Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn ralstonia solanacearum smith gây bệnh héo xanh tại đà nẵng bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠMNGUYỄN TẤN PHÁT ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG

VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO

XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN TẤN PHÁT

ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG

VI KHUẨN Ralstonia solanacearum Smith GÂY BỆNH HÉO

XANH TẠI ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Ngành : Công nghệ sinh học

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Giáo viên hướng dẫn: TS NGUYỄN MINH LÝ

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Tấn Phát

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các quý thầy, cô khoa Sinh – MôiTrường, trường Đại Học Sư Phạm Đại Học Đà Nẵng đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điềukiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Minh Lýngười thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời giantrao đổi và định hướng cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên tinhthần cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành khóa luận

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về vi khuẩn 4

1.1.1 Phân loại vi khuẩn 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia solanacearum 6 a Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R solanacearum 6

b Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R solanacearum 7

c Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R solanacearum 7

d Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc 8

e Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh 9

1.1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum 10

a Biovar và nòi của vi khuẩn R solanacearum 10

b Chủng 11

c Loài phức 12

d Kiểu gây bệnh 12

e Kiểu quan hệ phả hệ 12

1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới 13

a Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới 13

b Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam 13

1.2 Tổng quan về kỹ thuật RAPD 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu 18

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 18

2.3.2 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 04/2017 đến 04/2018 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Phương pháp thu mẫu 18

2.4.2 Phương pháp phân lập 18

a Mẫu đất 18

b Mẫu cây bệnh 19

2.4.3 Phương pháp xác định biovar của dòng vi khuẩn phân lập 19

2.4.4 Phương pháp phân tích DNA 21

a Phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn 21

2.4.5 Kỹ thuật PCR: 21

2.4.6 Phương pháp điện di trên gel agarose 21

2.4.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R solanacearum bằng phân tích DNA 22

2.4.8 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 22

Bảo quản trên môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Phân lập vi khuẩn héo xanh tại địa bàn Đà Nẵng 24

3.2 Xác định biovar của các chủng vi khuẩn R solanacearum 27

3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền một số chủng vi khuẩn R solanacearum bằng phân tích DNA 29

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum 29

3.3.2 Kết quả phân tích các chủng vi khuẩn với các mồi RAPD 29

3.3.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các chủng VKHX 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

Tiếng việt 35

Tiếng Anh 36

FAO

HXVK

TZC

SPA

PCR

bp

DNA

µg

µL

AP-PCR

DAF

RAPD

TAE

Kb

mg

mL

mM

cs

CTAB

EDTA

Food and Agriculture Organization of the United Nations Héo xanh vi khuẩn

Tetrazolium chloride Sucrose peptone agar Polymerase chain reaction Base pair

Deoxyribonucleic acid Microgram

Microliter Arbitrary primed polymerase chain reaction DNA amplification fingerprinting

Randomly amplified polymorphic DNA Tris-Acetic acid-EDTA

Kilobase Milligram Millilite Millimol Cộng sự cetyltrimethyl-ammonium bromide ethylene diamine tetraacetic acid

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu

bảng

Bảng 2.2 Danh sách 5 đoạn mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 17Bảng 2.3 Phản ứng xác định Biovar vi khuẩn R.solanacearum 20

Bảng 3.2 Đường kính khuẩn lạc trên môi trường TZC sau 24h và 25

48h nuôi cấy

Bảng 3.3 Kết quả xác định biovar của 23 chủng vi khuẩn R. 27

solanacearum gây bệnh héo xanh

Bảng 3.4 Mức độ đa hình của 5 mồi RAPD ngẫu nhiên khi phân 28

tích với 5 chủng vi khuẩn R solanacearum

Bảng 3.5 Hệ số tương đồng di truyền giữa các chủng vi khuẩn 30

héo xanh

DANH MỤC HÌNH ẢNH

solanacearum Smith dưới kính hiển vi

Hình thái các loại kiểu hình của vi

dụng trong nghiên cứu

khuẩn R solanacearum

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định

Hình 3.3 tính đặc hiệu của quy trình phát hiện R. 29

solanacearum sử dụng DNA chiết tách

từ các loài vi khuẩn đã phân lập được

khuẩn héo xanh

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra bệnh héo xanh, và có nguồn gốc

trong đất, được phát hiện lần đầu tiên trên các cây thuộc họ Cà ở Mỹ vào n m 1896.Cho đến nay bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các nước châu Á, Phi, Mỹ, Úc Bệnh bắtđầu xuất hiện ở Châu Âu nhưng gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nước vùng nhiệtđới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm

Bệnh này được coi là một trong n m loại bệnh cây trồng thuộc đối tượng quantâm nhất của chương trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sựkiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nước thuộc cộng đồng châu Âu[5] Đây là loại vi khuẩn có khả n ng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặngtrên cây họ cà như cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ như đậuphụng, gừng chuối, chúng có khả n ng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, dichuyển từ nơi này sang nơi khác Vi khuẩn gây thiệt hại kinh tế lớn đối với các câytrồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây, và có thể làm giảm đáng kể đến

n ng suất và chất lượng của nông sản từ 5-100% tùy theo loài cây, giống cây, vùng địalý

Việt nam là một nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuộc vùng phân bố chính

của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum , bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) được coi

là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trong cả nước như: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình,Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh [15, 16] Bệnh gây hại nghiêmtrọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao độngtrong khoảng 15% đến 35% và ở tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%

Đặc biệt, trên địa bàn thành phố Đà Nẵng do sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnhhéo xanh, nên quá trình sản xuất các loại cây họ cà gặp rất nhiều khó kh n Trong đó,

cà chua và lạc cho n ng suất thấp và hầu như không thể trồng được trên các cánh đồng(đối với cà chua)

Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh HXVK là vấn đề rất khó kh n, đã cónhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học cũng

như các chế phẩm sinh học có khả n ng ức chế và làm giảm tính độc của R.

solanacearum[17] Tuy nhiên, các biện pháp đó còn nhiều hạn chế, bệnh HXVK vẫn

luôn hiện diện, gây hại và luôn là mối lo ngại đối với người sản xuất

Chọn tạo giống mang gen kháng bệnh được xem là biện pháp ưu việt và hiệuquả nhất[13] Nhưng tính kháng của giống phụ thuộc rất nhiều vào độc tính của cácchủng vi khuẩn [1, 14] Và để tạo ra được giống kháng bền vững phải hiểu được đặcđiểm di truyền cũng như độ độc tính của các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khácnhau.

Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tính

đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh tại Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử”.

2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và đánh giá được tính đa dạng di truyền bằng phương pháp sinh học

phân tử các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh tại các vùng

sản xuất nông nghiệp của thành phố Đà Nẵng,

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Cung cấp dẫn liệu khoa học về sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn

Ralstonia solacearum được phân lập tại Đà Nẵng.

Cung cấp các chủng phục vụ trong việc đánh giá tính kháng bệnh bằng phương pháp gây bệnh nhân tạo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn

1.1.1 Phân loại vi khuẩn

Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) được gây ra bởi vi khuẩn Ralstonia

solanacearum , mà trước đây được gọi là Pseudomonas solanacearum do E.F.Smith

nghiên cứu n m 1896, được cho là đã gây bệnh ở khoai tây gây tổn hại nhất, đứng thứhai sau bệnh bạc lá ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (CGIAR 2005) Chúng gâybệnh cho khoảng 30 loài cây trồng cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm (Smith et al.,2003), trong đó cây dễ bị nhất là khoai tây, cà chua, ớt, cà tím, và lạc Nghiên cứu đã

chỉ ra rằng có 5 chủng và 5 biovars của Ralstonia [13].

Hình 1.1: Hình thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith dưới kính hiển vi[18]

Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn được Smith đặt tên là

Bacillus solanacearum Tiếp theo, vi khuẩn được đổi tên là Pseudomonas solanacearum (Smith, 1896) Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia Vi

khuẩn P solanacearum đã được phân loại lại thành Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992) Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B.

solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là

Ralstonia Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B solanacearum đã được đổi

tên lại là R solanacearum(Yabuuchi et al., 1995) Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi khuẩn n m 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum Hiện nay

phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là:

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Lớp (Class): Beta Proteobacteria

Bộ (Order): Burkholderiales

Họ (Family): Ralstoniaceae

Chi (Genus): Ralstonia

Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi

et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010)

Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác là Pseudomonas ricini (Archibald) (Robbs, 1954); Pseudomonas batatae (Cheng và Faan, 1962, Yabuuchi et

al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010)

Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.), vi khuẩn R solanacearum còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau Vi khuẩn R.

solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus

spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var cicla, Capsicum annuum,

Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cynara cardunculus var scolymus, Emilia sonchifolia sp., Eucalyptus sp., Galinsoga parviflora sp., Gossypium sp., Heliconia sp., Heliconia caribaea, Hevea brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale, [25] Tuy nhiên, loài vi khuẩn R solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn

nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các vùng địa lý sinh thái.

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R.

solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs (1993) vi

khuẩn R solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác Đỗ

Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên

cây cà chua, khoai tây, lạc Đoàn Thị Thanh và cs (1995) cho biết vi khuẩn R.

solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây hại trên cây cà

chua, thuốc lá, lạc, cây cà Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký

chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae) N m 1977, Lê Lương Tề (1997a) đã xác định vi khuẩn R solanacearum là

nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác như cà chua, khoai tây, thuốc

lá, cây cà, vừng, ớt và đay

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia

solanacearum a Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R solanacearum.

Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al Tế bào loài R solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu, thường ở dạng đơn, ghép

đôi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi Tuy có sự dao động đáng kể nhưng kích thướccủa chúng khoảng 0,5-0,7 x 1,5-2,0 mm trong kích thước Nó là rất nhạy cảm với khôhạn và bị ức chế trong môi trường có nồng độ natri clorua (NaCl) thấp (2%) Đối vớihầu hết các chủng, nhiệt độ t ng trưởng tối ưu là 24-370C ; Tuy nhiên một số chủng cónhiệt độ thấp hơn tối ưu 20-22,50C (Patrice G Champoiseau và Timur M Momol củaĐại học Florida) Hầu như chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao ở mộtcực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thường nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy,màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấpđều có các lông nhỏ ở rìa [Mehan V K., và Liao B, S., 1994]

Vi khuẩn R solanacearum có cấu tạo đơn bào Cấu trúc của tế bào vi khuẩn

gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lượng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ

và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất nàychứa bào tương, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chấtdinh dưỡng dự trữ.Bào tương giàu RNA còn nhân giàu DNA Bằng kính hiển vi điện

tử có thể phân biệt được các cấu trúc đại phân tử với đường kính khoảng 200 Ao

(Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome Cácphân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein Trong tế bào vi khuẩnkhông thể hiện rõ nhân như trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhưngtrong bào tương thường có thể phân biệt được “những nhiễm sắc thể” mà thườngđược xem như tương ứng với nhân Tế bào chất nằm trong màng bào tương, ngoàimàng bào tương lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạngnhất định Thức n vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hìnhthành trong bào tương cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs., 1983;Izrainxki, 1988; Mehan et al., 1994).

b Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn R solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử và

nhuộm gram âm Vi khuẩn này có khả n ng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate như là

nguồn các bon dự trữ Vi khuẩn R solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy

phân tinh bột, không có khả n ng tạo indol và không sử dụng arginin Tuy nhiên, loài

vi khuẩn này có khả n ng tạo ra H2S, khử nitrat, có khả n ng thủy phân Tween 80, phảnứng dương tính Le-van, phân giải đối với sữa limut, có phản ứng oxidase và catalase, urê,

pectin, ôxi hóa acetat, malonate và gluconate Vi khuẩn R solanacearum chịu đựng kém với muối NaCl Các chủng của vi khuẩn R solanacearum không thể phát triển trên môi trường

chứa 2% NaCl và bị kìm hãm ở môi trường có 0,5% đến

1,5% NaCl (Hayward, 1964; He et al., 1983; Ryan et al., 2008)

c Phương thức tồn tại, xâm nhập và lan truyền của vi khuẩn R solanacearum.

Vi khuẩn R solanacearum tồn tại trong đất, trong tàn dư thực vật Nhiều loài cỏ

dại còn là ký chủ phụ của loài vi khuẩn này, là cầu nối giữa nguồn bệnh với cây trồng

Vi khuẩn còn tồn tại trong hạt giống, trên vỏ hạt, vỏ lụa và trong phôi hạt (Middleton

và Hayward, 1990; Machmud, 1993; Anitha et al., 2003)

R solanacearum sinh sống trong các mô mạch của vật chủ của nó Vi khuẩn

thường xâm nhập vào rễ cây từ đất thông qua vết thương hoặc các lỗ tự nhiên nơi rễphụ nổi lên, xâm nhập khoang gian bào của vỏ rễ và nhu mô mạch, và cuối cùng đi vàocác mạch xylem và lan lên thân cây và lá cây, nơi mật độ tế bào mầm bệnh thường

vượt 10-9 CFU / g mô vật chủ Sau R solanacearum đã xâm chiếm các xylem, số lượng

lớn các tế bào vi khuẩn được đổ ra từ rễ, cung cấp một con đường cho vi khuẩn trở lại

đất và bắt đầu lây nhiễm mới ,vật chủ bị ảnh hưởng bị úa, còi cọc, héo, và thường chếtnhanh chóng [12]

Bệnh lây lan chủ yếu qua đất Trong số các vi khuẩn hại cây trồng thì vi khuẩn

R solanacearum bền vững nhất trong đất Vi khuẩn R solanacearum có thể sống sót

trong đất bỏ hoang vài n m thậm chí cả khi không có cây trồng trên đất đó Vi khuẩn R.

solanacearum có thể sống qua đông trong đất, đất bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh ban

