Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn bacillus spp từ đầm nuôi tôm tại hải phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHẠM THỊ HIỀN HÒA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC LUẬN VĂN THẠC SĨ Nha Trang – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Phạm Thị Hiền Hòa NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC Chuyên ngành: NTTS Mã số: 60 62 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Nguyễn Hữu Dũng Nha Trang - 2011 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Ký tên ii Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng tới thầy hướng dẫn Ts. Nguyễn Hữu Dũng- Khoa NTTS - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang, đã định hướng và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành bản luận văn này. Xin cảm ơn chân thành Ban Giám Hiệu nhà trường, Pgs. Ts. Lại Văn Hùng - Trưởng khoa NTTS - Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian tham gia khóa học. Xin chân thành cảm ơn Lãnh Đạo Viện, các cán bộ thuộc phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển, phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Hải Sản đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện luận văn. Lời cảm ơn chân thành tới Ts. Nguyễn Văn Nguyên đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học này Lời cảm ơn sâu sắc tới mẹ tôi đã luôn khích lệ và động viên tinh thần tôi tham gia khóa học này. Xin bày tỏ lời cảm ơn đặc biệt tới chồng và hai con gái tôi, đây là nguồn động viên và giúp đỡ lớn lao để tôi có thể hoàn thành bản luận văn. Chân thành cảm ơn tới các thành viên khác trong gia đình đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Một lần nữa, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tác giả Phạm Thị Hiền Hòa iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình NTTS trên thế giới 3 1.1.1. Sản lượng NTTS 3 1.1.2. Diện tích NTTS 5 1.2. Tình hình NTTS tại Việt Nam 6 1.2.1. Sản lượng NTTS 6 1.2.2 Diện tích NTTS 7 1.3. Tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong NTTS 9 1.3.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường trong NTTS 9 1.3.2. Tình trạng dịch bệnh trong NTTS 10 1.4. Các bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản 11 1.4.1. Các nhóm tác nhân gây bệnh thường gặp trong nuôi trồng thủy sản 11 1.4.2. Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. (Vibriosis) 12 1.4.2.1. Một số đặc điểm phân loại Vibrio 12 1.4.2.2. Vibriosis trên đối tượng thủy sản 13 1.4.2.3. Các biện pháp phòng trị bệnh Vibriosis trên đối tượng NTTS 14 1.5. Probiotic và các vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm probiotic 15 1.5.1. Khái niệm về probiotic 16 1.5.2. Cơ chế hoạt động của các nhóm vi sinh vật probitic 16 1.5.3. Một số nhóm vi sinh vật probiotic 18 1.5.4. Một số đặc điểm sinh học của chi Bacillus ứng dụng làm chế phẩm probiotic 19 1.5.3.1. Đặc điểm sinh học tế bào 19 1.5.3.2. Đặc tính probiotic của chi Bacillus 20 1.6. Ứng dụng của probiotic trong NTTS 20 1.6.1. Ứng dụng probiotic trong NTTS trên thế giới 20 1.6.2. Ứng dụng probiotic trong NTTS ở Việt Nam 22 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26 2.2. Vật liệu nghiên cứu 26 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: 26 2.2.2. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn 26 2.2.3. Một số thuốc thử và hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa, sinh lý 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 26 iv 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 27 2.3.3. Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và giữ giống vi khuẩn Bacillus spp 27 2.4. Xác định khả năng ức chế Vibrio spp gây bệnh 27 2.4.1. Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus. 28 2.4.2. Ức chế vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus 28 2.4.3. Đồng nuôi cấy trong nước biển 28 2.5. Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh 29 2.6. Phân loại và định danh vi khuẩn 29 2.7. Phương pháp xử lý, phân tích số liệu 31 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Phân lập và lựa chọn một số chủng vi khuẩn Bacillus spp ruột tôm sú và bùn đáy đầm nuôi tôm sú tại Hải Phòng 33 3.2. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh tôm sú Vibrio spp 34 3.2.1. Cô lập vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus 34 3.2.2. Ức chế vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus thể hiện bằng vòng tròn kháng khuẩn 37 3.2.3. Ức chế sự phát triển của vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng 39 3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập 41 3.4. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái vi khuẩn phân lập 44 3.5. Phân tích trình tự gen 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn phân lập 46 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4. 1. Kết luận 53 4.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC v BẢNG CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT NTTS Nuôi trồng thủy sản GHCP Giới hạn cho phép FAO Food and Agriculture Organization - Tổ chức Nông Lương Liên Hiệp Quốc WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới RQ Risk Quote - Chỉ số tai biến MPN Most probable number: Mật độ vi khuẩn WSSV White Spot Syndrome Virus: Bệnh virút đốm trắng YHV Yellow Head Virus: Bệnh virút đầu vàng MBV Baculovirus Monodon: Bệnh virút trên tôm HPV Hepatopancreatic Parvovirus Disease: Bệnh gan tụy VNN viral nervous necrosis- VNN: Bệnh hoại tử thần kinh vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Sản lượng NTTS thế giới trong các năm 2004 - 2009 (triệu tấn) 3 Bảng 2: Các nước có sản lượng NTTS cao nhất thế giới 4 Bảng 3: Diện tích ao nuôi nước ngọt và nước lợ tại một số nước trên thế giới 6 Bảng 4: Một số loài vi khuẩn được sử dụng làm probiotic 19 Bảng 5: Khả năng cô lập vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm và bùn đáy đầm nuôi tôm 37 Bảng 6: Đường kính vòng ức chế của các chủng phân lập đối với vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus 38 Bảng 7: Kết quả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio spp của các chủng vi khuẩn phân lập (theo tỷ lệ %) 40 Bảng 8: Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn phân lập được 45 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 : Cơ cấu sản lượng và giá trị của một số nhóm loài được nuôi trồng trên thế giới 5 Hình 2: Chọn lọc chủng vi khuẩn Bacillus spp bằng phản ứng catalase 33 Hình 3: Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. parahaemolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C) 34 Hình 4: Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. alginolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C). 35 Hình 5: Các đĩa thạch NA nuôi cấy chung chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) với vi khuẩn V. parahaemolyticus (hàng trên, đường cấy ngang), hoặc V. alginolyticus (hàng dưới, đường cấy ngang) với khi mới cấy (A, D), sau 24h (B, E) và sau 48h (C,F) 35 Hình 6: Các đĩa thạch NA nuôi cấy chung chủng QKB7 phân lập từ bùn đáy đầm nuôi tôm sú (đường cấy dọc) với vi khuẩn V. parahaemolyticus (hàng trên, đường cấy ngang), hoặc V. alginolyticus (hàng dưới, đường cấy ngang) với khi mới cấy (A, D), sau 24h (B, E) và sau 48h (C,F). 36 Hình 7: Đĩa thạch cấy V. alginolyticus (A) và V. parahaemolyticus (B) có đặt các đĩa giấy đường kính 10mm thấm dung dịch vi khuẩn phân lập từ ruột tôm sú (QKR2, QKR3) và bùn đáy ao nuôi (QKB7) sau 24 giờ nuôi cấy 38 Hình 8: Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKR3 theo thời gian 40 Hình 9: Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKR2 theo thời gian 40 Hình 10: Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKB7 theo thời gian 40 Hình 11: Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và V. parahaemolyticus, chủng QKR3, QKR2 và QKB7 nuôi cấy riêng (chủng đối chứng) theo thời gian 40 Hình 12 : Chu kỳ sinh trưởng của chủng vi khuẩn QKR2, QKR3 và QKB7 42 Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKR2 42 Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKR3. 42 viii Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKR2. 42 Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKR3. 42 Hình 17: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKR2 43 Hình 18: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKR3 43 Hình 19: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43 Hình 20: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43 Hình 21: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng QKB7 43 Hình 22: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR2. 44 Hình 23: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR3. 44 Hình 24: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKB7. 45 Hình 25: Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1% 47 Hình 26: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 và các loài có quan hệ họ hàng gần 48 Hình 27: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR3 và các loài có quan hệ họ hàng gần 49 Hình 28: Cây phát sinh chủng loại của chủng QKB7 và các loài có quan hệ họ hàng gần 50 [...]