomy, 1: 3-17. 75. Hong Y.B., Liang X.Q., Chen X.P., Liu H.Y.; Zhou G.Y., Li S.X. and Wen S.J. (2008), “Construction of genetic linkage map based on SSR markers in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Agricultural Sciences in China, 7(8): 915 - 921. 76. Hong Y.B., Chen X., Liang X., Liu H., Zhou G., Li S., Wen S., Holbrook C.C. and Gou B. (2010), “A SSR-based composite genetic linkage map for the cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) genome”, BMC Plant Biology, 10: 17. 77. Hopkins M.S., Casa A.M., Wang T., Mitchell S.E., Dean R.E., Kochert G.D. and Kresovich S. (1999), “Discovery and characterization of polymorphic simple sequence repeats (SSRs) in peanut”, Crop Science, 39: 1243 - 1247. 78. Jiang H.F., Liao B., Xiaoping R., Yong L., Mace E., Tingdong F. and Crouch J.H. (2007a), “Comparative assessment of genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) genotypes with various levels of resistance to bacterial wilt through SSR and AFLP analyses”, Journal of Genetics and Genomics, 34(6): 544 - 554. 79. Jiang H.F., Chen B.Y., Ren X.P., Liao B.S., Lei Y., Fu T.D., Ma C.Z.,Mace E. and Crouch J.H. (2007b), “Identification of SSR markers linked to bacterial wilt resistance of peanut with RILs”, Chinese Journal of Oil Crop Science, 29(1): 26-30. 80. Kelman A. (1954), “The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium” Phytopathology, 44: 639-695. 81. Kelman A., Hartman C. L. and Hayward A.C. (1994), “Introduction in bacterial wilt”, Hayward A.C. and Hartman G.L. (eds), CAB International Wallingford, UK, pp. 1-5. 82. Kochert G.D., Halward T., Branch W.D., Simpson C.E. (1991), “RFLP variability in peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars and wild species”, Theoretical and Applied Genetics, 8(5): 565 - 570. 138 83. Koilkonda P., Sato S., Tabata S., Shirasawa K., Hirakawa H., Sakai H., Sasamoto S., Watanabe A., Wada T., Kishida Y., Tsuruoka H., Fujishiro T., Yamada M., Kohara M., Suzuki S., Hasegawa M., Kiyoshima H. and Isobe S. (2012), “Large-scale development of expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers and diversity analysis in Arachis spp”, Molecular Breeding, 30(1): 125-138. 84. Kumari V., Gowda M.V.C. and Bhat R. (2009), “Molecular characterization of induced mutants in groundnut using random amplified polymorphic DNA markers”, Karnataka Journal of Agricultural Sciences, 22(2): 276-279. 85. Lam K.Y. and Hamidah S. (1995), “Status of groundnut bacterial wilt research in Malaysia”, Bacterial wilt in Asia, Proceedings of the Third working Group meeting, 4 - 5 July 1994, ICRISAT, India. 86. Li Y.C., Korol A.B., Fahima T. and Nevo E. (2004), “Microsatellites within genes: structure, function, and evolution”, Molecular Biology and Evolution, 21: 991 - 1007. 87. Liao B.S. (2005a), “A broad review and perspectives on breeding for resistance to bacterial wilt”, Bacterial wilt disease and the Ralstonia solanacearum species complex, p. 225-238, America Phytopathological Society. 88. Liao B.S., Liang X.Q., Jiang H.F., Lei Y., Shan Z.H., and Zhang X.Y. (2005b), “Progress on genetic enhancement for resistance to groundnut bacterial wilt in China”, Bacterial wilt disease and the Ralstonia solanacearum species complex, p. 239-246, America Phytopathological Society. 89. Lin C.H., Chuang M.H. and Wang J.F. (2015), “First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum on chard in Taiwan”, Plant Disease, 99(2): 282. 90. Mace E.S., Yuejin W., Boshou L., Upadhyaya H., Chandra S., and Crouch J.H. (2007), “Simple sequence repeat (SSR)-based diversity analysis of groundnut (Arachis hypogaea L.) germplasm resistant to bacterial wilt”, Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 5(1): 27 - 36. 91. Machmud M. (1993), “Control of peanut bacterial wilt through crop rotation”, Bacterial wilt, ACIAR Proceedings, No 45, 1993, pp. 221 - 224. 92. Machmud M. and Hayward A.C. (1993), Present status of ground nut bacterial wilt research in Indonesia, In: Groundnut bacterial wilt. Proceedings of the second Working Group Meeting, November 1992, Taiwan. 93. Machmud M. and Rats S.A. (1994), “Status of groundnut bacterial wilt in Indonesia”, Bacterial wilt in Asia, Proceedings of the Third working Group Meeting, 4 - 5 July 1994, ICRISAT, India, pp. 115 - 119. 94. Mehan V.K., Mc Donald D. and Subrahmanyam P. (1986), “Bacterial wilt of groundnut: control with emphasis on host plant resistance”, Bacterial wilt, ACIAR Proceedings, No 13, pp. 112 - 119. 139 95. Mehan V.K., Liao B.S., Tan Y.J and Hayward A.C. (1994), “Bacterial wilt of groundnut”, ICRISAT information bulletin No.35, ICRISAT, Hyderabad, India, 23 pp. 96. Mehan V.K (1995), “Isolation and identification of Pseudomonas solanacearum”, Mehan V.K. and McDonald D. (eds), Techniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum, and for resistance screening against groundnut bacterial wilt, Technical Report, International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. 97. Mehan V.K and McDonald D (1995), “Techniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum, and for resistance screening against groundnut bacterial wilt”, Technical Report, International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics. 98. Meng F. (2013), “Ralstonia Solanacearum species complex and bacterial wilt disease”, Journal of Bacteriology and Parasitology, 4: e911. 99. Middleton K.J and Hayward A.C. (1990), “Bacterial wilt of groundnut. Proceedings of an ACIAR/ICRISAT collaborative research planing meeting held at Genting Highlands”, Malaysia, March 1990, 58 pp. 100. Molla M.R., Islam M.N., Rohman M.M. and Rahman L. (2010), “Microsatellite allele size profiling to determine varietal identity and genetic diversity among groundnut varieties in Bangladesh”, Nature and Science, 8(12): 123-129. 101. Mondal S., Badigannavar A.M. and Murthy G.S. (2007), “RAPD markers linked to a rust resistance gene in cultivated groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Euphytica, 159: 233-239. 102. Mondal S. and Badigannavar A.M. (2010), “Molecular diversity and association SSR markers to rust and late leaf spot diseases in cultivated groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Plant Breeding, 129: 68-71. 103. Moretzsohn M.C., Hopkins M.S., Mitchell S.E., Kresovich S., Valls J.F.M. and Ferreira M.E. (2004), “Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome”, BMC Plant Biology, 4: 11. 104. Moretzsohn M.C., Leoi L., Guimaraes P.M., Leal B.M., Gimarnes M.A., Martin W.S., Valls J.M., Grattapaglia D., Bertioli D. (2005), “A microsatellite based gene rich linkage map for the AA genome of Arachis (Fabaceae)”, Theoretical and Applied Genetics, 111: 1060 - 1071. 105. Moretzsohn M.C., Gouvea E.G., Inglis P.W., Leal-Bertioli S.C.M., Valls J.F.M., Bertioli D.J. (2013), “A study of the relationships of cultivated peanut (Arachis hypogaea) and its most closely related wild species using intron sequences and microsatellite markers”, Annals of Botany, 111: 113-126. 140 106. Nagy E.D., Chu Y., Guo Y.F., Khanal S., Tang S.X., Li Y., Dong W.B.B., Timper P., Taylor C. and Ozias-Akins P. (2010), “Recombination is suppressed in an alien introgression in peanut harboring Rma, a dominant root-knot nematode resistance gene”, Molecular Breeding, 26:357-370. 107. Nawangsih A.A., Aditya R., Tjahjono B., Negishi H. and Suyama K. (2012), “Bioefficacy and characterization of plant growth promoting bacteria to control the bacterial wilt disease of peanut in Indonesia”, Journal of International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences, 18(1): 185-192. 108. Opina N., Tavner F., Hollway G., Wang J.F., Li T.H., Maghirang R., Fegan M., Hayward A.C., Krishnapillai V., Hong. W.F., Holloway B.W. and Timmis J.N. (1997), “A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum), Asia-pacific Journal of Molecular”, Biology and Biotechnology, 5(1): 19-30. 109. Pande S., Johansen C., and Rao J.N. (1998), “Integrated disease management with specail reference to bacterial wilt of groundnut”, groundnut bacterial wilt. Proceeding of Fourth Working Group Meeting, 11 - 13, May, 1998, Hanoi, Vietnam. (Pande S., Boshou L., Hong N.X., Johansen C. and Gowda J. eds), ICRISAT, India, pp. 58 -74. 110. Pandey M.K., Gautami B., Jayakumar T., Sriswathi M., Upadhyaya H.D., Gowda M.V., Radhakrishnan T., Bertioli D.J., Knapp S.J., Cook D.R. and Varshney R.K. (2012), “Highly informative genic and genomic SSR markers to facilitate molecular breeding in cultivated groundnut (Arachis hypogaea)”, Plant Breeding, 131(1): 139-147. 111. Peng W.F., Lu J.W., Ren X.P., Huang L., Zhao X.Y, Wen Q.G., Jiang H.F. (2011), “Differential expression of genes related to bacterial wilt resistance in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Hereditas, 33(4): 389 - 96. 112. Peng L., Zhou H.C., Wu X.X., Wang Z.Y., Ho H.H., Wu Y.X., Mao Z.C. and He Y.Q. (2012), “First record and description of Ralstonia solanacearum wilt in patchouli from Yunnan Province, China”, Indian Phytopathology, 65(2): 208-210. 113. Perrier X. and Colette J. (2006), DARwin software, http://darwin.cirad.fr/darrwin 114. Poussier S., Trigalet-Demery D., Vandewalle P., Goffinet B., Luisett J., Trigalet A. (2000), “Genetic diversity of Ralstonia solanacearum as assessed by PCR-RFLP of the hrp gene region, AFLP and 16S rRNA sequence analysis, and identification of an African subdivision”, Microbiology, 146: 1679-1692. 