đầu quan trọng nhất Vi khuẩn tồn tại lâu trong đất khi trồng liên tục cây ký chủ nhiễmbệnh hoặc có sự kết hợp với cây ký chủ khác xen kẽ trên đồng ruộng Vi khuẩn tồn tạitốt ở đất đủ ẩm, thoáng khí, nhưng bị kìm hãm ở đất khô và đất bị ngập nước Vi

khuẩn R solanacearum lây lan chủ yếu qua đất nhưng cũng dễ dàng truyền lan theo nguồn nước, qua mưa gió và qua những vết thương cơ giới, qua dụng cụ sản xuất của

con người, cũng có thể qua vết thương ở rễ do côn trùng và tuyến trùng gây ra(Middleton và Hayward, 1990)

d Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc

Sự phát sinh, phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có liên quan chặt chẽvới các yếu tố thời tiết khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm, mưa, gió, độ pH đất, Từ lúcxâm nhiễm tới khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên của bệnh phải trải qua một khoảngthời gian nhất định Thời gian đó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh

Bệnh phát triển mạnh, thuận lợi trong điều kiện thời tiết nóng ẩm nhất là ở nhiệt

độ từ 250C đến 350C nên bệnh gây hại chủ yếu là ở vùng nhiệt đới Đất có độ ẩm cao

>60% và độ pH 5 - 6,8 thích hợp cho sự sinh trưởng của vi khuẩn (Anitha et al., 2003).Bệnh hại nặng hơn trên đất cát pha, thịt nhẹ, trên ruộng nghèo chất hữu cơ, độc canhcây ký chủ… Bệnh phát triển kém, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn trên các ruộng luâncanh lạc với lúa nước, các loài cây không phải là ký chủ và trên đất kiềm hoặc bón vôi

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs (1995) cho rằng bệnh HXVK hại lạc làmột trong những bệnh phổ biến phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ và ẩm

độ tương đối cao Theo Lê Lương Tề (1997b), bệnh HXVK hại lạc thường phát sinh ở cảhai thời vụ trồng là lạc Xuân và lạc Thu Trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt,cây sinh trưởng kém, đất cát, nhất là trên đất trồng độc canh cây lạc, bệnh gây hại nặng Khinghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu tố sinh thái, kỹ thuật, LêLương Tề (1997b) cho rằng bệnh có thể phát sinh ở các giai

đoạn sinh trưởng của cây, cao điểm của bệnh là thời kỳ cây ra hoa đến quả non, sau đóbệnh giảm ở giai đoạn quả già Về ảnh hưởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụnghạn chế tác hại của bệnh, cho n ng suất lạc cao hơn so với đối chứng Chế độ luân canh

có ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh, chu kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hạicủa bệnh càng giảm Ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnhHXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc Xuân - lạc Thu hoặc lúa - khoai tây -lạc Nguyễn Xuân Hồng và cs (1997) cho rằng ở phía bắc Việt Nam, bệnh HXVK phátsinh và gây hại nặng trên vùng đất đồi, đất bãi ven sông, còn trên đất luân canh với lúanước thì mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn Đỗ Tấn Dũng (1999) nghiên cứu bệnh HXVKhại lạc ở vùng Đông Anh, Hà Nội có nhận xét bệnh phát sinh và gây hại nặng từ giaiđoạn cây lạc ra hoa rộ đến quả non

Nguyễn V n Viết và Phan Duy Hải (2010) nghiên cứu mối tương quan giữabệnh và biện pháp canh tác đã cho rằng trồng lạc liên tục trên đất gò đồi và đất dốcmiền núi làm gia t ng tích lũy nguồn bệnh và làm t ng tỷ lệ bệnh các n m tiếp theo

e Chuẩn đoán bệnh héo xanh vi khuẩn và phân lập vi khuẩn gây bệnh.

Trên đồng ruộng có thể xác định bệnh nhanh bằng cách cắt một đoạn thân ngắnkhoảng 3 cm gần gốc thân cây bị bệnh, ngâm vào cốc nước, sau một thời gian xuấthiện dòng dịch vi khuẩn màu trắng đục chảy ra từ vết cắt Cắt dọc theo thân cây, dễdàng nhận thấy mạch dẫn bị chuyển màu thành nâu sẫm hoặc nâu nhạt (Wang và Hou,1983) Phương pháp chẩn đoán này cũng đã được áp dụng tại Việt Nam (Burgess etal., 2009; Nguyễn Tất Thắng và Đỗ Tấn Dũng, 2010)

Có nhiều phương pháp để xác định vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo

xanh hại lạc như phân lập trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, phương pháp huyếtthanh, phương pháp phân tích PCR (Mehan và Mc Donald, 1995)

Theo Mehan (1995), môi trường tetrazolium chloride agar (TZC) phù hợp để

phân lập vi khuẩn R solanacearum, còn môi trường sucrose peptone agar (SPA) phù hợp để nhân vi khuẩn R solanacearum Trên môi trường TZC khuẩn lạc vi khuẩn R.

