ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN và độ độc TÍNH của các CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM ở MIỀN bắc VIỆT NAM

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HATSADONG CHANTHANOUSONE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ ĐỘ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Khoa học trồng HUẾ - 2016 i ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HATSADONG CHANTHANOUSONE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ ĐỘ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 60.62.01.10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRƯƠNG THỊ HỒNG HẢI CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CHẤM KHÓA LUẬN GS.TS TRẦN VĂN MINH HUẾ - 2016 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân Các liệu luận văn có nguồn gốc rõ ràng Số liệu phục vụ cho trình nghiên cứu thu thập từ việc tiến hành thí nghiệm, phân tích trung thực chưa cơng bố trước Huế, tháng năm 2016 Tác giả luận văn Hatsadong Chanthanousone iii TÓM TẮT Kết nghiên cứu tập trung phần liên quan mật thiết với nhau: Định danh vi khuẩn, Đánh giá đa dạng di truyền 35 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum thị RAPD dựa kết tách chiết DNA, phân tích đa hình kỹ thuật PCR-RAPD, xây dựng sơ đồ phả hệ DNA 35 chủng vi khuẩn Đánh giá tính kháng giống cà chua độ độc tính chủng vi khuẩn đại diện Kết phân tích cho thấy 35 chủng vi khuẩn thuộc phylotype I, có mức độ đa dạng di truyền cao chia thành nhóm Phân tích thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho thấy giống cà chua nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn từ trung bình đến nặng; Nghiên cứu độc tính chủng vi khuẩn, cho thấy chủng Rs319, Rs341, Rs386 có độ độc tính cao gây bệnh nặng giống kháng (73,3%); chủng Rs101, Rs127, Rs373 biểu độ độc tính thấp gây bệnh nặng giống cà chua thí nghiệm TN52 (tỷ lệ bệnh từ 93,3-100%) iv Sau thời gian học tập nghiên cứu trường Đại học Nông lâm - Đại học Huế, đến tơi hồn thành Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp chuyên ngành Khoa học trồng Trước hết xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám hiệu trường Đại học Nông lâm Huế trường Đại học Savannakhet tạo điều kiện cho học tập làm việc Việt Nam Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến TS Trương Thị Hồng Hải, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô trực tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức khoa học chuyên ngành thời gian học tập trường Cuối cùng, xin cám ơn đến gia đình, tập thể sinh viên Lào kí túc xá trường Bia hai người bạn tốt Trần Thị Thanh, Đỗ Thị An giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực luận văn v Huế, tháng năm 2016 Hatsadong Chanthanousone vi MỤC LỤC Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Tóm tắt……… ………………………………………………………………………iii Lời cảm ơn iv MỤC LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ xi MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐÊ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA ĐÊ TÀI .2 Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐÊ NGHIÊN CỨU .3 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÊ VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM 1.1.1 Vi khuẩn R solanacearum 1.1.2 Các nghiên cứu vi khuẩn R solanacearum giới 1.1.3 Nghiên cứu vi khuẩn R solanacearum Việt Nam .7 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÊ BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN 1.2.1 Triệu chứng bệnh .8 1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh điều kiện phát sinh bệnh 1.2.3 Các phương pháp chẩn đoán, phát bệnh héo xanh vi khuẩn .10 1.2.4 Biện pháp phòng trừ 10 1.2.5 Các nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn giới 14 1.2.6 Các nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn nước 15 1.2.7 Các nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua Việt Nam 16 1.3 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYÊN .17 vii 1.3.1 Tổng quan đa dạng sinh học - đa dạng di truyền .17 1.3.2 Ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền .18 1.3.