115. Prior P. and Fegan M. (2005), “Recent development in the phylogeny and classification of Ralstonia solanacearum”, Acta Horticulture, 695: 127-136. 141 116. Qin H., Feng S., Chen C., Guo Y., Knapp S., Culbreath A., He G., Wang M.L., Zhang X. and Holbrook C.C. (2012), “An integrated genetic linkage map of cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) constructed from two RIL populations”, Theoretical and Applied Genetics, 124: 653-664. 117. Remenant B., Cambiaire J.C, Cellier G., Jacobs J.M., Mangenot S., Barbe V., Lajus A., Vallenet D., Medigue C., Fegan M., Allen C. and Prior P. (2011), “Ralstonia syzygii, the blood disease bacterium and some Asian R. solanacearum strains form a single genomic species despite divergent lifestyles”, PloS One, 6(9): e2435. 118. Ren X.P., Jiang H., Liao B.S. (2008), “Identification of molecular markers for resistance to bacterial wilt in peanut (Arachis hypogaea L.)”, Journal of Plant Genetic Resources, 2: 163 - 167. 119. Ren X.P., Jiang H.,Yan Z., Chen Y., Zhou X., Huang L., Lei Y., Huang J., Yan L., Qi Y., Wei W., Liao B. (2014), “Genetic diversity and population structure of the major peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars grown in China by SSR markers”, PLoS One, 9(2): e88091. 120. Rohlf F.J. (2000), “NTSYS-PC: Numerical taxonomy and multivariate analysis system”, Version 2.2, Exeter Software, Setauket, NY. 121. Ryan R.P., Germaine K., Franks A., Ryan D.J. and Dowling D.N. (2008), “Bacterial endophytes: recent developments and applications”, FEMS Microbiology Letters, 278(1): 1-9. 122. Saghai-Maroof M.A., Biyashev R.M., Yang G.P., Zhang Q. and Allard R.W. (1984), “Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics”, PNAS, 91: 5466-5470. 123. Shirasawa K., Koilkonda P., Aoki K., Hirakawa H., Tabata S., Watanabe M., Hasegawa M., Kiyoshima H., Suzuki S. and Kuwata C. (2012), “In silico polymorphism analysis for the development of simple sequence repeat and transposon markers and construction of linkage map in cultivated peanut”, BMC Plant Biology, 12: 80. 124. Song G.Q., Li M.J., Xiao H., Wang X.J., Rong H.T, Chuan Z.Z. and Yu P.B. (2010), “EST sequencing and SSR marker development from cultivated peanut (Arachis hypogaea L.)”, Electronic Journal of Biotechnology, 13(3); 1-9. 125. Stalker H.T., Dhesi J.S. and Kochert G. (1995), “Variation within the species Arachis duranensis Krap and W.C. Gregory, a possible progenitor of cultivated peanut”, Genome, 38:1201-1212. 126. Subramanian T., Gurtu S., Nageswara R.C. and Nigam S.N. (2000), “Identification of DNA polymorphism in cultivated groundnut using random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay”, Genome, 43: 656-660. 127. Sujay V., Gowda M.V.C., Pandey M.K., Bhat R.S., Khedikar Y.P. and Nadaf 142 H.L. (2012), “Quantitative trait locut analysis and construction of consensus genetic map for foliar disease resistance based on two recombinant inbred line populations in cultivated groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Molecular Breeding, 30: 773-788. 128. Tahat M.M. and Sijam K. (2010), “Ralstonia solanacearum: the bacterial wilt causal agent”, Asian Journal of Plant Sciences, 9(7): 385-393. 129. Tan Y.J., Liao B.S., He L. and Yzheng G.R. (1994), “Status of groundnut bacterial wilt resistance in China”, Groundnut Bacterial wilt in Asia, Proceedings of the Third Working Group Meeting, pp. 107 - 114. 130. Tang R.H., Gao G.Q., He L.Q., Han Z.Q., Shan S.H., Zhong R.C., Zhou C.Q., Jiang J., Li Y.R., Zhuang W.J. (2007), “Genetic diversity in cultivated groundnut based on SSR markers”, Journal of Genetics and Genomics, 34(5): 449-459. 131. Vadodariyagopal D., Sharma H., Chahar S., Maloo S.R. and Tandel D.H. (2014), “Application of RAPD markers in genetic diversity analysis of groundnut”, Journal of Cell and Tissue Research, 14(3): 4571-4576. 132. Varshney R.K. Graner A. Sorrells M.E. (2005), “Genic microsatellite markers in plants: features and applications”, Trends Biotechnology, 23: 48-55. 133. Varshney R.K., Bertioli D.J., Moretzsohn M.C., Vadez V., Krishramurthy L., Aruma R., Nigam S.N., Moss B.J., Seetha K., Ravi K., He G.H., Knapp S.J. and Hoisington D.A. (2009), “The first SSR-based genetic linkage map for cultivated groundnut (Arachis hypogaea L.)”, Theoretical and Applied Genetics, 118(4): 729-739. 134. Vyas D., Munot J. and Maloo S.R. (2014), “RAPD based evaluation of genetic diversity in groundnut (Arachis hypogaea L.) genotypes”, Legume Research, 37(1): 26-31. 135. Wang J.S. and Hou X.Y. (1983), “Studies on the control of the bacterial wilt of peanut”, Agricultural Science and Technology in Lingyi, 1: 79-84. 136. Wang X. and Liang G. (2014), “Control efficacy of an endophytic Bacillus amyloliquefaciens strain BZ6-1 against peanut bacterial wilt, Ralstonia solanacearum”, BioMed Research International, Volume 2014 (2014), Article ID 465435, 11 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/465435 137. Wu Q., Wang X.Z., Tang Y.Y., Ding Y.F., Wang C.T. (2013), “Identification of 11 Ralstonia solanacearum strains of peanut (Arachis hypogaea) from China”, Journal of Today’s Biological Sciences, 2(2): 1-10. 138. Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H., Yano I., Hotta H., Hashimoto Y., Ezaki T. and Arakawa M. (1992), “Proposal of Burkholderia gen nov and transfer of seven species of the genus Pseudomonas group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni & Holmes, 1981) comb, Nov”, Microbiology and Immunology, 36: 1251-1275. 143 139. Yabuuchi E., Kosako Y., Yano I., Hotta H. and Nishiuchi Y. (1995), “Transfer of two Burkholderia and an alcaligenes species to Ralstonia gen”, nov, proposal of Ralstonia pickettii (Ralston, Palleroni and Doudoroff, 1973) comb. nov., Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) comb. nov. and Ralstonia eutropha (Davis, 1969) comb. Nov”, Microbiology and Immunology, 39(11): 897-904. 140. Zhao Y., Prakash C.S. and He G. (2012), “Characterization and compilation of polymorphic simple sequence repeat (SSR) markers of peanut from public database”, BMC Research Notes, 5: 362-369. 144 PHỤ LỤC 1 TẬP ĐOÀN VÀ CÁC DÒNG LẠC Bảng 1. Tập đoàn 63 mẫu giống lạc STT Tên giống STT Tên giống STT Tên giống 1 ICGV 00351 22 ICGV 970019 43 ICG 5051 2 L18 23 ICGV01232 44 L14 3 O506.2 24 ICGV01238 45 BW15 4 0713.24.1 25 ICGV 89104 46 Dòng lai1 5 ICGV6022 26 L12 47 ICG 4911 6 BW62 27 ICGV 92118 48 O702.3 7 LO5 28 O909.1 49 BWP - 1 8 L19 29 ICG 11515 50 BWP - 2 9 CG 38 30 L16 51 BWP - 3 10 Sen lai 31 VAG36 52 BWP - 4 11 L17 32 Dòng lai2 53 BWP - 5 12 ICGV01239 33 O816.7 54 BWP - 6 13 O401.57.1 34 L22 55 BWP - 7 14 L15 35 L26 56 BWP - 8 15 Dòng lai14 36 O401.65.1 57 BWP - 9 16 ICGV 98370 37 VAG 03.2 58 BWP - 10 17 L21 38 ICGV01241 59 BWP - 11 18 T38 39 Sen thắt 60 BWP - 12 19 TD 207 40 BW79.4 61 BWP - 13 20 9805. 7. 1 41 L23 62 Gié Nho Quan 21 L08 42 MDRF5. 176 63 ICGV3704 145 Bảng 2. 50 dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn Cặp lai TT Mẹ Cặp lai Bố 1 2 L05 Tên dòng TT 1306.9 26 1306.10 27 BW62 Mẹ Bố Tên dòng 1209.7 1209.4 L19 T38 3 1306.4 28 1209.9 4 1306.2 29 1209.2 5 1204.5 30 1317.181 1204.3 31 7 1204.2 32 1317.183 8 1308.9 33 1317.184 1308.4 34 1217.4 1308.2 35 1308.5 36 1217.2 1204.6 37 1211.2 1214.13 38 1214.5 39 1211.1 1214.7 40 1219.4 16 1214.14 41 17 1316.32 42 1219.5 1316.33 43 1213.1 19 1316.36 44 20 1315.43 45 1213.13 1315.44 46 1212.5 1315.45 47 1315.46 48 1207.3 49 6 L26 BW62 9 10 L19 BW62 11 12 L26 BW62 13 14 15 18 L23 0401.65.1 0702.3 Gié Nho Quan 21 22 0909.1 T38 23 24 25 L26 T38 1207.1 50 L26 T38 L23 0702.3 0401.65.1 L18 L23 0713.24.1 L18 0816.7 0816.7 L18 1317.182 1217.3 1211.15 1219.7 1213.11 1212.7 1212.1 1201.3 L26 0506.2 1201.1 146 Bảng 3. 26 dòng lạc từ một số tổ hợp lai hồi quy STT Ký hiệu 1 HX14 2 HX15 3 HX16 4 HX17 5 HX18 6 HX19 7 HX21 8 HX22 9 HX23 10 HX24 11 HX25 12 HX26 13 HX27 14 HX31 15 HX32 16 HX33 17 HX34 18 HX38 19 HX36 20 HX37 21 HX35 22 HX39 23 HX40 24 HX41 25 HX42 26 HX43 Tên dòng 1116.3 1116.1 1116.4 1116.5 1116.7 1116.1.1 L19/T38(CN16-BC2) L19/T38(CN20-BC2) L19/T38 (CN22-BC2) L19/T38(CN19-BC2) L19/T38 (CN17-BC2) L19/T38(CN15-BC2) L19/T38(CN21-BC2) L26/BW62 (CN4-BC2) L26/T38(B-F3.3) 0503.3 0803.1.1 L08/T38(B1-F3) 0803.3 L26/BW62 (CN23-BC2) L18/T38 (B1-F3) L26/T38 (B-F1.13) L26/T38(B-F4.7) L26/T38(B-F4.2) L26/T38(B-F4.9) L26/T38(B-F4.1) 147 Bảng 4: 13 dòng lạc ưu tú Tên tổ hợp lai STT Bố Tên dòng Mẹ 1 Sen thắt L23 1003.7 2 BW62 L08 0811.10 3 ICGV91279 L23 1010.6 4 L23 L26 1009.8 5 L16 L26 1004.3 6 ICGV91279 L23 1010.5 7 L16 L26 1004.4 8 L19 ICGV93305 1008.9 9 L16 L26 1004.5 10 L16 L26 1004.8 11 ICGV91279 L23 1010.4 12 Sen thắt L23 1003.4 13 Sen thắt L23 1003.3 Bảng 5. 