NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG XẠ KHUẨN Streptomyces spp. ĐỐI KHÁNG VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI

i NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG XẠ KHUẨN Streptomyces spp ĐỐI KHÁNG VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI Tác giả HUỲNH NGỌC QUANG Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS Võ Thị Thu Oanh ThS Đặng Thị Kim Uyên Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2012 ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin khắc ghi công ơn sinh thành dưỡng dục cha mẹ, động viên thương yêu sẻ chia người thân gia đình suốt thời gian qua Tiếp đến, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Võ Thị Thu Oanh ThS Đặng Thị Kim Un giúp tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp Đồng thời, tơi xin trân trọng biết ơn đến: Ban chủ nhiệm khoa Nông học ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi thực đề tài tốt nghiệp Ban Lãnh Đạo Viện, anh chị làm việc môn BVTV Viện Cây ăn Quả Miền Nam nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Các bạn lớp giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn tất người điều Chân thành cảm ơn Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 Tác giả Huỳnh Ngọc Quang iii TÓM TẮT Huỳnh Ngọc Quang, khoa Nông Học – trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Đề tài: “Nghiên cứu phân lập số dòng xạ khuẩn Streptomyces spp đối kháng với tác nhân gây bệnh thối rễ có múi” Người hướng dẫn: TS Võ Thị Thu Oanh ThS Đặng Thị Kim Uyên Đề tài tiến hành với nội dung: Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces từ mẫu đất thu thập từ vườn có múi tỉnh Tiền Giang Đánh giá khả đối kháng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces với tác nhân gây bệnh thối rễ có múi điều kiện in vitro Kết đạt được: Từ vườn có múi bị bệnh thối rễ tỉnh Tiền Giang qua trình phân lập, kết thu chủng xạ khuẩn VCTG-1, VCTG-2, VCTG-3, VBTG-4, VBTG-5, VBTG-6, VQTG-7, VQTG-8.Trong có chủng Cái Bè, chủng Châu Thành chủng Cai Lậy Thí nghiệm đối kháng với nấm Fusarium solani đĩa petri: kết đạt chủng xạ khuẩn phân lập có chủng khơng thể tính đối kháng với nấm Fusarium solani (VBTG-5, VBTG-6 VQTG-7), chủng thể tính đối kháng mức độ khác chủng VCTG-1, VCTG-2, VCTG-3, VBTG-4 VQTG-8 Trong chủng VBTG-4 thể tính đối kháng lớn Thí nghiệm đối kháng với nấm Phytophthora nicotianae đĩa petri: kết đạt chủng xạ khuẩn phân lập có chủng khơng thể tính đối kháng với Phytophthora nicotianae VCTG-3 VBTG-5, chủng lại thể tính iv đối kháng mức độ khác gồm chủng VCTG-1, VCTG-2, VBTG-4, VBTG6, VQTG-7 VQTG-8 Trong chủng VQTG-8 thể tính đối kháng lớn v MỤC LỤC Nội dung Trang TRANG TỰA………………………………………………………………………………i LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC BẢNG .vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu xạ khuẩn 2.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn 2.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 2.1.3 Vai trò xạ khuẩn 2.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nước giới 2.2 Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 2.2.1 Vị trí phân loại phân bố 2.2.2 Vai trò xạ khuẩn Streptomyces 2.3 Giới thiệu có múi 12 2.3.1 Phân loại nguồn gốc có múi 12 vi 2.3.2 Công dụng có múi 12 2.3.3 Tình hình sản xuất có múi 13 2.3.4 Sơ lược bệnh vàng thối rễ có múi 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Phân lập xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 28 4.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 28 4.1.2 Hình thái xạ khuẩn nhuộm Gram 37 4.2 Khả đối kháng xạ khuẩn Streptomyces nấm gây bệnh thối rễ điều kiện in vitro 39 4.2.1 Khả đối kháng với nấm Fusarium solani phòng thí nghiệm 39 4.2.2 Khả đối kháng với Phytophthora nicotianae phòng thí nghiệm 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 52 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1: Đặc điểm chủng xạ khuẩn phân lập 39 Bảng 4.2: Khả đối kháng chủng xạ khuẩn nấm Fusarium solani……… 40 Bảng 4.3: Mức độ đối kháng chủng xạ khuẩn nấm Fusarium solani…… 42 Bảng 4.4: Khả đối kháng chủng xạ khuẩn Phytophthora nicotianae 44 Bảng 4.5: Mức độ đối kháng chủng xạ khuẩn Phytophthora nicotianae… 46 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ minh họa đĩa cấy nuôi xạ khuẩn lam .25 Hình 4.1: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-1 30 Hình 4.2: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-2 31 Hình 4.3: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-3 32 Hình 4.4: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-4 33 Hình 4.5: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-5 34 Hình 4.6: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VCTG-6 35 Hình 4.7: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VQTG-7 36 Hình 4.8: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn VQTG-8 37 Hình 4.9: Hình cuống sinh bào tử bào tử 38 Hình 4.10 : Khả đối kháng chủng VBTG-4 với Fusarium solani…………… 43 Hình 4.11: Khả đối kháng chủng VBTG-5 với Fusarium solani…………… 43 Hình 4.12: Khả đối kháng chủng VBTG-5 với Phytophthora nicotianae……………………………………………………………………………… 47 Hình 4.13: Khả đối kháng chủng VQTG-8 với Phytophthora nicotianae……………………………………………………………………………… 47 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IPM : Intergrated pest management Cs: Cộng A2pm: Acid diamino pimelic Ctv: Cộng tác viên ISP: International Streptomyces Project ĐBSCL: Đồng sông Cửu Long GSC: Giờ sau cấy NT: Nghiệm thức VCTG: Vườn Cam Tiền Giang VBTG: Vườn Bưởi Tiền Giang VQTG: Vườn Quýt Tiền Giang Chương GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cây có múi tên gọi chung nhóm cam, chanh, quýt, bưởi… họ ăn lớn, nhiều người ưa chuộng nhiều nhà vườn trồng Cây có nhiều cơng dụng dùng để làm nước giải khát, ăn tươi, làm mứt, lấy tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa Vỏ dùng để làm thuốc, hương liệu Tuy nhiên với tình hình sâu bệnh ngày phát triển mạnh mẽ làm ảnh hưởng khơng nhỏ đến việc canh tác có múi Trong bệnh vàng thối rễ tác nhân quan trọng gây hại nặng loại bưởi, cam sành, quýt,…làm ảnh hưởng đến suất chất lượng Để giải tình trạng đa số bà nơng dân lựa chọn phương pháp sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên việc lạm dụng loại thuốc hóa học làm ảnh hưởng xấu đến môi trường, làm cân sinh thái: tăng tính kháng thuốc, tiêu diệt thiên địch tự nhiên, làm xuất trở lại số dịch hại gây ô nhiễm môi trường Cho nên việc nghiên cứu biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh hại trồng điều cần thiết Vì biện pháp sinh học có ưu điểm hẳn so với biện pháp hóa học có khả khắc phục hạn chế biện pháp hố học như: khơng độc người, động vật mơi trường Chính mà biện pháp sinh học ngày nghiên cứu phổ biến rộng rãi Trong nhiều hướng nghiên cứu biện pháp sinh học có hướng nghiên cứu nhiều người quan tâm Đó sử dụng chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn để phòng trừ tác nhân gây hại cho trồng 70 Phụ lục 5.2: Khả đối kháng với nấm Fusarium solani phòng thí nghiệm 72 GSC Case Range : 51 - 58 Variable : 72h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.3870 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1.077 s_ = 0.2782 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Mean = 15.60 Ranked Order D Mean = 22.00 A Mean = 17.00 C Mean = 18.60 B Mean = 18.60 B Mean = 17.00 C Mean = 22.00 A Mean = 15.60 D Mean = 0.0000 F Mean = 12.00 E Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 12.00 E Mean = 0.0000 F 71 Phụ lục 5.3: Khả đối kháng với nấm Fusarium solani phòng thí nghiệm 96 GSC Case Range : 49 - 56 Variable : 96h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.2130 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.7993 s_ = 0.2064 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Mean = 14.40 Ranked Order D Mean = 21.60 A Mean = 15.80 C Mean = 17.20 B Mean = 17.20 B Mean = 15.80 C Mean = 21.60 A Mean = 14.40 D Mean = 0.0000 F Mean = 10.80 E Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 10.80 E Mean = 0.0000 F 72 Phụ lục 5.4: Khả đối kháng với nấm Fusarium solani phòng thí nghiệm 120 GSC Case Range : 50 - 57 Variable : 120h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.1750 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.7245 s_ = 0.1871 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Mean = 12.60 Ranked Order D Mean = 20.40 A Mean = 14.40 C Mean = 15.60 B Mean = 15.60 B Mean = 14.40 C Mean = 20.40 A Mean = 12.60 D Mean = 0.0000 F Mean = 9.800 E Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 0.0000 F Mean = 9.800 E Mean = 0.0000 F 73 Phụ lục 6: Bảng ANOVA khả đối kháng xạ khuẩn với Phythophthora nicotianae phòng thí nghiệm Phụ lục 6.1: Khả đối kháng với Phythophthora nicotianae phòng thí nghiệm 48 GSC Function: ANOVA-1 Data case no to 52 One way ANOVA grouped over variable (nt) with values from to Variable (48h) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 2620.175 32 9.200 374.311 1301.950 0.0000 0.287 Total 39 2629.375 Coefficient of Variation = 4.33% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 5.00 73.000 14.600 0.55 0.24 5.00 75.000 15.000 0.71 0.24 74 5.00 0.000 0.000 0.00 5.00 107.000 5.00 0.000 0.000 0.00 0.24 5.00 49.000 9.800 0.45 0.24 5.00 77.000 15.400 0.55 0.24 5.00 114.000 22.800 0.45 0.24 21.400 0.89 0.24 0.24 -Total 40.00 495.000 Within 12.375 0.54 Bartlett's test Chi-square = 88.510 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 8.21 1.30 75 Phụ lục 6.2: Khả đối kháng với Phythophthora nicotianae phòng thí nghiệm 72 GSC Function: ANOVA-1 Data case no to 40 One way ANOVA grouped over variable (nt) with values from to Variable (72h) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 2475.775 32 8.000 353.682 1414.729 0.0000 0.250 Total 39 2483.775 Coefficient of Variation = 4.23% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 5.00 66.000 13.200 0.45 0.22 5.00 70.000 14.000 0.71 0.22 5.00 0.000 0.000 5.00 101.000 20.200 0.00 0.84 0.22 0.22 76 5.00 0.000 0.000 0.00 0.22 5.00 46.000 9.200 0.45 0.22 5.00 76.000 15.200 0.45 0.22 5.00 114.000 22.800 0.45 0.22 -Total 40.00 473.000 Within 11.825 0.50 Bartlett's test Chi-square = 87.875 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 7.98 1.26 77 Phụ lục 6.3: Khả đối kháng với Phythophthora nicotianae phòng thí nghiệm 96 GSC Function: ANOVA-1 Data case no to 48 One way ANOVA grouped over variable (nt) with values from to Variable (96h) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 2160.775 32 7.600 308.682 1299.714 0.0000 0.238 Total 39 2168.375 Coefficient of Variation = 4.48% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 5.00 56.000 11.200 0.45 0.22 5.00 62.000 12.400 0.55 0.22 5.00 0.000 0.000 5.00 94.000 18.800 0.00 0.84 0.22 0.22 78 5.00 0.000 0.000 0.00 0.22 5.00 44.000 8.800 0.45 0.22 5.00 71.000 14.200 0.45 0.22 5.00 108.000 21.600 0.55 0.22 -Total 40.00 435.000 Within 10.875 0.49 Bartlett's test Chi-square = 86.759 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 7.46 1.18 79 Phụ lục 6.4: Khả đối kháng với Phythophthora nicotianae phòng thí nghiệm 120 GSC Function: ANOVA-1 Data case no to 50 One way ANOVA grouped over variable (nt) with values from to Variable (120h) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 1825.375 32 8.400 260.768 993.401 0.0000 0.262 Total 39 1833.775 Coefficient of Variation = 5.21% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 5.00 47.000 9.400 0.55 0.23 5.00 53.000 10.600 0.55 0.23 5.00 0.000 0.000 5.00 85.000 17.000 0.00 0.71 0.23 0.23 80 5.00 0.000 0.000 0.00 0.23 5.00 42.000 8.400 0.55 0.23 5.00 65.000 13.000 0.71 0.23 5.00 101.000 20.200 0.45 0.23 -Total 40.00 393.000 Within 9.825 0.51 Bartlett's test Chi-square = 86.084 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 6.86 1.08 81 Phụ lục 7: Trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm đối kháng với nấm Phytophthora nicotianae Phụ lục 7.1: Khả đối kháng với Phytophthora nicotianae phòng thí nghiệm 48 GSC Case Range : 53 - 60 Variable : 48h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.2870 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.9279 s_ = 0.2396 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Ranked Order Mean = 14.60 C Mean = 22.80 A Mean = 15.00 C Mean = 21.40 B Mean = 0.0000 E Mean = 15.40 C Mean = 21.40 B Mean = 0.0000 Mean = 9.800 Mean = 15.00 C E Mean = 14.60 C D Mean = 9.800 D Mean = 15.40 C Mean = 0.0000 E Mean = 22.80 A Mean = 0.0000 E 82 Phụ lục 7.2: Khả đối kháng với Phytophthora nicotianae phòng thí nghiệm 72 GSC Case Range : 50 - 57 Variable : 72h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.2500 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8660 s_ = 0.2236 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Ranked Order Mean = 13.20 D Mean = 22.80 A Mean = 14.00 D Mean = 20.20 B Mean = 0.0000 F Mean = 15.20 C Mean = 20.20 B Mean = 0.0000 Mean = 9.200 Mean = 14.00 D F Mean = 13.20 D E Mean = 9.200 E Mean = 15.20 C Mean = 0.0000 F Mean = 22.80 A Mean = 0.0000 F 83 Phụ lục 7.3: Khả đối kháng với Phytophthora nicotianae phòng thí nghiệm 96 GSC Case Range : 49 - 56 Variable : 96h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.2380 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8449 s_ = 0.2182 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Ranked Order Mean = 11.20 E Mean = 21.60 A Mean = 12.40 D Mean = 18.80 B Mean = 0.0000 G Mean = 14.20 C Mean = 18.80 B Mean = 0.0000 Mean = 8.800 Mean = 12.40 G Mean = 11.20 F Mean = 8.800 D E F Mean = 14.20 C Mean = 0.0000 G Mean = 21.60 A Mean = 0.0000 G 84 Phụ lục 7.4: Khả đối kháng với Phytophthora nicotianae phòng thí nghiệm 120 GSC Case Range : 51 - 58 Variable : 120h Function : &k0S&k2GRANGE&k0S Error Mean Square = 0.2620 Error Degrees of Freedom = 32 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8865 s_ = 0.2289 at alpha = 0.010 x &k2S Original Order Ranked Order Mean = 9.400 E Mean = 20.20 A Mean = 10.60 D Mean = 17.00 B Mean = 0.0000 G Mean = 13.00 C Mean = 17.00 B Mean = 0.0000 Mean = 8.400 Mean = 10.60 G Mean = 9.400 F Mean = 8.400 D E F Mean = 13.00 C Mean = 0.0000 G Mean = 20.20 A Mean = 0.0000 G ... từ vấn đề trên, nên đề tài: Nghiên cứu phân lập số dòng xạ khuẩn Streptomyces spp đối kháng với tác nhân gây bệnh thối rễ có múi tiến hành 1.2 Mục tiêu - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn thuộc... Đề tài: Nghiên cứu phân lập số dòng xạ khuẩn Streptomyces spp đối kháng với tác nhân gây bệnh thối rễ có múi Người hướng dẫn: TS Võ Thị Thu Oanh ThS Đặng Thị Kim Uyên Đề tài tiến hành với nội... chi Streptomyces từ mẫu đất thu thập từ vườn có múi - Đánh giá khả đối kháng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces với tác nhân gây bệnh thối rễ có múi điều kiện in vitro 1.3 Yêu cầu - Nhận biết xạ khuẩn