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 18 1.3.4 Các kết sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 25 1.3.5 Các nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum 26 1.3.5.1 Kết nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum giới 26 1.3.5.2 Kết nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum Việt Nam 27 Chương 29 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .29 2.1.1 Mục tiêu chung 29 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 29 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Đánh giá đa dạng di truyền chủng vi khuẩn R solanacearum 29 2.2.2 Đánh giá độ độc tính chủng vi khuẩn R solanacearum 29 2.3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .29 2.3.1 Nguồn vi khuẩn R solanacearum 29 2.3.2 Giống cà chua 31 2.3.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 31 2.3.4 Vật liệu nghiên cứu 32 2.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 32 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn .33 2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA 33 2.5.3 Phương pháp xác định vi khuẩn R solanacearum .33 2.5.4 Phương pháp xác định phylotype vi khuẩn R solanacearum .34 viii 2.5.5 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn R solanacearum .34 2.5.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo .35 Chương 40 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .40 3.1 NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYÊN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN .40 3.1.1 Kết tách chiết DNA 40 3.1.2 Xác định vi khuẩn R solanaceaarum thị phân tử .40 [M: 100bp ladder, 1-Rs101, 2-Rs109, 3-Rs124, 4-Rs127, 5-Rs136, 6-Rs139, 7-Rs150, 8-Rs169, 9-Rs179, 10-Rs182, 11-Rs183, 12-Rs194, 13-Pss4 (ĐC1), 14-Pss190 (ĐC2)] 41 3.1.3 Xác định Phylotype chủng vi khuẩn R solanacearum 41 3.1.4 Kết phân tích đa hình kỹ thuật RAPD .42 44 3.1.5 Đánh giá kiểu gen chủng vi khuẩn kỹ thuật RAPD 44 3.1.6 Đánh giá mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn 46 3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN .51 3.2.1 Diễn biến bệnh héo xanh sau lây nhiễm giống cà chua 51 3.2.2 Độ độc tính chủng vi khuẩn 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 67 Trương Thị Hồng Hải, Trần Thị Thanh, Hatsadong Chanthanousone (2016), “Nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith số tỉnh miền Bắc thị RAPD”, Tạp chí phát triển nơng thơn (18) kỳ tháng 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 75 ix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism AVRDC : The World Vegetable Center (Trung tâm rau giới) Cs : Cộng DNA : Deoxy ribonucleic acid dNTP : Deoxy nucleotide triphosphates H7996 : Haiwaii 7996 HXVK : Héo xanh vi khuẩn PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Phân tích DNA đa hình nhân ngẫu nhiên) RE : Restriction enzyme RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNA : Ribonucleic acid SSR : Simple Sequence Repeats TBE : Tris-Boric acid-EDTA TE : Tris-EDTA TLB : Tỷ lệ bệnh WVa700 : West Virginia 700 82 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN21 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 100.00 A 100.00 A 3 100.00 A 100.00 A 93.33 AB 93.33 AB 2 86.67 ABC 86.67 ABC 86.67 ABC 86.67 ABC 80.00 ABCD 73.33 ABCDE 73.33 ABCDE 66.67 BCDE 66.67 BCDE 60.00 CDE 53.33 DEF 46.67 EF 26.67 FG 13.33 G 1 6.67 G Comparisons of means for the same level of giong Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 14.764 Critical T Value 2.028 Critical Value for Comparison 29.944 Error term used: ln*giong*chung, 36 DF 83 Comparisons of means for different levels of giong Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 