13 dòng lạc triển vọng STT Ký hiệu Tên dòng 1 BWP-1 0401.57.1 2 BWP-2 ĐBX 0401.11 3 BWP-3 0503.7.1 4 BWP-4 0504.5 5 BWP-5 0308.1.1 6 BWP-6 0803.1 7 BWP-7 0803.9 8 BWP-8 0810.5 9 BWP-9 0816.7 10 BWP-10 0401.65.1 11 BWP-11 0401.16 12 BWP-12 T38 13 BWP-13 D8.1 148 PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN HÉO XANH HẠI LẠC Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM Bảng 1. Kết quả điều tra thu thập mẫu bệnh HXVK hại lạc tại một số địa phƣơng, vụ xuân 2012 Địa điểm điều tra Số lƣợng mẫu bệnh thu đƣợc Đặc điểm về canh tác Cẩm Xuyên - Hà Tĩnh 3 Đất chuyên màu Đức Thọ - Hà Tĩnh 3 Đất chuyên màu Nghi Lộc - Nghệ An 3 Đất chuyên màu Hƣng Nguyên - Nghệ An 2 Đất luân canh với ngô Tĩnh Gia - Thanh Hóa 2 Đất chuyên màu Hoàng Hóa - Thanh Hóa 2 Đất luân canh với ngô, rau họ thập tự Nho Quan - Ninh Bình 6 Đất chuyên màu Lạc Sơn - Hòa Bình 3 Đất chuyên màu Yên Thủy - Hòa Bình 2 Đất chuyên màu Ba Vì - Hà Nội 3 Đất chuyên màu, luân canh với sắn Sơn Tây - Hà Nội 7 Đất chuyên màu Chƣơng Mỹ - Hà Nội 7 Đất luân canh với lúa nƣớc, rau màu Sóc Sơn - Hà Nội 6 Đất luân canh với lúa nƣớc, rau màu Từ Sơn - Bắc Ninh 4 Đất chuyên màu Hiệp Hòa - Bắc Giang 4 Đất luân canh với lúa nƣớc, rau màu Việt Yên - Bắc Giang 4 Đất chuyên màu Tổng cộng 61 149 Bảng 2. Kết quả đánh giá độc tính của các isolate vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Isolate HT3 HT4 HT5 HT6 HT8 HT9 NA1 NA2 NA3 NA4 NA6 TH1 TH2 TH3 TH4 NQ1 NQ2 NQ3 NQ4 NQ5 NQ6 LS1 LS2 LS3 YT3 YT5 BV1 BV2 BV3 ST1 ST2 Phản ứng siêu nhạy Sau Sau 24 36 giờ giờ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Kết luận Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Trung bình Trung bình Mạnh Mạnh Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Mạnh Trung bình Mạnh Mạnh Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Trung bình Trung bình Trung bình STT Isolat e 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 ST3 CĐ1 CĐ2 CĐ3 CĐ4 CM1 CM2 CM3 ĐFY1 ĐFY2 ĐFY3 ĐFY4 PC1 PC2 PC3 SS1 SS2 SS3 BN1 BN2 BN3 BN4 BG1 BG2 BG3 BG4 VY1 VY2 VY3 VY4 Phản ứng siêu nhạy Sau Sau 24 36 giờ giờ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Kết luận Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Ghi chú: + có phản ứng; - không có phản ứng; HT: Hà Tĩnh; NA: Nghệ An; TH: Thanh Hóa; NQ: Nho Quan, Ninh Bình; LS: Lạc Sơn, Hòa Bình; YT: Yên Thủy, Hòa Bình; BV: Ba V, Hà Nội; ST: TX Sơn Tây, Hà Nội; CĐ: Cổ Đông, Sơn Tây, Hà Nội; CM: Thị trấn Chương Mỹ, Hà Nội; ĐFY: Đông Phương Yên, Chương Mỹ - Hà Nội; PC: Phú Cường, Sóc Sơn - Hà Nội; SS: Thị Trấn Sóc Sơn, Hà Nội; BN: Bắc Ninh; BG: Bắc Giang; VY: Việt Yên, Bắc Giang. 150 Bảng 3. Phân bố các biovar và nhóm vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc phổ biến miền Bắc Việt Nam Tỉnh Hà Tĩnh Nghệ An Thanh Hóa Ninh Bình Hòa Bình Hà Nội Bắc Ninh Bắc Giang Tỷ lệ Biovar (%) Biovar Biovar 3 4 I II.1 Tỷ lệ nhóm theo đa dạng di truyền (%) II.2 II.3 II.4 II.5 II.6 II.7 II.8 II.9 II.10 100 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 60,0 40,0 80,0 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 60,0 0,0 0,0 0,0 40,0 75,0 25,0 0,0 0,0 0,0 25,0 0,0 0,0 75,0 0,0 0,0 0,0 0,0 50,0 50,0 0,0 66,6 16,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,7 80,0 20,0 0,0 0,0 60,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 40,0 82,6 17,4 15,0 0,0 5,0 15,0 5,0 30,0 0,0 20,0 10,0 0,0 0,0 75,0 25,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 87,5 12,5 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 151 PHỤ LỤC 3. 1a-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng SPA sau 24h nuôi cấy (mm) BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 1.87 0.02081 7 1.88 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! -1.15207 0.07 1.83 1.9 5.61 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 1.86 0.01154 7 1.86 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! -5E-14 0.04 1.84 1.88 5.58 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 1.87 0.01732 1 1.87 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 3.35E-14 0.06 1.84 1.9 5.61 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.89 0.01732 1 1.89 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 3.35E-14 0.06 1.86 1.92 5.67 3 0.07 SS1 1.86 0.01732 1 1.86 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! -3.3E-14 0.06 1.83 1.89 5.58 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.88 0.02309 4 1.88 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 2.55E-14 0.08 1.84 1.92 5.64 3 0.10 152 1b-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng TZCA sau 24h nuôi cấy (mm) BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 1.76 0.01732 1 1.76 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 1.73 1.79 5.28 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 1.78 0.02309 4 1.78 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 1.74 1.82 5.34 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 1.77 0.01154 7 1.77 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! -1E-13 0.04 1.75 1.79 5.31 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.77 0.01732 1 1.77 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! -6.6E-14 0.06 1.74 1.8 5.31 3 0.07 SS1 1.78 0.02309 4 1.78 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 1.74 1.82 5.34 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.76 0.02309 4 1.76 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 1.72 1.8 5.28 3 0.10 153 1c-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng SPA sau 48h nuôi cấy (mm) BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 4.95 0.01732 1 4.95 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 4.92 4.98 14.85 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 4.96 0.02309 4 4.96 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 4.92 5 14.88 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 4.94 0.02645 8 4.93 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! 0.93522 0.09 4.9 4.99 14.82 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 4.95 0.02309 4 4.95 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 4.91 4.99 14.85 3 0.10 SS1 4.94 0.01527 5 4.95 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! Mean -1.45786 0.05 4.91 4.96 14.82 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.07 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis 4.93 0.02516 6 4.91 #N/A 0.04358 9 0.0019 #DIV/0! 1.63005 9 0.08 4.9 4.98 14.79 3 0.11 154 1d-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng TZCA sau 48h nuôi cấy (mm) BG1 Mean LS1 4.82 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.02 4.8 4.8 0.03464 1 0.0012 #DIV/0! 1.73205 1 0.06 4.8 4.86 14.46 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 4.83 0.02309 4 4.83 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! -2E-13 0.08 4.79 4.87 14.49 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 4.83 0.01527 5 4.84 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! Mean -1.45786 0.05 4.8 4.85 14.49 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.07 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis 4.84 0.04041 5 4.81 #N/A 0.07 0.0049 #DIV/0! 1.57434 4 0.13 4.79 4.92 14.52 3 0.17 SS1 4.84 0.02645 8 4.83 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! 0.93522 0.09 4.8 4.89 14.52 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 4.83 0.03 4.8 4.8 0.05196 2 0.0027 #DIV/0! 1.73205 1 0.09 4.8 4.89 14.49 3 0.13 155 1e-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng SPA sau 72h nuôi cấy (mm) BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 6.78 0.02645 8 6.79 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! -0.93522 0.09 6.73 6.82 20.34 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 6.79 0.02081 7 6.78 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 6.76 6.83 20.37 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 6.77 0.02081 7 6.76 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 6.74 6.81 20.31 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.78 0.02309 4 6.78 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 6.74 6.82 20.34 3 0.10 SS1 6.78 0.03785 9 6.79 #N/A 0.06557 4 0.0043 #DIV/0! -0.67028 0.13 6.71 6.84 20.34 3 0.16 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.77 0.01154 7 6.77 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! 2E-13 0.04 6.75 6.79 20.31 3 0.05 156 1f-Đƣờng kính khuẩn lạc trên môi trƣờng TZCA sau 72h nuôi cấy (mm) BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 6.52 0.03214 6 6.51 #N/A 0.05567 8 0.0031 #DIV/0! 0.78215 2 0.11 6.47 6.58 19.56 3 0.14 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 6.53 0.02081 7 6.54 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! Mean -1.15207 0.07 6.49 6.56 19.59 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.09 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis TH1 6.54 0.02645 8 6.53 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! 0.93522 0.09 6.5 6.59 19.62 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.52 0.01527 5 6.51 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! 1.45786 3 0.05 6.5 6.55 19.56 3 0.07 SS1 6.52 0.03055 1 6.5 #N/A 0.05291 5 0.0028 #DIV/0! 1.45786 3 0.1 6.48 6.58 19.56 3 0.13 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.52 0.01527 5 6.51 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! 1.45786 3 0.05 6.5 6.55 19.56 3 0.07 157 2a-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở điều kiện 20oC sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 4.88 0.00577 4 4.88 #N/A 0.01 1E-04 #DIV/0! 0 0.02 4.87 4.89 14.64 3 0.02 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 4.89 0.00577 4 4.89 #N/A 0.01 0.0001 #DIV/0! 4E-13 0.02 4.88 4.9 14.67 3 0.02 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 4.87 0.00577 4 4.87 #N/A 0.01 1E-04 #DIV/0! 0 0.02 4.86 4.88 14.61 3 0.02 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 4.88 0.00577 4 4.88 #N/A 0.01 1E-04 #DIV/0! 0 0.02 4.87 4.89 14.64 3 0.02 SS1 4.88 0.00577 4 4.88 #N/A 0.01 1E-04 #DIV/0! 0 0.02 4.87 4.89 14.64 3 0.02 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 4.87 0.00577 4 4.87 #N/A 0.01 1E-04 #DIV/0! 