... Thành - qu n Dương Kinh - thành ph H i Phòng a i m phân tích, x lý m u: Phòng Nghiên c u Công ngh Sinh h c Bi n Vi n Nghiên c u H i s n H i Phòng 2.2 V t li u nghiên c u 2.2.1 i tư ng nghiên c u: Vi khu n Bacillus spp có trong bùn ao nuôi tôm và h tiêu hóa c a tôm sú 2.2.2 Các môi trư ng nuôi c y vi khu n a Môi trư ng phân l p và nuôi c y các ch ng vi khu n Bacillus spp [23]: - Môi trư ng NA (Nutrient... n các ch ng vi khu n t vùng nuôi NTTS Vi t Nam Do ó, dùng làm ch ph m probiotic phù h p v i i u ki n th c ti n có cơ s phát tri n các ch ph m probiotic trong nư c có giá thành h , phù h p v i i u ki n th như ng và khí h u Vi t Nam, chúng tôi l a ch n tài t t nghi p Nghiên c u phân l p m t s ch ng vi khu n Bacillus spp t 2 m nuôi tôm t i H i Phòng làm ngu n nguyên li u s n xu t probiotic trong nư c”... h u qu c a vi c phá v cân b ng sinh thái trong b ho c ao nuôi [87] Nghiên c u c a Chanratchakool cho th y, tôm nuôi trư c khi c m nhi m b nh vi khu n Vibrio ã có s thay t nhiên sang màu i t màu s c , i u ó ch ng t là tôm nuôi b “stress” S suy gi m môi trư ng t ao nuôi tôm óng m t vai trò quan tr ng trong vi c gây “stress” c a tôm d n n s c m nhi m th phát c a vi khu n Vibrio [37] Vi khu n Vibrio xâm... c tiêu c a tài là phân l p ư c m t s ch ng vi khu n Bacillus spp có ti m năng s d ng như là vi khu n probiotic v i m c ích là cơ s t o ngu n vi khu n s n xu t ch ph m probiotic trong nư c N i dung nghiên c u c a - tài: Phân l p m t s ch ng vi khu n Bacillus và l a ch n ng u nhiên m t s ch ng phân l p ư c; - ánh giá kh năng i kháng v i ch ng vi khu n gây b nh thư ng g p trên tôm là Vibrio algilyticus... tinh khi t cho nghiên c u nh hư ng n ng mu i n s sinh trư ng c a ch ng vi khu n phân l p 2.3 Phương pháp nghiên c u 2.3.1 Phương pháp thu m u - M u tôm sú và bùn ư c thu ng u nhiên trong m nuôi tôm sú vào lúc sáng s m, sau ó ư c em v phòng thí nghi m x lý và phân tích - V t ư c r a b ng xà phòng, sau ó r a l i b ng nư c máy, r a l i b ng nư c trong m nuôi tôm Dùng v t b t tôm trong m, ch n tôm kh e m nh,... Edwardsiella spp gây ra, b nh virus m tr ng (WSBV), virus u vàng (YHV), b nh MBV, b nh gan t y (HPV) là nh ng b nh thư ng hay x y ra trên tôm he, b nh xu t huy t do virus x y ra trên cá chép, ho i t th n kinh (VNN) ra trên nhi u cá; b nh vibriosis do nhóm vi khu n Vibrio spp gây i tư ng nuôi th y s n, h i ch ng l loét cá, b nh c cơ c a tôm càng xanh… [9] 1.4.2 B nh do nhóm vi khu n Vibrio spp (Vibriosis) Vibriosis... chi Bacillus ng d ng làm ch ph m probiotic Nhi u loài trong chi Bacillus ư c coi là thích h p làm probiotic, không ch trong th c ph m dành cho ngư i mà trong c các ch ph m dùng cho chăn nuôi, NTTS Probiotic g m các ch ng Bacillus spp cũng có nh ng hi u qu r t tích c c do chi vi khu n này có m t s c i m và c tính r t phù h p phát tri n thành probiotic dư i d ng ch ph m 1.5.3.1 c i m sinh h c t bào Vi. .. cá rô phi ơn tính, rô phi probiotics hay vaccine cho tôm còn r t m i [21] , vi c t o ra các men 23 Vi t Nam, nh ng nghiên c u v vi c s d ng men vi sinh trư ng nuôi th y s n nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương c i thi n môi i ít Trong nh ng năm g n ây, B Th y s n ã cho phép lưu hành s d ng nhi u ch ph m vi sinh [2] và nhi u nơi ã làm quen v i vi c s d ng các ch ph m vi sinh này và có k t qu khá... do các loài vi khu n thu c chi Vibrio gây ra các loài ng v t th y s n 1.4.2.1 M t s c i m phân lo i Vibrio Vi khu n Vibrio phân b r t ph bi n trong môi trư ng nư c bi n, vùng nư c l ven bi n, phân b các t ng nư c khác nhau, có th tìm th y ngay c trong tr m 13 tích áy ho c trên b m t c a các sinh v t s ng trong vùng nư c ó Theo nghiên c u c a Th Hòa, bi n, m t Vi t Nam cho th y vi khu n Vibrio t n t... nhi m v i V harveyi, trong khi k t qu t 26% [96] S d ng Bacillus trong nuôi tôm th t tr i không s i ch ng ch Indonesia s an toàn trong 160 ngày, các d ng Bacillus h u như g p th t b i, b nh vi khu n phát sáng do Vibrio thư ng làm tôm ch t trư c 80 ngày [80] Dòng BY-9 ư c c y v i m t gi m m t 106 CFU/ml vào b ương u trùng tôm sú làm Vibrio và cho t l s ng cao hơn i ch ng [109] Nghiên c u c a Wang Xiang- . Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn Bacillus spp từ 2 đầm nuôi tôm tại Hải Phòng làm nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic trong nước . Mục tiêu của đề tài là phân lập được một số chủng. NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC Chuyên ngành: NTTS Mã số: 60 62. THỊ HIỀN HÒA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ ĐẦM NUÔI TÔM TẠI HẢI PHÒNG LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT PROBIOTIC TRONG NƯỚC LUẬN