14.877 Critical T Value 2.145 Critical Value for Comparison 31.905 Error terms used: ln*giong and ln*giong*chung There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN28 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 100.00 A 100.00 A 100.00 A 100.00 A 3 100.00 A 100.00 A 100.00 A 93.33 A 2 93.33 A 93.33 A 93.33 A 93.33 A 86.67 AB 80.00 AB 73.33 AB 73.33 AB 66.67 AB 53.33 BC 26.67 CD 1 20.00 D 13.33 D 84 Comparisons of means for the same level of giong Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 16.287 Critical T Value 2.028 Critical Value for Comparison 33.031 Error term used: ln*giong*chung, 36 DF Comparisons of means for different levels of giong Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 16.097 Critical T Value 2.120 Critical Value for Comparison 34.122 Error terms used: ln*giong and ln*giong*chung There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another Split-plot AOV Table for SLN4 Source DF SS MS ln 88.89 44.4444 giong 88.89 44.4444 Error ln*giong 292.06 73.0159 chung 342.86 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 0.61 0.5878 57.1429 0.90 0.5056 800.00 66.6667 1.05 0.4279 36 2285.71 63.4921 62 3898.41 Grand Mean 1.2698 CV(ln*giong) 672.91 CV(ln*giong*chung) 627.50 85 Split-plot AOV Table for SLN7 Source DF SS MS ln 1155.6 577.78 giong 3593.7 1796.83 Error ln*giong 4977.8 1244.44 chung 1727.0 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 1.44 0.3373 287.83 1.69 0.1519 1739.7 144.97 0.85 0.6005 36 6133.3 170.37 62 19327.0 F P Grand Mean 13.016 CV(ln*giong) 271.03 CV(ln*giong*chung) 100.28 Split-plot AOV Table for SLN14 Source DF SS MS ln 2641.3 1320.63 giong 18755.6 9377.78 Error ln*giong 2539.7 634.92 chung 11200.0 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total 14.77 0.0142 1866.67 4.45 0.0018 2400.0 200.00 0.48 0.9149 36 15085.7 419.05 62 52622.2 Grand Mean 51.111 CV(ln*giong) 49.30 CV(ln*giong*chung) 40.05 86 Split-plot AOV Table for SLN21 Source DF SS MS ln 1181.0 590.5 giong 31200.0 15600.0 Error ln*giong 1447.6 361.9 chung 12927.0 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 43.11 0.0020 2154.5 6.59 0.0001 3644.4 303.7 0.93 0.5298 36 11771.4 327.0 62 62171.4 Grand Mean 71.429 CV(ln*giong) 26.63 CV(ln*giong*chung) 25.32 Split-plot AOV Table for SLN28 Source DF SS MS ln 342.9 171.4 giong 33181.0 16590.5 Error ln*giong 1333.3 333.3 chung 6742.9 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 49.77 0.0015 1123.8 2.82 0.0234 6819.0 568.3 1.43 0.1984 36 14323.8 397.9 62 62742.9 Grand Mean 79.048 CV(ln*giong) 23.10 CV(ln*giong*chung) 25.23 87 Chỉ số bệnh Split-plot AOV Table for SLN4 Source DF SS MS ln 3.556 1.77778 giong 3.556 1.77778 Error ln*giong 11.683 2.92063 chung 13.714 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 0.61 0.5878 2.28571 0.90 0.5056 32.000 2.66667 1.05 0.4279 36 91.429 2.53968 62 155.937 Grand Mean 0.2540 CV(ln*giong) 672.91 CV(ln*giong*chung) 627.50 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN4 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 4.0000 A 1.3333 B 1 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 88 2 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 3 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 1.3109 Critical T Value 2.021 Critical Value for Comparison 2.6495 There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another Split-plot AOV Table for SLN7 Source DF SS MS ln 26.41 13.2063 giong 177.27 88.6349 Error ln*giong 282.92 70.7302 chung 152.38 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 1.25 0.3780 25.3968 1.71 0.1459 178.29 14.8571 1.00 0.4661 36 533.33 14.8148 62 1350.60 89 Grand Mean 2.9206 CV(ln*giong) 287.96 CV(ln*giong*chung) 131.79 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN7 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 12.000 A 5.3333 AB 5.3333 AB 5.3333 AB 5.3333 AB 4.0000 