solanacearum có hình tròn, nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn, ở giữa có màu phớt

hồng, còn trên môi trường SPA, khuẩn lạc của vi khuẩn R solanacearum có hình dạng

tròn, nhẵn bóng, màu trắng sữa

Nhiều công trình nghiên cứu về phương pháp và ứng dụng kỹ thuật PCR(polymerase chain reaction) trong chẩn đoán bệnh trên cây trồng và các ứng dụng khác

trong bệnh học thực vật đã được công bố Phương pháp PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn

so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống nhờ có độ nhạy cao, tốc độ nhanh.Bằng phương pháp ứng dụng PCR, chỉ một vài giờ, từ một đoạn DNA ban đầu và đoạnmồi có thể nhân lên hàng tr m triệu lần sau đó đi sâu phân tích kiểu gen, xác định, nhận

biết một cách chính xác nòi, biovar vi khuẩn R solanacearum ở trong mẫu cây bệnh

cũng như trong đất nhiễm bệnh Theo kết quả nghiên cứu của các phòng thí nghiệmtham gia mạng lưới nghiên cứu vi khuẩn héo xanh ở các nước và vùng lãnh thổ châu

Á, Thái Bình Dương như: Australasia, Đài Loan, Philippines,… thì sản phẩm PCR của

các mẫu phân lập thuộc loài R solanacearum sử dụng với chỉ thị 759/760 có kích

thước không đổi là 281 cặp bazơ (base pair-bp) và chỉ có các chủng cho sản phẩm PCR

có kích thước như vậy mới có tính độc (Opina et al., 1997)

1.1.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum.

a Biovar và nòi của vi khuẩn R solanacearum

Trong hơn 40 n m qua, nhiều tác giả sử dụng khái niệm nòi và biovar để phân

biệt đặc tính gây bệnh của vi khuẩn R solanacearum Biovar của vi khuẩn R.

solanacearum được xác định dựa trên khả n ng chuyển hóa cacbon hydrat, cụ thể là

khả n ng ô xy hóa 3 đường đôi (cellobiose, lactose, maltose) và 3 rượu Hexo - cacbon

(dulcitol, manitol, sorbitol) [25] Hiện nay, 5 biovar của vi khuẩn R solanacearum đã

được ghi nhận bao gồm:

- Biovar 1: không oxy hóa cacbon hydrat

- Biovar 2: oxy hóa đường nhưng không oxy hóa rượu

- Biovar 3: oxy hóa tất cả cacbon hydrat

- Biovar 4: chỉ oxy hóa rượu

- Biovar 5: oxy hóa lactose, maltose, cellobiose và manitol nhưng không oxy hóa sorbitol, dulcitol

Các mẫu R solanacearum thuộc biovar 2 phân lập từ vùng Amazon (châu Mỹ)

có đặc tính sinh hóa khá khác biệt (dựa trên khả n ng sử dụng đường ribose và đườngtrehalose).Nhóm này được đặt tên là biovar 2-T (hoặc N2) còn biovar 2 gốc được đổithành biovar 2-A (Hayward, 1995b)

Biovar 1, biovar 3 và biovar 4 gây hại cho lạc còn biovar 2 và biovar 5 khônggây bệnh cho lạc Biovar 1 gây bệnh trên lạc ở Mỹ, còn hầu hết các chủng gây bệnhtrên cây lạc ở các nước châu Á, châu Phi chủ yếu là biovar 3, biovar 4 và thuộc nòi 1

Theo Wu et al (2013), 11 chủng của vi khuẩn R solanacearum thu thập từ các tỉnh

khác nhau của Trung Quốc thuộc biovar 3

Buddenhahem và Kelman (1964), Hayward (1964), He et al (1983) đã phân

chia các chủng vi khuẩn R solanacearum thành 5 nòi (race) dựa trên phổ ký chủ N m nòi của R solanacearum gồm:

Nòi 1 (race 1): Có phạm vi ký chủ rộng, lây nhiễm các cây họ cà (Solanaceae)

và một số cây họ đậu (Leguminoseae), phân bố chủ yếu ở vùng đất thấp của vùng nhiệt

đới và cận nhiệt đới Nòi 1 gồm biovar 1, biovar 3 và biovar 4

Nòi 2 (race 2): Gây bệnh trên chuối (Heliconia spp.) ở miền Trung và Nam Mỹ

gồm biovar 2 và biovar 3

Nòi 3 (race 3): Phạm vi ký chủ hẹp gây bệnh chủ yếu cho khoai tây, cà chua vàđược tìm thấy ở vùng ôn đới vĩ độ cao và ở những vùng nhiệt đới cao Nòi 3 chỉ cóbiovar 2

Nòi 4 (race 4): Gây hại trên gừng, tìm thấy chủ yếu ở Philippines Nòi 4 chỉ cóbiovar 4

Nòi 5 (race 5): Gây hại trên cây dâu tằm, lần đầu tiên được phát hiện ở TrungQuốc Nòi 5 chỉ có biovar 5

Ở Việt Nam, Nguyễn Xuân Hồng và cs (1997) cho rằng các nguồn vi khuẩn R.

solanacearum phân lập được kiểm tra đều có tính độc cao đối với cây lạc và một số cây ký

chủ khác, các mẫu phân lập được đều thuộc nòi 1, biovar 3 và biovar 4

Đỗ Tấn Dũng (1999) cho rằng, tác nhân gây ra bệnh HXVK trên cây cà chua, cà

pháo, lạc, khoai tây ở tỉnh Ninh Bình đều do loài vi khuẩn R solanacearum Smith,

thuộc nòi 1, biovar 3 Các chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân lập từ các cây kýchủ đều có khả n ng lây bệnh chéo cho nhau, mức độ nhiễm bệnh khác nhau, điều đóthể hiện tính độc, tính gây bệnh giữa các chủng vi khuẩn cũng khác nhau

Qua một số kết quả nghiên cứu công bố gần đây cho thấy ở nước ta vi khuẩngây bênh héo xanh ở cây và chua thuộc division Châu Á (Lê Lương Tề, 2002), Race 1,biovar 3 và 4 (Nguyễn Thị Yến, 2002)

b Chủng

Cho tới nay, không có một định nghĩa chính thức về chủng (strain) của vi khuẩn

R solanacearum Các tác giả trên thế giới thường sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các

mẫu vi khuẩn R solanacearum khác nhau về bất cứ đặc điểm nào như nguồn gốc phân

lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền

Chủng của vi khuẩn R solanacearum khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân

bố, độc tính, mối quan hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Buddenhagen vàKelman, 1964) Bên cạnh phương pháp truyền thống xác định nòi dựa vào phạm vi kýchủ và xác định biovar dựa vào phản ứng sinh hóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử,ngày nay phân tích DNA trở thành phương pháp chính xác và phù hợp để xác địnhchủng nhiều loại ký sinh

Nguyễn V n Tuất và cs (2007) đã phân tích tính đa hình của 25 chủng vi khuẩnvới 10 mồi ngẫu nhiên cho thấy có sự sai khác về mặt di truyền của chúng và phân chiathành 2 nhóm gồm nhóm I và nhóm II

c Loài phức

Khi phân tích đa dạng vi khuẩn gây bệnh héo xanh, Gillings và Fahy (1993) đã

nhận thấy vi khuẩn R solanacearum rất đa dạng và gợi ý rằng vi khuẩn này có lẽ là

một loài phức (complex species) Theo Fegan và Prior (2005) “loài phức” là một tậphợp các cá thể có quan hệ gần gũi nhưng thuộc các loài khác nhau Các nghiên cứu đadạng vi khuẩn dựa trên lai DNA cho thấy vi khuẩn héo xanh cực kỳ đa dạng với mức

độ tương đồng DNA của các mẫu vi khuẩn thường < 70% (là ngưỡng thường được

sử dụng để phân biệt vi khuẩn ở mức loài) Hiện nay, vi khuẩn R solanacearum chính

thức được xem là một loài phức (Meng, 2013)

d Kiểu gây bệnh

Các chủng vi khuẩn héo xanh còn được phân biệt thành các kiểu gây bệnh(pathotype) dựa trên phản ứng đối với một loại cây trồng nào đó Theo Tan et al

(1994), 36 mẫu vi khuẩn R solanacearum thu thập từ 6 tỉnh của Trung Quốc đã được

xếp thành 7 kiểu gây bệnh khác nhau cụ thể dựa trên độc tính của chúng đối với 6giống lạc chỉ thị (Xiekangking, Taishan sanlirou, Huangchuan zhigan, Lukang qing,Fuhua Sheng, Ehua 1)

e Kiểu quan hệ phả hệ

Gần đây, một hệ thống phân loại nữa gọi là kiểu quan hệ phả hệ (phylotype) 20

đã được áp dụng nhằm đánh giá đa dạng vi khuẩn R solanacearum Cách phân loại

này dựa trên phân tích trình tự các gen mã hóa như gen 16S RNA ribosome, gen egl,gen hrpB, và gen mutS (Poussier et al., 2000; Allen et al., 2005; Prior và Fegan, 2005)

Có 4 phylotype (Denny, 2006) đã được ghi nhận và phân tích cho thấy các phylotypetương quan với nguồn gốc địa lý của các chủng: phylotype I gồm các chủng chủ yếu từchâu Á, phylotype II từ châu Mỹ, phylotype III từ châu Phi và các đảo thuộc Ấn ĐộDương và phylotype IV từ Indonesia (Remenant et al., 2011) Nhìn chung, phylotype

là hệ thống phân loại rất ổn định và có ý nghĩa về mặt tiến hóa đối với phức hợp loài vi

khuẩn R solanacearum (Meng, 2013).

1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam và trên Thế giới

a Nghiên cứu bệnh héo xanh trên thế giới

Vi khuẩn gây bệnh héo xanh phân bố rộng rãi khắp các nước trên thế giới Đã từ

lâu vi khuẩn Ralstonia solanacearum được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Ralstonia solanacearum đã được công bố và đưa

ra những kết quả rất có ý nghĩa khoa học kỹ thuật và trong sản xuất nông nghiệp

Tại Đài Loan bằng phương pháp PCR với cặp primer PS-IS đặc hiệu với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc race 1, kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum thu thập trên cà chua, khoai tây, ớt, lạc, cà tím và nhiều loại

cây trồng khác đều thuộc race 1 (Yung-An Lee, 2001)

Phân tích trên 120 dòng vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên cà chua,

khoai tây, cà tím, ớt và nhiều loại cây trồng khác từ Châu Á, Mỹ, Âu, Phi và châu Đại

Dương cho thấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum thuộc division Châu Á thường bao

gồm biovar 3 và 4, divison Châu Mỹ thường bao gồm biovar 1 và 2

Tác giả đã phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum từ cây cà chua có triệu

chứng héo xanh, nước tưới và đất Phân tích gen gây bệnh thu được cặp mồi (Hrp_rs2F: 5'-AGAGGTCGACGCGATACAGT-3' và Hrp_rs 2R: 5'-CATGAGCAAGGACGAAGTCA-3') để khuếch đại bộ gen của vi khuẩn DNA của 27

mẫu vi khuẩn R solanacearum thuộc nòi 1 biovar 3 và 4 Độ đặc hiệu của mồi đã được thử nghiệm trên 13 chủng R solanacearum so sánh vs nhóm vi khuẩn khác như

Xanthomonas oryzae pv oryzae, X campestris pv campestris, và X citri subsp citri.

Sản phẩm của đoạn mồi khuếch đại gen của R solanacearum tại 323 bp.[32]

b Nghiên cứu bệnh héo xanh ở Việt Nam

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum cũng được nhiều nhà nghiên cứu tại Việt

Nam điều tra và nghiên cứu

Trương Thị Hồng Hải và cs, 2016 “nghiên cứu đa dạng di truyền của các chủng

vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith ở một số tỉnh miền Bắc bằng chỉ thị RAPD”.

Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá đa dạng di truyền của 26 chủng vi khuẩn Ralstonia

solanacearum Smith được thu thập ở các vùng trồng cây họ cà và bầu bí ở miền bắc bằng

chỉ thị phân tử RADP Tổng số 100 chỉ thị phân tử RADP được dùng để đáng giá kiểu gencủa một số chủng vi khuẩn đại diện cho cây họ cà và bầu bí , trong đó có 44 chỉ thị biểu hiện

đa hình Tuy nhiên , trong số các chỉ thị đa hình chỉ có 21 chỉ thị phân tử RADP khuếch đạicác đoạn DNA rõ nét và ổn định và được chọn để đánh giá kiểu gen của 26 chủng vi khuẩn.Sản phẩm PCR của chỉ thị RADP được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc2.1 Kết quảcho thấy 26 chuẩn vi khuẩn được chia thành 6 nhóm chính

Ngoài ra, bà và cs đã nghiên cứu thêm ở một số tỉnh miền Nam Trong nghiêncứu này , đã sử dụng 24 chỉ thị RADP để nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 chủng vi

khuẩn Ralstonia solanacearum Smith đại diện cho một số vùng sinh thái khác nhau ở

Miền Nam đã thu được tổng số 923 b ng DNA Dựa vào mức độ tương đồng về hệ số

di truyền , 19 chủng vi khuẩn được chia thành 5 nhóm chính Như vậy, các chuẩn vi

khuẩn Ralstonia solanacearum được thu thập trên các kí chủ khác nhau có sự khác biệt

về di truyền cao hơn so với các chủng ở các vùng sinh thái khác nhau

Ngọ V n Ngôn và cs đã nghiên cứu và sử dụng 10 đoạn mồi RAPD để đánh giá

đa dạng di truyền của một số chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh hại

lạc bao gồm: OPAB5, OPAL8, OPAK14, OPB7, OPC2, OPC15, OPE17, OPE18,OPE19 và OPE20 Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của cácphân đoạn DNA khi so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng 1 mồi Số phân đoạnDNA nhân bản dao động từ 8 đến 30 phân đoạn tùy thuộc vào từng loại mồi RAPDkhác nhau Kết quả ghi nhận được cho thấy tất cả 10 mồi nghiên cứu đều cho đa hình.Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi

so sánh giữa các chủng với nhau trong cùng một mồi.[13]

1.2 Tổng quan về kỹ thuật RAPD

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR vớicác mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở

vị trí bắt mồi [17]

Cùng với sự phát minh ra phản ứng chuỗi mở rộng (PCR-polymerase chainreaction) bởi Mullis n m 1983 và việc đưa vào sử dụng enzyme DNA polymerase chịunhiệt n m 1988, kĩ thuật in dấu DNA (fingerprinting) đã được cách mạng hóa để tạo ramột số lượng lớn các chỉ thị trong thời gian ngắn, với DNA khuôn mẫu ở lượngnanogram, tự động hóa trong hoạt động cho hiệu quả cao, mạnh và những phân tíchđáng tin cậy Mặc dù có nhiều tiến bộ to lớn trong các chỉ thị phân tử để có được cácthông tin di truyền nhưng RAPD vẫn được sử dụng bởi một số lý do Phương phápnày có những thuận lợi đáng kể so với các phương pháp khác bởi vì nó nhanh, yêu cầulượng DNA ít, phù hợp khi làm việc trên genome chưa từng biết trước, có tính kinh

tế, không liên quan đến các thủ tục phức tạp liên quan đến xác định trình tự DNA, chỉyêu cầu một phòng thí nghiệm đơn giản với phương tiện tối thiểu cho thực hiện PCR,

và có thể phát hiện đa hình trong bất kì loại trình tự nào [6], [14]

Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34-37oC) Mặc dù trình tự mồi RAPD làngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải là 40% (thường

là 50-80%) và không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau Sản phẩm RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5-2,0%

PCR-Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và cóthể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung Hơn nữa, kỹ thuật RAPD đơngiản và dễ thực hiện Nhưng kỹ thuật RADP có hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định

do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp; Hầu như tất cả các marker RAPD là maker trội Nókhông có khả n ng phân biệt đoạn DNA được khuếch đại từ một locus là đồng hợp (2 bảnsao) hay dị hợp (1 bản sao) Hiếm khi có marker RAPD đồng trội nhận biết được kíchthước khác nhau của đoạn DNA khuếch đại từ cùng một locus Sự đa hình các đoạnkhuếch đại chủ yếu là do thay thế hay mất bazơ trong vị trí gắn mồi, sự chèn làm cho các

vị trí gắn mồi quá xa để mà có thể khuếch đại thành công hay sự thêm/mất bazơ có thể làmthay đổi kích thước của đoạn được khuếch đại Mặc dù số lượng đoạn khuếch đại khôngphụ thuộc vào kích thước genome và mức đa bội thể nhưng phản ứng khuếch đại đượcxác định một phần bởi sự cạnh tranh vị trí gắn mồi trong genome Mồi sẽ bám tốt hơn khimức độ tương đồng cao hơn [6], [14] RADP sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng ditruyền giữa các loài [1, 12, 13, 14, 19, 22, 23, 24], trong

nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài vàxác định con lai

Kỹ thuật PCR với các mồi ngẫu nhiên (Arbitarily Primed PCR-AP-PCR) và lấydấu bằng nhân bản DNA (DNA amplification fingerprinting-DAF) là hai kỹ thuậtđược phát triển độc lập và là hai dạng biến thể của kỹ thuật RAPD Đối với AP-PCRchỉ dùng một mồi đơn có độ dài 10 đến 15 nucleotide Kỹ thuật được thực hiện khácvới PCR bình thường là hai chu kỳ đầu được tiến hành ở điều kiện không chặt chẽ(nhiệt độ bắt mồi thấp) sau đó ở các chu kỳ sau PCR được tiến hành trong điều kiệnchặt chẽ bằng việc t ng nhiệt độ bắt mồi Trong trường hợp DAF thì chỉ sự dụng mộtmồi ngẫu nhiên ngắn hơn 10 nucleotide và sản phẩm PCR được phân tích bằng gelpolyacrylamide Với DAF, mồi sử dụng ngắn nhưng nồng độ mồi cần cao, phản ứngPCR gồm hai chu kỳ nhiệt chứ không phải ba chu kỳ như RAPD Kỹ thuật APPCRkhác với RAPD và DAF là: phản ứng PCR chia thành ba bước, mỗi bước có độ chặtchẽ và nồng độ của các thành phần phản ứng khác nhau Nồng độ mồi ở những chu kỳđầu cao, mồi dài 20 nucleotide hoặc hơn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn bệnh: Mẫu đất và

quy hoạch trồng rau sạch trên địa

Hòa Khánh (HK), Hòa Khương

(HP’)

mẫu cây bị bệnh HXVK được thu thập từ các vùngbàn thành phố Đà Nẵng: Cẩm Lệ (CL), Sơn Trà (ST),(Hkh), Hòa Phong (HP), Hòa Nhơn (HN), Hòa Phú

Bảng 2.1 Tọa độ các địa điểm lấy mẫu

Để đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng R solanacearum phân lập

được đã sử dụng 5 đoạn mồi RAPD (Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa) (Bảng