0 0.02 4.86 4.88 14.61 3 0.02 158 2b-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở điều kiện 25oC sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 6.22 0.03055 1 6.2 #N/A 0.05291 5 0.0028 #DIV/0! 1.45786 3 0.1 6.18 6.28 18.66 3 0.13 Mean Mean Standard Error Median Mode 6.23 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 HT3 0.01 6.22 6.22 0.01732 1 0.0003 #DIV/0! 1.73205 1 0.03 6.22 6.25 18.69 3 0.04 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 6.22 0.01732 1 6.22 #N/A Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis 0.03 0.0009 #DIV/0! Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.33E-13 0.06 6.19 6.25 18.66 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.07 6.21 0.04618 8 6.21 #N/A 0.08 0.0064 #DIV/0! 0 0.16 6.13 6.29 18.63 3 0.20 SS1 6.22 0.02516 6 6.2 #N/A 0.04358 9 0.0019 #DIV/0! 1.63005 9 0.08 6.19 6.27 18.66 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.23 0.02645 8 6.24 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! -0.93522 0.09 6.18 6.27 18.69 3 0.11 159 2c-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở điều kiện 30oC sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 6.58 0.02516 6 6.6 #N/A 0.04358 9 0.0019 #DIV/0! -1.63006 0.08 6.53 6.61 19.74 3 0.11 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 6.56 0.01154 7 6.56 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! 2E-13 0.04 6.54 6.58 19.68 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 6.56 0.00577 4 6.56 #N/A 0.01 0.0001 #DIV/0! 4E-13 0.02 6.55 6.57 19.68 3 0.02 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.57 0.02 6.59 6.59 0.03464 1 0.0012 #DIV/0! -1.73205 0.06 6.53 6.59 19.71 3 0.09 SS1 6.57 0.01527 5 6.58 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! -1.45786 0.05 6.54 6.59 19.71 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.57 0.02886 8 6.57 #N/A 0.05 0.0025 #DIV/0! -8E-14 0.1 6.52 6.62 19.71 3 0.12 160 2d-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở điều kiện 35oC sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 5.62 0.01154 7 5.62 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! -2E-13 0.04 5.6 5.64 16.86 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 5.63 0.01732 1 5.63 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 5.6 5.66 16.89 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 5.64 0.02886 8 5.64 #N/A 0.05 0.0025 #DIV/0! -8E-14 0.1 5.59 5.69 16.92 3 0.12 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.62 0.01732 1 5.62 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 5.59 5.65 16.86 3 0.07 SS1 5.63 0.02081 7 5.62 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 5.6 5.67 16.89 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.63 0.02516 6 5.61 #N/A 0.04358 9 0.0019 #DIV/0! 1.63005 9 0.08 5.6 5.68 16.89 3 0.11 161 3a-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở pH 6,0 sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 5.66 0.01732 1 5.66 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 5.63 5.69 16.98 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 5.65 0.01154 7 5.65 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! -6E-13 0.04 5.63 5.67 16.95 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 5.68 0.02309 4 5.68 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 5.64 5.72 17.04 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.67 0.01 5.68 5.68 0.01732 1 0.0003 #DIV/0! -1.73205 0.03 5.65 5.68 17.01 3 0.04 SS1 5.65 0.02309 4 5.65 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! -2E-13 0.08 5.61 5.69 16.95 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.66 0.01527 5 5.65 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! 1.45786 3 0.05 5.64 5.69 16.98 3 0.07 162 3b-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở pH 6,5 sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode LS1 6.68 0.01732 1 6.68 #N/A Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis 0.03 0.0009 #DIV/0! Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 1.33E-13 0.06 6.65 6.71 20.04 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.07 NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 6.66 0.03214 6 6.67 #N/A 0.05567 8 0.0031 #DIV/0! Mean -0.78215 0.11 6.6 6.71 19.98 3 Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 0.14 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis TH1 6.67 0.02309 4 6.67 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! -2E-13 0.08 6.63 6.71 20.01 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.67 0.01527 5 6.66 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! 1.45786 3 0.05 6.65 6.7 20.01 3 0.07 SS1 6.67 0.01154 7 6.67 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! 6E-13 0.04 6.65 6.69 20.01 3 0.05 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.67 0.01732 1 6.67 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 2.66E-13 0.06 6.64 6.7 20.01 3 0.07 163 3c-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở pH 7,0 sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 7.01 0.02886 8 7.01 #N/A 0.05 0.0025 #DIV/0! -1.6E-13 0.1 6.96 7.06 21.03 3 0.12 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 7 0.02309 4 7 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 6.96 7.04 21 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 7 0.01732 1 7 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 0 0.06 6.97 7.03 21 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 7.02 0.01154 7 7.02 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! 2E-13 0.04 7 7.04 21.06 3 0.05 SS1 7.01 0.03464 1 7.01 #N/A 0.06 0.0036 #DIV/0! -6.6E-14 0.12 6.95 7.07 21.03 3 0.15 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 7.01 0.01154 7 7.01 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! -2E-13 0.04 6.99 7.03 21.03 3 0.05 164 3d-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở pH 7,5 sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 6.88 0.02645 8 6.89 #N/A 0.04582 6 0.0021 #DIV/0! -0.93522 0.09 6.83 6.92 20.64 3 0.11 Mean Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.87 Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 HT3 0.02 6.89 6.89 0.03464 1 0.0012 #DIV/0! -1.73205 0.06 6.83 6.89 20.61 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 6.89 0.01527 5 6.88 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! 1.45786 3 0.05 6.87 6.92 20.67 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.88 0.01154 7 6.88 #N/A 0.02 0.0004 #DIV/0! 2E-13 0.04 6.86 6.9 20.64 3 0.05 SS1 6.88 0.02081 7 6.87 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 6.85 6.92 20.64 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 6.88 0.02081 7 6.89 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! -1.15207 0.07 6.84 6.91 20.64 3 0.09 165 3e-Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) ở pH 8,0 sau nuôi cấy 72 giờ BG1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) LS1 5.43 0.02309 4 5.43 #N/A 0.04 0.0016 #DIV/0! 0 0.08 5.39 5.47 16.29 3 0.10 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) NA1 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) HT3 5.44 0.02081 7 5.43 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 5.41 5.48 16.32 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) TH1 5.42 0.02081 7 5.41 #N/A 0.03605 6 0.0013 #DIV/0! 1.15207 0.07 5.39 5.46 16.26 3 0.09 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.43 0.03 5.4 5.4 0.05196 2 0.0027 #DIV/0! 1.73205 1 0.09 5.4 5.49 16.29 3 0.13 SS1 5.43 0.01527 5 5.44 #N/A 0.02645 8 0.0007 #DIV/0! -1.45786 0.05 5.4 5.45 16.29 3 0.07 Mean Standard Error Median Mode Standard Deviation Sample Variance Kurtosis Skewness Range Minimum Maximum Sum Count Confidence Level(95.0%) 5.43 0.01732 1 5.43 #N/A 0.03 0.0009 #DIV/0! 1.33E-13 0.06 5.4 5.46 16.29 3 0.07 166 PHỤ LỤC 4. XỬ LÝ THỐNG KÊ 1) Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của tập đoàn giống (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2012-2013) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC_2012 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) 1 VARIATE V003 SQC_2012 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 270.338 4.36029 10.83 0.000 2 * RESIDUAL 126 50.7200 .402540 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 321.058 1.70776 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC_2013 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V004 SQC_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 228.312 3.68246 9.69 0.000 2 * RESIDUAL 126 47.8800 .380000 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 276.192 1.46911 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ_2012 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V005 KLQ_2012 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 22227.9 358.515 7.50 0.000 2 * RESIDUAL 126 6025.14 47.8186 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 28253.1 150.282 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ_2013 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V006 KLQ_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN SQUARES F RATIO PROB ER LN 167 ============================================================================= 1 CT$ 62 21502.0 346.806 6.16 0.000 2 * RESIDUAL 126 7096.72 56.3232 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 28598.7 152.121 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH_2012 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V007 KLH_2012 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 6300.78 101.625 8.70 0.000 2 * RESIDUAL 126 1471.28 11.6768 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 7772.06 41.3407 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH_2013 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 20122013) VARIATE V008 KLH_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 6424.38 103.619 9.59 0.000 2 * RESIDUAL 126 1361.04 10.8019 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 7785.42 41.4118 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS_2012 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V009 NS_2012 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 2099.14 33.8571 10.05 0.000 2 * RESIDUAL 126 424.540 3.36937 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 2523.68 13.4238 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS_2013 FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 8 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) VARIATE V010 NS_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 62 1901.07 30.6625 7.63 0.000 2 * RESIDUAL 126 506.280 4.01810 168 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 188 2407.35 12.8051 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 9 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 SQC_2012 8.50000 9.70000 10.3000 9.00000 8.70000 9.50000 9.80000 10.6000 10.3000 9.80000 9.80000 8.90000 10.5000 10.2000 10.0000 8.70000 10.5000 10.1000 10.2000 8.50000 8.90000 8.60000 9.20000 9.40000 8.70000 10.1000 8.60000 9.20000 8.30000 9.50000 9.20000 9.50000 9.20000 10.8000 9.30000 9.80000 10.1000 10.1000 9.80000 10.2000 9.90000 10.5000 7.80000 8.80000 10.3000 10.4000 8.40000 10.0000 12.2000 9.20000 10.7000 9.20000 9.40000 SQC_2013 9.40000 8.90000 10.5000 9.70000 9.00000 9.80000 10.3000 10.4000 9.40000 10.2000 9.10000 9.60000 10.2000 9.70000 10.6000 8.60000 9.50000 10.8000 10.4000 9.20000 9.10000 8.10000 9.70000 8.40000 9.70000 10.6000 9.50000 9.50000 9.10000 9.10000 9.80000 8.70000 9.60000 10.2000 9.70000 10.1000 10.7000 9.40000 10.3000 9.70000 9.40000 10.7000 8.20000 9.50000 10.6000 11.1000 9.00000 10.7000 12.8000 8.30000 10.4000 8.50000 9.80000 KLQ_2012 148.000 164.000 153.900 163.600 152.700 147.900 147.300 155.900 146.500 153.300 156.700 144.900 154.800 152.000 152.300 151.300 152.000 152.700 158.200 151.800 170.200 149.100 147.600 149.400 150.500 151.600 146.900 157.700 153.900 157.700 149.100 149.600 145.600 151.300 168.500 159.000 147.800 151.900 148.000 148.000 154.000 155.000 154.500 154.200 154.200 152.000 147.700 156.900 154.300 152.800 153.000 122.000 137.300 KLQ_2013 147.400 163.700 154.100 162.700 153.100 150.200 147.500 156.200 147.100 154.400 157.500 145.000 155.300 151.600 152.600 151.700 152.600 152.800 156.900 152.500 168.700 150.300 146.700 150.000 149.800 151.700 147.100 155.400 153.400 158.500 150.300 150.000 146.100 152.300 167.200 158.600 148.200 152.400 147.800 150.200 155.200 155.500 155.000 154.900 155.300 152.500 146.500 157.500 154.700 153.200 153.600 123.400 138.100 169 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 SE(N= 3) 5%LSD 126DF CT$ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 11.3000 11.5000 12.3000 12.4000 12.2000 12.2000 14.1000 12.2000 10.4000 8.80000 11.1000 12.3000 11.7000 12.5000 12.8000 11.6000 12.0000 11.8000 10.6000 9.30000 144.700 167.700 156.100 151.200 159.400 155.000 152.200 167.300 88.4000 138.600 143.900 166.500 157.200 152.100 150.500 154.800 153.000 166.100 87.8000 137.900 0.366306 1.02506 0.355903 0.995951 3.99243 11.1723 4.33294 12.1252 KLH_2012 49.3000 62.1000 59.5000 60.7000 50.4000 57.3000 54.5000 59.5000 45.6000 65.3000 64.8000 42.5000 62.1000 57.0000 50.6000 51.3000 55.6000 60.6000 59.9000 51.6000 63.4000 51.3000 48.5000 51.2000 50.8000 55.3000 50.5000 60.0000 53.5000 57.7000 53.5000 50.3000 59.3000 59.8000 65.6000 60.0000 50.5000 56.6000 51.3000 63.7000 53.6000 45.0000 50.3000 57.8000 62.5000 58.7000 50.3000 61.1000 60.6000 60.3000 KLH_2013 50.7000 63.0000 58.7000 60.1000 49.8000 58.0000 55.2000 60.6000 46.2000 66.1000 64.4000 43.1000 61.9000 56.7000 50.5000 51.6000 55.5000 61.2000 60.4000 51.7000 64.1000 50.5000 49.0000 50.8000 51.3000 55.1000 49.8000 58.7000 52.7000 56.8000 53.6000 49.6000 60.6000 60.2000 66.0000 60.6000 51.0000 55.9000 52.4000 64.5000 54.0000 45.5000 51.1000 57.3000 62.6000 57.7000 50.0000 62.5000 61.2000 59.8000 NS_2012 28.2000 35.6000 35.5000 33.0000 29.8000 31.5000 32.3000 37.0000 33.8000 33.6000 34.4000 28.9000 36.4000 34.7000 34.1000 29.5000 35.8000 34.5000 36.1000 28.9000 33.9000 28.7000 30.4000 31.4000 29.3000 34.3000 28.3000 32.5000 28.6000 33.5000 30.7000 31.8000 30.0000 36.4000 35.1000 34.9000 33.4000 34.4000 32.5000 33.8000 34.2000 36.4000 27.0000 30.4000 35.6000 35.4000 27.8000 35.1000 38.2000 35.3000 NS_2013 31.0000 32.6000 36.2000 35.4000 30.9000 33.0000 34.0000 36.4000 31.0000 35.3000 32.1000 31.2000 35.5000 32.9000 36.2000 29.2000 32.5000 37.0000 36.6000 31.4000 34.4000 27.3000 31.9000 28.2000 32.5000 36.0000 31.3000 33.1000 31.3000 32.3000 33.0000 29.2000 31.4000 34.8000 36.3000 35.9000 35.5000 32.1000 34.1000 32.6000 32.7000 37.3000 28.5000 33.0000 36.9000 37.9000 29.5000 37.7000 39.4000 34.5000 170 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 57.9000 46.8000 54.4000 58.8000 65.0000 60.2000 60.1000 63.0000 60.4000 58.6000 65.6000 50.5000 46.3000 58.1000 45.5000 55.6000 59.3000 66.1000 60.8000 61.0000 62.9000 60.7000 59.2000 64.0000 51.1000 47.0000 34.1000 30.1000 36.2000 34.6000 36.1000 35.3000 35.0000 35.6000 38.2000 38.2000 35.4000 20.6000 27.3000 32.7000 31.6000 36.8000 34.3000 37.3000 34.8000 35.6000 36.2000 37.6000 35.5000 35.1000 20.8000 28.7000 SE(N= 3) 1.97289 1.89753 1.05977 1.15731 5%LSD 126DF 5.52088 5.31002 2.96565 3.23859 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF1 2/ 4/** 12:42 ---------------------------------------------------------------- PAGE 10 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua tap doan giong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2012-2013) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE SQC_2012 SQC_2013 KLQ_2012 KLQ_2013 KLH_2012 KLH_2013 NS_2012 NS_2013 GRAND MEAN (N= 189) NO. OBS. 189 9.9413 189 10.016 189 151.46 189 151.50 189 56.203 189 56.375 189 33.010 189 33.460 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.3068 0.63446 6.4 0.0000 1.2121 0.61644 6.2 0.0000 12.259 6.9151 4.6 0.0000 12.334 7.5049 5.0 0.0000 6.4297 3.4171 6.1 0.0000 6.4352 3.2866 5.8 0.0000 3.6639 1.8356 5.6 0.0000 3.5784 2.0045 6.0 0.0000 | | | | 171 2) Một số tính trạng cấu thành năng suất và năng suất của các dòng lạc từ các tổ hợp lai đơn (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V003 SQC LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .349057 .174528 0.50 0.612 3 2 CT$ 52 194.046 3.73165 10.76 0.000 3 * RESIDUAL 104 36.0709 .346836 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 158 230.466 1.45864 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KL_100Q FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V004 KL_100Q LN SOURCE OF VARIATION DF DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 1213.34 606.671 6.24 0.003 3 2 CT$ 52 13691.8 263.303 2.71 0.000 3 * RESIDUAL 104 10107.8 97.1906 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 158 25012.9 158.310 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KL_100H FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V005 KL_100H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .697739 .348870 0.04 0.957 3 2 CT$ 52 6250.38 120.200 15.03 0.000 3 * RESIDUAL 104 831.603 7.99618 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 158 7082.68 44.8271 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V006 NSTT ndt2tnn LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 220.454 110.227 22.23 0.000 3 2 CT$ 52 1794.36 34.5069 6.96 0.000 3 172 * RESIDUAL 104 515.606 4.95775 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 158 2530.42 16.0153 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 NOS 53 53 53 SQC 10.9358 11.0302 10.9264 KL_100Q 150.074 146.617 153.383 KL_100H 54.6660 54.5849 54.7472 NSTT 34.8547 33.4868 36.3698 SE(N= 53) 0.808955E-01 1.35417 0.388422 0.305847 5%LSD 104DF 0.226843 3.79730 1.08919 0.857639 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ 1306.9 1306.1 1306.4 1306.2 1308.9 1308.4 1308.2 1308.5 1217.4 1217.3 1217.2 1211.2 1211.15 1211.1 1219.4 1219.7 1219.5 1213.1 1213.11 1213.13 1214.13 1214.5 1214.7 1214.14 1212.5 1212.7 1212.1 1204.5 1204.3 1204.2 1207.3 1207.1 1204.6 1201.3 1201.1 1209.7 1209.4 1209.9 1209.2 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 SQC 12.0000 11.0000 12.3000 10.4000 9.80000 10.3000 11.8000 9.60000 10.6000 10.7000 10.4000 11.2000 9.80000 10.7000 12.1000 13.4000 12.6000 11.5000 13.1000 12.4000 10.7000 12.0000 11.8000 10.7000 9.80000 10.4000 10.5000 9.60000 10.7000 KL_100Q 152.400 150.100 150.700 145.400 150.200 150.700 150.400 152.100 150.300 150.000 149.500 151.400 154.200 150.400 153.200 154.100 152.600 150.100 152.700 152.500 151.600 154.300 153.200 150.200 148.700 150.400 155.100 150.300 148.700 KL_100H 56.6000 54.5000 56.6000 48.8000 51.4000 45.5000 50.2000 56.8000 61.7000 53.2000 41.0000 65.5000 68.9000 52.5000 50.0000 68.6000 44.7000 63.5000 55.3000 61.2000 45.6000 56.8000 58.8000 46.8000 51.3000 52.5000 55.0000 51.1000 48.8000 NSTT 35.5000 33.7000 36.2000 30.6000 31.7000 33.1000 42.1000 31.5000 30.1000 37.7000 32.5000 33.4000 32.8000 33.1000 36.1000 41.6000 40.5000 35.7000 37.3000 38.6000 35.2000 35.7000 34.6000 33.8000 32.1000 35.8000 38.4000 34.2000 33.6000 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 9.80000 10.2000 10.5000 10.7000 12.6000 11.0000 14.1000 12.3000 11.6000 12.7000 151.700 150.700 153.500 150.500 150.700 154.300 150.400 155.100 156.300 157.200 61.2000 59.2000 57.8000 40.5000 48.6000 61.2000 56.6000 54.6000 49.7000 63.1000 33.5000 32.7000 34.6000 35.3000 36.3000 36.7000 40.7000 39.7000 38.5000 36.2000 173 1316.32 1316.33 1316.36 1315.43 1315.44 1315.45 1315.46 1317.181 1317.182 1317.183 1317.184 L14 Gie NQ ICGV3704 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 11.3000 10.4000 9.80000 10.8000 10.4000 9.40000 10.9000 9.60000 9.70000 10.7000 11.2000 9.50000 10.5000 9.50000 150.600 153.200 151.700 154.200 150.100 152.300 152.700 150.700 148.500 152.000 150.700 150.000 88.2000 130.500 48.8000 54.1000 59.9000 53.2000 55.6000 57.5000 56.8000 58.6000 55.6000 61.2000 56.7000 57.3000 50.2000 46.1000 35.2000 35.6000 34.7000 36.2000 37.9000 33.8000 38.4000 33.6000 32.8000 33.7000 34.5000 31.8000 22.5000 27.8000 SE(N= 3) 0.340018 5.69182 1.63260 1.28553 5%LSD 104DF 0.953458 15.9607 4.57806 3.60481 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF2 2/ 4/** 13:35 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong/giong lac tu cac to hop lai don (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE SQC KL_100Q KL_100H NSTT GRAND MEAN (N= 159) NO. OBS. 159 10.964 159 150.02 159 54.666 159 34.904 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.2077 0.58893 5.4 0.6118 12.582 9.8585 6.6 0.0029 6.6953 2.8278 5.2 0.9572 4.0019 2.2266 6.4 0.0000 |CT$ | | | 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 | | | | 174 3) Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng từ các tổ hợp lai (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC_2013 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V003 SQC_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .620691E-02 .310346E-02 0.01 0.991 3 2 CT$ 28 54.8710 1.95968 5.92 0.000 3 * RESIDUAL 56 18.5338 .330961 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 73.4110 .853617 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC_2014 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V004 SQC_2014 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .104138 .520689E-01 0.12 0.884 3 2 CT$ 28 40.3635 1.44155 3.42 0.000 3 * RESIDUAL 56 23.5959 .421355 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 64.0635 .744924 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ_2013 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V005 KLQ_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 91.2414 45.6207 0.88 0.423 3 2 CT$ 28 11995.7 428.418 8.26 0.000 3 * RESIDUAL 56 2903.88 51.8550 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 14990.8 174.312 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ_2014 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V006 KLQ_2014 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 304.566 152.283 2.60 0.081 3 2 CT$ 28 11577.9 413.498 7.07 0.000 3 * RESIDUAL 56 3275.17 58.4853 175 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 15157.7 176.252 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH_2013 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V007 KLH_2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 63.3497 31.6749 3.07 0.053 3 2 CT$ 28 1751.38 62.5491 6.06 0.000 3 * RESIDUAL 56 577.670 10.3155 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 2392.40 27.8185 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH_2014 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V008 KLH_2014 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 6.35655 3.17827 0.44 0.653 3 2 CT$ 28 1450.05 51.7875 7.14 0.000 3 * RESIDUAL 56 406.344 7.25614 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 1862.75 21.6599 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT_201 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V009 NSTT_201 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 7.83517 3.91759 1.08 0.347 3 2 CT$ 28 1673.25 59.7590 16.48 0.000 3 * RESIDUAL 56 203.005 3.62509 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 86 1884.09 21.9080 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT_201 FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 8 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V010 NSTT_201 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .709655 .354827 0.09 0.911 3 2 CT$ 28 1329.66 47.4877 12.42 0.000 3 * RESIDUAL 56 214.130 3.82376 ----------------------------------------------------------------------------- 176 * TOTAL (CORRECTED) 86 1544.50 17.9593 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 9 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 SE(N= 5%LSD NOS 29 29 29 29) 56DF NLAI 1 2 3 NOS 29 29 29 SQC_2013 10.8483 10.8586 10.8690 SQC_2014 10.8310 10.7655 10.8448 KLQ_2013 144.666 146.838 144.666 KLQ_2014 142.972 145.217 147.555 0.106829 0.302623 0.120538 0.341458 1.33720 3.78799 1.42012 4.02288 KLH_2013 57.2759 56.2724 55.1862 KLH_2014 56.4586 56.0483 55.8035 NSTT_201 34.8241 35.5172 35.3828 NSTT_201 35.0379 35.2345 35.0483 SE(N= 29) 0.596413 0.500212 0.353558 0.363117 5%LSD 56DF 1.68951 1.41699 1.00155 1.02863 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ 1116.3 1116.1 1116.4 1116.5 1116.7 1116.1.1 CN16-BC2 CN20-BC2 CN22-BC2 CN19-BC2 CN17-BC2 CN15-BC2 CN21-BC2 CN4-BC2 B-F3.3 503.3 0803.1.1 B1-F3 803.3 CN23-BC2 L18.T38 B-F1.13 B-F4.7 B-F4.2 B-F4.9 B-F4.1 L14 Gie NQ V3704 SE(N= 5%LSD NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3) 56DF CT$ NOS SQC_2013 12.2000 11.4000 11.0000 10.3000 11.7000 10.1000 11.4000 12.0000 11.0000 10.7000 10.9000 11.3000 11.9000 10.9000 11.5000 10.5000 11.5000 10.9000 11.3000 10.5000 10.3000 10.4000 10.2000 10.9000 11.1000 11.2000 8.60000 10.3000 8.90000 SQC_2014 11.8000 10.4000 11.3000 10.2000 11.9000 10.4000 11.6000 11.8000 10.8000 10.8000 10.8000 10.7000 11.8000 10.8000 11.5000 10.5000 10.9000 10.3000 11.6000 10.5000 10.8000 10.2000 10.2000 10.6000 11.2000 11.2000 9.00000 10.5000 9.50000 KLQ_2013 140.300 150.800 150.600 149.300 150.300 140.600 145.200 151.200 152.200 142.000 148.400 152.200 153.800 152.100 150.400 149.700 152.300 149.500 143.700 144.100 144.700 138.400 142.400 142.200 147.200 151.300 154.600 88.5000 138.300 KLQ_2014 143.100 148.200 149.300 147.200 149.200 142.400 147.700 150.400 150.000 144.100 149.600 150.100 152.900 150.100 152.700 147.500 150.400 145.100 152.300 147.200 145.100 137.400 144.900 145.500 144.500 150.100 150.000 87.7000 137.500 0.332145 0.940893 0.374769 1.06164 4.15752 11.7773 4.41532 12.5076 KLH_2013 KLH_2014 NSTT_201 NSTT_201 177 1116.3 1116.1 1116.4 1116.5 1116.7 1116.1.1 CN16-BC2 CN20-BC2 CN22-BC2 CN19-BC2 CN17-BC2 CN15-BC2 CN21-BC2 CN4-BC2 B-F3.3 503.3 0803.1.1 B1-F3 803.3 CN23-BC2 L18.T38 B-F1.13 B-F4.7 B-F4.2 B-F4.9 B-F4.1 L14 Gie NQ V3704 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 50.7000 59.3000 51.3000 62.8000 54.5000 52.4000 58.1000 54.1000 58.5000 64.3000 58.7000 58.1000 64.0000 56.4000 56.8000 62.3000 50.4000 57.1000 59.1000 51.1000 52.8000 62.6000 54.6000 55.9000 57.2000 53.6000 58.0000 50.3000 46.1000 53.2000 60.0000 50.6000 63.1000 53.0000 53.3000 59.2000 53.3000 60.3000 62.1000 59.0000 56.8000 61.6000 56.0000 55.1000 60.9000 52.0000 56.6000 58.8000 49.2000 55.2000 61.7000 53.5000 57.3000 56.5000 52.7000 57.6000 51.1000 47.3000 37.3000 41.6000 30.4000 38.3000 36.6000 36.1000 35.7000 36.6000 31.5000 33.9000 35.1000 41.6000 33.6000 40.5000 31.8000 38.9000 37.4000 39.9000 32.2000 37.8000 36.4000 33.4000 36.7000 38.5000 35.3000 36.1000 31.3000 20.3000 27.2000 36.8000 38.3000 31.0000 37.6000 36.9000 37.2000 36.0000 35.9000 30.8000 34.6000 35.7000 39.5000 33.2000 39.8000 32.3000 38.5000 36.0000 37.5000 33.8000 38.4000 38.8000 32.8000 37.2000 38.3000 34.7000 34.9000 32.6000 20.6000 28.4000 SE(N= 3) 1.85432 1.55522 1.09926 1.12898 5%LSD 56DF 5.25289 4.40559 3.11395 3.19814 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF3 2/ 4/** 14:36 ---------------------------------------------------------------- PAGE 10 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong tu to hop lai (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE SQC_2013 SQC_2014 KLQ_2013 KLQ_2014 KLH_2013 KLH_2014 NSTT_201 NSTT_201 GRAND MEAN (N= 87) NO. OBS. 87 10.859 87 10.814 87 145.39 87 145.25 87 56.245 87 56.103 87 35.241 87 35.107 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.92391 0.57529 5.3 0.9914 0.86309 0.64912 6.0 0.8840 13.203 7.2010 5.0 0.4233 13.276 7.6476 5.3 0.0811 5.2743 3.2118 5.7 0.0530 4.6540 2.6937 4.8 0.6530 4.6806 1.9040 5.4 0.3474 4.2378 1.9554 5.6 0.9111 |CT$ | | | 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 | | | | 178 4) Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng lạc ƣu tú (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2014) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V003 SQC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .796249 .398124 0.78 0.473 3 2 CT$ 15 107.308 7.15388 13.95 0.000 3 * RESIDUAL 30 15.3838 .512792 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 123.488 2.62741 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KL_100Q FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V004 KL_100Q LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 74.6562 37.3281 0.65 0.532 3 2 CT$ 15 15975.5 1065.03 18.64 0.000 3 * RESIDUAL 30 1713.66 57.1221 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 17763.8 377.954 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KL_100H FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V005 KL_100H LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 11.0450 5.52249 0.64 0.537 3 2 CT$ 15 4239.27 282.618 32.91 0.000 3 * RESIDUAL 30 257.595 8.58650 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 4507.91 95.9130 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) VARIATE V006 NSTT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 21.1738 10.5869 2.65 0.085 3 2 CT$ 15 1228.92 81.9279 20.54 0.000 3 * RESIDUAL 30 119.646 3.98821 179 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 1369.74 29.1434 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 NOS 16 16 16 SQC 11.6625 11.8812 11.5750 KL_100Q 145.188 147.031 144.000 KL_100H 54.8250 54.2375 55.4125 NSTT 36.1625 35.4938 37.1125 SE(N= 16) 0.179024 1.88948 0.732568 0.499263 5%LSD 30DF 0.517036 5.45698 2.11572 1.44191 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ 1003.7 811.1 1010.6 1009.8 1004.3 1010.5 1004.4 1008.9 1004.5 1004.8 1010.4 1003.4 1003.3 GieNQ MD7 ICGV3704 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 SQC 10.8000 10.5000 13.3000 12.8000 12.3000 13.0000 11.8000 13.8000 14.3000 10.5000 9.80000 10.8000 13.0000 10.3000 11.2000 9.10000 KL_100Q 153.800 140.200 155.000 153.800 156.700 145.500 133.800 148.800 162.300 141.800 148.800 156.600 152.900 81.2000 156.800 138.500 KL_100H 50.0000 55.1000 48.1000 67.1000 67.1000 58.8000 59.6000 55.8000 42.0000 69.6000 57.4000 51.1000 63.6000 33.6000 51.2000 47.1000 NSTT 38.7000 39.6000 40.5000 37.8000 38.4000 36.9000 38.4000 39.5000 38.7000 37.6000 38.2000 36.6000 38.7000 20.7000 32.3000 27.5000 SE(N= 3) 0.413437 4.36357 1.69179 1.15300 5%LSD 30DF 1.19404 12.6024 4.88604 3.32996 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFF 2/ 4/** 15:10 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac dong lac uu tu (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE SQC KL_100Q KL_100H NSTT GRAND MEAN (N= 48) NO. OBS. 48 11.706 48 145.41 48 54.825 48 36.256 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.6209 0.71609 6.1 0.4728 19.441 7.5579 5.2 0.5321 9.7935 2.9303 5.3 0.5374 5.3985 1.9971 5.5 0.0851 |CT$ | | | 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 | | | | 180 5) Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống lạc triển vọng (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, năm 2013-2014) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC2013 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V003 SQC2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .203750 .101875 0.26 0.773 3 2 CT$ 15 114.478 7.63187 19.78 0.000 3 * RESIDUAL 30 11.5763 .385875 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 126.258 2.68634 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE SQC2014 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V004 SQC2014 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .101250 .506250E-01 0.09 0.918 3 2 CT$ 15 175.470 11.6980 19.81 0.000 3 * RESIDUAL 30 17.7188 .590625 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 193.290 4.11255 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ2013 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V005 KLQ2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 53.8363 26.9181 0.74 0.489 3 2 CT$ 15 23846.1 1589.74 43.84 0.000 3 * RESIDUAL 30 1087.82 36.2608 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 24987.8 531.654 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLQ2014 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V006 KLQ2014 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 313.751 156.876 2.66 0.085 3 2 CT$ 15 22042.9 1469.53 24.93 0.000 3 * RESIDUAL 30 1768.23 58.9410 181 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 24124.9 513.295 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH2013 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V007 KLH2013 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 21.0950 10.5475 0.84 0.446 3 2 CT$ 15 4386.71 292.447 23.21 0.000 3 * RESIDUAL 30 378.025 12.6008 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 4785.83 101.826 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLH2014 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V008 KLH2014 LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 30.4800 15.2400 1.89 0.168 3 2 CT$ 15 3945.48 263.032 32.53 0.000 3 * RESIDUAL 30 242.540 8.08468 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 4218.50 89.7553 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT2013 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 7 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V009 NSTT2013 Cu chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF AYE DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 18.3013 9.15063 2.96 0.066 3 2 CT$ 15 1677.42 111.828 36.12 0.000 3 * RESIDUAL 30 92.8789 3.09596 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 47 1788.60 38.0553 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTT2014 FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 8 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) VARIATE V010 NSTT2014 ndt2tnn LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 10.5988 5.29938 1.11 0.343 3 2 CT$ 15 1088.44 72.5629 15.25 0.000 3 * RESIDUAL 30 142.781 4.75938 ----------------------------------------------------------------------------- 182 * TOTAL (CORRECTED) 47 1241.82 26.4218 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 9 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 SE(N= 5%LSD NOS 16 16 16 16) 30DF NLAI 1 2 3 NOS 16 16 16 SQC2013 8.88750 8.93750 9.04375 SQC2014 11.5188 11.5750 11.6313 KLQ2013 144.763 145.594 147.306 KLQ2014 147.663 144.531 141.400 0.155297 0.448511 0.192130 0.554889 1.50542 4.34779 1.91933 5.54318 KLH2013 54.3375 54.3500 55.7500 KLH2014 55.8000 56.8500 54.9000 NSTT2013 30.9438 31.7000 30.1875 NSTT2014 33.7875 33.6063 32.7125 SE(N= 16) 0.887442 0.710839 0.439884 0.545400 5%LSD 30DF 2.56301 2.05296 1.27042 1.57516 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 MD7 GieNQ ICGV3704 SE(N= 5%LSD NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3) 30DF CT$ BWP-1 BWP-2 BWP-3 BWP-4 BWP-5 BWP-6 BWP-7 BWP-8 BWP-9 BWP-10 BWP-11 BWP-12 BWP-13 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 SQC2013 8.90000 6.20000 9.80000 10.0000 7.30000 7.00000 8.40000 6.80000 7.70000 10.1000 9.10000 10.4000 9.80000 9.70000 12.1000 10.0000 SQC2014 12.2000 8.50000 10.5000 8.60000 9.20000 11.3000 12.4000 12.3000 12.4000 12.2000 11.3000 14.2000 12.4000 10.4000 16.2000 11.1000 KLQ2013 158.700 130.800 168.400 142.000 138.900 145.200 164.600 143.400 149.300 154.000 172.800 151.500 170.000 145.500 78.1000 121.000 KLQ2014 148.900 152.800 153.000 122.600 137.900 144.700 167.700 156.100 151.200 159.400 155.000 152.200 167.300 143.400 76.7000 123.600 0.358643 1.03579 0.443706 1.28146 3.47663 10.0408 4.43249 12.8014 KLH2013 57.5000 51.6000 56.6000 56.8000 58.4000 56.4000 57.1000 46.8000 46.8000 65.8000 62.9000 58.8000 75.0000 KLH2014 60.6000 60.3000 57.9000 46.8000 54.4000 58.8000 65.0000 60.2000 60.1000 63.0000 60.4000 58.6000 65.6000 NSTT2013 41.9000 26.1000 35.8000 35.6000 28.0000 28.4000 35.1000 25.8000 25.2000 32.1000 40.1000 31.5000 35.4000 NSTT2014 37.8000 34.1000 33.2000 30.8000 35.6000 34.6000 36.4000 35.2000 35.0000 35.9000 37.4000 36.3000 35.7000 183 MD7 GieNQ ICGV3704 3 3 3 53.6000 35.2000 37.7000 51.2000 32.3000 38.4000 30.8000 21.2000 22.1000 32.3000 19.7000 23.9000 SE(N= 3) 2.04946 1.64161 1.01587 1.25955 5%LSD 30DF 5.91901 4.74112 2.93391 3.63768 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFK 7/ 4/** 15:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 10 Mot so yeu to cau thanh nang suat va nang suat cua cac giong lac trien vong (Trung tam Nghien cuu va Phat trien dau do, nam 2013-2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE SQC2013 SQC2014 KLQ2013 KLQ2014 KLH2013 KLH2014 NSTT2013 NSTT2014 GRAND MEAN (N= 48) NO. OBS. 48 8.9562 48 11.575 48 145.89 48 144.53 48 54.812 48 55.850 48 30.944 48 33.369 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.6390 0.62119 6.9 0.7729 2.0279 0.76852 6.6 0.9176 23.058 6.0217 4.1 0.4885 22.656 7.6773 5.3 0.0846 10.091 3.5498 6.5 0.4460 9.4739 2.8434 5.1 0.1675 6.1689 1.7595 5.7 0.0659 5.1402 2.1816 6.5 0.3426 |CT$ | | | 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 | | | | 184 6) Năng suất của các giống lạc khảo nghiệm (Trung tâm Khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm cây trồng Quốc gia, 2014) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TU LIEM FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V003 TU LIEM LIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 1.00545 .502727 0.14 0.873 3 2 CT$ 10 723.807 72.3807 19.63 0.000 3 * RESIDUAL 20 73.7345 3.68673 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 32 798.547 24.9546 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE NGHE AN FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V004 NGHE AN AN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 1.32546 .662729 0.24 0.793 3 2 CT$ 10 184.282 18.4282 6.62 0.000 3 * RESIDUAL 20 55.6546 2.78273 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 32 241.262 7.53943 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE HAIDUONG FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V005 HAIDUONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .187273 .936363E-01 0.04 0.962 3 2 CT$ 10 68.3400 6.83400 2.85 0.022 3 * RESIDUAL 20 47.9127 2.39564 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 32 116.440 3.63875 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE VINHPHUC FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V006 VINHPHUC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 4.80727 2.40364 1.73 0.202 3 2 CT$ 10 901.800 90.1800 64.80 0.000 3 * RESIDUAL 20 27.8328 1.39164 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 32 934.440 29.2012 ----------------------------------------------------------------------------- 185 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 NOS 11 11 11 TU LIEM 34.5636 34.6091 34.9545 NGHE AN 29.8000 29.3091 29.5545 HAIDUONG 29.5818 29.5182 29.4000 VINHPHUC 19.7636 19.9636 19.0727 SE(N= 11) 0.578927 0.502966 0.466675 0.355686 5%LSD 20DF 1.70782 1.48373 1.37667 1.04926 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ L14 L21 L22 L28 L29 CNC1 CNC3 CNC4 Q2A0 Q2A3 Q2A6 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 TU LIEM 32.9000 36.9000 38.2000 36.9000 35.1000 36.9000 44.0000 34.7000 25.3000 30.7000 30.2000 NGHE AN 29.2000 30.8000 32.3000 33.8000 28.2000 25.7000 29.2000 31.3000 30.3000 28.2000 26.1000 HAIDUONG 30.4000 29.1000 31.3000 29.1000 31.6000 30.3000 30.1000 27.6000 27.2000 30.2000 27.6000 VINHPHUC 16.4000 16.4000 16.9000 27.1000 28.9000 13.8000 19.1000 27.6000 16.0000 15.6000 17.8000 SE(N= 3) 1.10856 0.963107 0.893614 0.681087 5%LSD 20DF 3.27022 2.84114 2.63613 2.00918 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF6 2/ 4/** 16: 2 ---------------------------------------------------------------- PAGE 6 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE TU LIEM NGHE AN HAIDUONG VINHPHUC GRAND MEAN (N= 33) NO. OBS. 33 34.709 33 29.555 33 29.500 33 19.600 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 4.9955 1.9201 5.5 0.8735 2.7458 1.6682 5.6 0.7927 1.9076 1.5478 5.2 0.9619 5.4038 1.1797 6.0 0.2019 |CT$ | | | 0.0000 0.0002 0.0221 0.0000 | | | | BALANCED ANOVA FOR VARIATE VANDIEN FILE THANHF7 2/ 4/** 16: 8 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V003 VANDIEN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .748891 .374445 0.15 0.864 3 2 CT$ 8 425.747 53.2183 21.04 0.000 3 * RESIDUAL 16 40.4711 2.52945 ----------------------------------------------------------------------------- 186 * TOTAL (CORRECTED) 26 466.967 17.9603 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE THAIBINH FILE THANHF7 2/ 4/** 16: 8 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) VARIATE V004 THAIBINH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 44.5089 22.2545 3.54 0.052 3 2 CT$ 8 415.067 51.8833 8.26 0.000 3 * RESIDUAL 16 100.531 6.28320 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 26 560.107 21.5426 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF7 2/ 4/** 16: 8 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) MEANS FOR EFFECT NLAI ------------------------------------------------------------------------------NLAI 1 2 3 NOS 9 9 9 VANDIEN 31.3333 31.2778 31.6556 THAIBINH 42.5667 40.9444 39.4222 SE(N= 9) 0.530141 0.835544 5%LSD 16DF 1.58937 2.50497 ------------------------------------------------------------------------------MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------CT$ NOS VANDIEN THAIBINH L14 3 33.6000 34.5000 L21 3 29.0000 37.9000 L22 3 32.7000 45.8000 L28 3 36.4000 47.3000 L29 3 35.7000 43.6000 CNC1 3 26.1000 40.4000 CNC3 3 30.6000 37.0000 CNC4 3 24.4000 41.7000 Q2A6 3 34.3000 40.6000 SE(N= 3) 0.918231 1.44720 5%LSD 16DF 2.75287 4.33874 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF7 2/ 4/** 16: 8 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 Nang suat cua cac giong lac khao nghiem (Trung tam Khao nghiem giong, san pham cay trong Quoc gia, nam 2014) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE VANDIEN THAIBINH GRAND MEAN (N= 27) NO. OBS. 27 31.422 27 40.978 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI -------------------- SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 4.2380 1.5904 5.1 0.8639 4.6414 2.5066 6.1 0.0524 |CT$ | | | 0.0000 0.0002 | | | | [...]... Vi t Nam, vi c thực hiện đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh hại lạc và xác định các dòng, giống kháng bệnh ở một số tỉnh miền Bắc Vi t Nam mang tính thời sự cấp thiết 2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2.1 Mục tiêu Xác định đƣợc đa dạng di truyền của vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam và. .. bệnh héo xanh vi khuẩn 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả xác định đƣợc sự phân bố biovar, đa dạng di truyền các isolate vi khuẩn R solanacearum ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam làm cơ sở bố trí giống kháng bệnh Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở miền Bắc Vi t Nam thuộc biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1 Một số mẫu giống lạc nhƣ L28, L29 có khả năng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn và có... và dòng, giống lạc kháng bệnh bằng đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử làm cơ sở phòng chống bệnh có hiệu quả 2.2 Yêu cầu Điều tra xác định đƣợc mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam Xác định đƣợc biovar, nòi và đặc điểm sinh học một số isolate vi khuẩn R solanacearum thu thập ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam Đánh giá đa dạng di truyền một số. .. xuất lạc hiệu quả, bền vững 4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu Loài vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh lạc Một số mẫu giống lạc trong tập đoàn, dòng lai, dòng triển vọng và giống lạc đƣợc trồng ở một số tỉnh miền Bắc Vi t Nam là ký chủ của vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại lạc 4.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực hiện tại Vi n Khoa học Nông nghiệp Vi t... tập đoàn mẫu giống lạc (Thanh Trì, năm 2012 - 2013) 3.13 74 Biovar và nhóm đa dạng di truyền của các mẫu bệnh ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam (năm 2012) 3.12 73 Phân bố của các nhóm vi khuẩn R solanacearum hại lạc ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam (năm 2012) 3.11 68 84 Một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực thu của tập đoàn mẫu giống lạc (Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển... héo xanh hại lạc đồng thời phải chọn lọc đƣợc nguồn vật liệu các dòng, giống lạc mang gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử, từ đó làm cơ sở chọn tạo ra các dòng, giống lạc mới mang gen kháng với biovar, nòi vi khuẩn gây bệnh héo xanh hại lạc phổ biến ở các vùng sản xuất Nhằm giải quyết đƣợc các yêu cầu quản lý bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc trong sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc. .. isolate vi khuẩn R solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam Đánh giá đƣợc khả năng chống chịu bệnh héo xanh vi khuẩn của tập đoàn giống, con lai và dòng lạc triển vọng bằng lây nhiễm bệnh nhân tạo kết hợp chỉ thị phân tử 4 Trên cơ sở chọn lọc các dòng, giống kháng bệnh và đánh giá một số đặc điểm nông học chính, xác định đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh, có... Vi t Nam, Vi n Bảo vệ thực vật, Vi n Công nghệ sinh học thuộc Vi n Hàn lâm Khoa học Vi t Nam, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Vi n Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm Nghiên cứu tập trung vào điều tra xác định mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng; xác định đa dạng di truyền, đặc điểm sinh học một số isolate vi 5 khuẩn R solanacearum và sự phân bố của chúng ở một số tỉnh trồng... hóa học, bằng giống kháng bệnh Tuy nhiên sử dụng giống lạc kháng bệnh là biện pháp chủ động và có hiệu quả trong phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn (Liao, 2005a) Trong thời gian qua, Vi n Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Vi t Nam, Vi n Bảo vệ thực vật đã chọn tạo thành công một số giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn nhƣ giống MD7 và giống TK10 phát triển ở một số vùng thƣờng bị bệnh gây hại góp phần... thống trong xác định đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum và chọn lọc giống lạc kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Ứng dụng thành công đánh giá bệnh nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử SSR là pPGPseq3F5, GA161 và 7G2 liên kết với tính trạng kháng bệnh héo xanh vi khuẩn chọn lọc đƣợc các dòng, giống lạc kháng bệnh HXVK và có năng suất cao gồm 26 mẫu giống trong tập đoàn (kháng bệnh HXVK mức kháng trung ... lạc số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam - Phân lập vi khuẩn R solanacearum gây héo xanh lạc thu thập từ số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam Nội dung Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum. .. miền Bắc Vi t Nam 3.1.1 52 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam 52 3.1.2 Triệu chứng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 54 3.1.3 Phân lập vi khuẩn héo xanh hại. .. solanacearum số tỉnh trồng lạc miền Bắc Vi t Nam làm sở bố trí giống kháng bệnh Xác định đƣợc vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc miền Bắc Vi t Nam thuộc biovar 3, biovar thuộc nòi Một số mẫu giống lạc nhƣ