B 4.0000 B 4.0000 B 4.0000 B 2.6667 B 2 2.6667 B 3 2.6667 B 1.3333 B 1.3333 B 1.3333 B 1 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 0.0000 B 90 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 3.6884 Critical T Value 2.021 Critical Value for Comparison 7.4545 There are groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another Split-plot AOV Table for SLN14 Source DF SS MS ln 201.65 100.83 giong 2007.37 1003.68 Error ln*giong 641.02 160.25 chung 1606.10 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 6.26 0.0586 267.68 3.30 0.0109 481.52 40.13 0.49 0.9045 36 2922.67 81.19 62 7860.32 Grand Mean 14.349 CV(ln*giong) 88.22 CV(ln*giong*chung) 62.79 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN14 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 33.333 A 26.667 AB 22.667 ABC 21.333 ABCD 21.333 ABCD 18.667 ABCDE 3 18.667 ABCDE 91 2 17.333 BCDEF 16.000 BCDEF 14.667 BCDEFG 14.667 BCDEFG 13.333 BCDEFG 13.333 BCDEFG 10.667 CDEFG 10.667 CDEFG 8.0000 CDEFG 6.6667 DEFG 6.6667 DEFG 4.0000 EFG 2.6667 FG 1 0.0000 G Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 7.7068 Critical T Value 2.021 Critical Value for Comparison 15.576 There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another Split-plot AOV Table for SLN21 Source DF SS MS ln 1710.2 855.11 giong 9762.0 4881.02 Error ln*giong 929.0 232.25 chung 5659.4 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 21.02 0.0076 943.24 6.37 0.0001 705.5 58.79 0.40 0.9555 36 5328.8 148.02 62 24095.0 92 Grand Mean 35.873 CV(ln*giong) 42.48 CV(ln*giong*chung) 33.92 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN21 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 61.333 A 54.667 AB 54.667 AB 50.667 ABC 49.333 ABC 48.000 ABC 3 46.667 ABCD 2 42.667 ABCDE 42.667 ABCDE 42.667 ABCDE 38.667 BCDEF 37.333 BCDEF 34.667 BCDEF 33.333 CDEF 26.667 DEFG 26.667 DEFG 22.667 EFGH 20.000 FGH 12.000 GH 5.333 H 1 2.667 H 93 Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 10.213 Critical T Value 2.021 Critical Value for Comparison 20.640 There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another Split-plot AOV Table for SLN28 Source DF SS MS ln 1233.3 616.63 giong 17944.9 8972.44 Error ln*giong 2049.0 512.25 chung 4890.4 giong*chung 12 Error ln*giong*chung Total F P 17.52 0.0105 815.07 2.87 0.0218 3985.8 332.15 1.17 0.3410 36 10232.4 284.23 62 40335.7 Grand Mean 55.492 CV(ln*giong) 40.79 CV(ln*giong*chung) 30.38 LSD All-Pairwise Comparisons Test of SLN28 for giong*chung giong chung Mean Homogeneous Groups 2 76.000 A 74.667 A 73.333 AB 72.000 AB 3 70.667 AB 94 69.333 AB 66.667 AB 66.667 AB 65.333 AB 64.000 ABC 64.000 ABC 61.333 ABC 60.000 ABC 58.667 ABC 56.000 ABC 53.333 ABC 45.333 BCD 36.000 CDE 17.333 DEF 8.000 EF 1 6.667 F Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 14.307 Critical T Value 2.021 Critical Value for Comparison 28.916 There are groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another 95 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Tách chiết DNA vi khuẩn R solanacearum Cà chua trước lây nhiễm Cà chua sau lây nhiễm 96 5,48,50-54,56-58,62-68,73,105 (19 2-4,6-47,49,55,59-61,69-72,74-104,106 (86 ... loại đánh giá độ độc tính chủng vi khuẩn R solanacearum miền Bắc Vi t Nam Từ thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền độc tính chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum miền. .. điểm di truyền độ độc tính chủng vi khuẩn vùng sinh thái khác Ở Vi t Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền chủng vi khuẩn gây hại họ cà thu thập miền Nam (Trương Thị Hồng Hải cs, 2015) lạc miền Bắc. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HATSADONG CHANTHANOUSONE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ ĐỘ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM Ở MIỀN BẮC VI T NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên