KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA HAI DÒNG VI KHUẨN Pseudomonas PHÁT HUỲNH QUANG VỚI NẤM Fusarium sp. VÀ Phytophthora sp. GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

NGUYỄN HUY CƯỜNG Nội dung nghiên cứu Đánh giá tính độc của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang trên cây Trên đĩa petri, khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn Pse 8 với nấm Fusa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA HAI DÒNG VI KHUẨN

Pseudomonas PHÁT HUỲNH QUANG VỚI NẤM Fusarium sp

VÀ Phytophthora sp GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY

CÓ MÚI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT KHÓA: 2007-2011

SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐOÀN THIỆN CẢNH

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2011

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA HAI DÒNG VI KHUẨN

Pseudomonas PHÁT HUỲNH QUANG VỚI NẤM Fusarium sp

VÀ Phytophthora sp GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY

CÓ MÚI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LỜI CẢM TẠ

Con xin khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ đã giúp con đạt kết quả ngày hôm nay, và những người thân yêu quý là nguồn động viên tinh thần bên con

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn:

• Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và ban chủ nhiệm khoa Nông học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và trao dồi kiến thức

• Ban Lãnh Đạo Viện, Bộ môn BVTV Viện Cây Ăn Quả Miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và nguồn kinh phí trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

• Quý thầy cô khoa Nông học, khoa Khoa học và các khoa khác đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em vốn kiến thức quý báu trong quá trình học tập

• TS Võ Thị Thu Oanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

• KS Nguyễn Huy Cường đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

• Các anh chị làm việc tại bộ nôn BVTV Viện Cây Ăn Quả Miền Nam đã nhiệt tình chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

• Các bạn trong và ngoài lớp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 2 tháng 08 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Đoàn Thiện Cảnh

THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở ĐBSCL”

Giảng viên hướng dẫn: TS VÕ THỊ THU OANH

KS NGUYỄN HUY CƯỜNG

Nội dung nghiên cứu

Đánh giá tính độc của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang trên cây

Trên đĩa petri, khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn Pse 8 với nấm Fusarium sp

và Phytophthora sp là trung bình, còn dòng vi khuẩn Pse 5 thì không kháng với 2 nấm

này

Trong điều kiện nhà lưới tính kháng của vi khuẩn Pse 8 và Pse 5 với nấm

Fusarium sp và Phytophthora sp ngoài nhà lưới: Dòng vi khuẩn Pse 8 có khả năng đối

kháng với nấm Fusarium sp.và Phytophthora sp tốt hơn dòng vi khuẩn Pse 5, có khả

năng kích thích sự phát triền cây chanh Volka, hạn chế tác động của nấm bệnh

Tiếp tục nghiên cứu dòng vi khuẩn Pse 8 để ứng dụng vào phòng trừ sinh học

MỤC LỤC

Trang tựa i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT Error! Bookmark not defined MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 9

1.1 Đặt vấn đề 9

1.2 Mục đích 2

1.3 Giới hạn đề tài 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan tình hình phát triển cây ăn quả và cây có múi tại Đồng bằng sông Cửu Long 4

2.2 Giới thiệu một số giống cây có múi 5

2.3 Khái quát bệnh thối rễ ở các cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 6

2.3.1 Tình hình bệnh thối rễ cây có múi tại đồng bằng sông Cửu Long 6

2.3.2 Triệu chứng 7

2.3.3 Tác nhân gây bệnh 7

2.3.4 Điều kiện phát sinh, phát triển bệnh thối rễ 8

2.4 Đặc điểm sinh thái, hình thái của nấm Fusarium sp và Phytophthora sp 10

2.4.1 Nấm Fusarium sp 10

2.4.2 Nấm Phytophthora sp 12

2.5 Biện pháp phòng trừ bệnh thối rễ cây có múi 15

2.6 Vi Khuẩn đối kháng 18

2.6.1 Cơ chế đối kháng của vi khuẩn 18

2.6.2 Tình hình sử dụng vi sinh vật đối kháng 19

2.6.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 22

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu nghiên cứu 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu đánh giá tính độc của các dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang trên các cây có múi trong phòng thí nghiệm 23

3.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp với các nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trên đĩa Petri trong phòng thí nghiệm 24

3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trong điều kiện nhà lưới 25

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Đánh giá tính độc của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và Pseudomonas 8 trên cây bưởi Lông Cổ Cò trong ống nghiệm 28

4.2 Mức đối kháng của các dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với 2 nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trên đĩa petri 29

4.3 Đánh giá khả năng đối kháng của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trong điều kiện nhà lưới 32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề Nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 48

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : Cloning Forming Unit

ĐBSCL : Đồng Bằng Sông Cửu Long

LLL : Lần lặp lại

NT : Nghiệm thức

Pse 5 : Dòng vi khuẩn Pseudomonas số 5

Pse 8 : Dòng vi khuẩn Pseudomonas số 8

VCAQMN: Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

VK :Vi khuẩn

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Khả năng đối kháng của dòng Pse 8 với Fusarium sp 30

Hình 4.2 Khả năng đối kháng của dòng Pse 8 với Phytophthora sp 30

Hình 4.3 Khả năng đối kháng của của dòng Pse 5 với Fusarium sp 31

Hình 4.4 Khả năng đối kháng của dòng Pse 5 với Phytophthora sp 32

Hình 4.5 : Biểu hiện trên rễ của nghiệm thức chỉ chủng vi khuẩn và chủng nấm 36

Hình 4.6 : Biểu hiện trên rễ của cây khi chủng vi khuẩn Pse 5 với nấm 37

Hình 4.7 : Biểu hiện trên rễ của cây khi chủng cả vi khuẩn Pse 8 và nấm bệnh 38

Hình 4.8 : Tổng thể các nghiệm thức 39

Hình 4.9: Từng nghiệm thức của cây chanh Volka 40

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Nghiệm thức thí nghiệm 26

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas 8 và Pseudomonas 5 đến sự

phát triển của hạt bưởi Lông Cổ Cò trong ống nghiệm 28

Bảng 4.2 Mức độ đối kháng của dòng vi khuẩn Pseudomonas 8 đối với nấm Fusarium

sp và Phytophthora sp trên đĩa 29

Bảng 4.3 Mức độ đối kháng của dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 với nấm Fusarium sp

và Phytophthora sp trên đĩa 31

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn Pseudomonas sp đến trọng lượng cây chanh Volka

trong nhà lưới 33

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn Pseudomonas sp đến sự phát triển của cây chanh

Volka khi chủng nấm bệnh trong nhà lưới 34

Bảng 4.6 Tỷ lệ % thối rễ ở các nghiệm thức thí nghiệm 35

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây có múi được trồng phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long, với nhiều chủng loại khác nhau, trong đó có nhiều loại khá nổi tiếng như: cam Sành, bưởi Năm Roi, bưởi

Da Xanh, gắn liền với nhiều vùng sản xuất nổi tiếng như: bưởi Da Xanh ở Bến Tre, quýt Tiều ở Lai Vung – Đồng Tháp, bưởi Năm Roi ở Phú Hữu – Châu Thành – Hậu Giang Chúng có giá trị kinh tế cao, được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu Ngoài ra trong sản xuất công nghiệp, người ta sử dụng vỏ và hạt của cây có múi để tách chiết tinh dầu, bã tép để sản xuất pectin có tác dụng tốt trong việc chữa các bệnh về tim mạch, đường ruột cũng như chống ung thư (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2005)

Ngoài những yếu tố thuận lợi cho sự phát triển cây có múi như đất đai màu mỡ, nguồn nước và nhân lực phong phú, điều kiện thời tiết khí hậu thuận lợi, trong quá trình sản xuất, các nhà làm vườn cũng gặp các khó khăn: một số nhà vườn không nắm vững kỹ thuật canh tác, không đủ vốn đầu tư, phát triển tự phát không có quy hoạch phát triển, tình hình dịch bệnh Đáng chú ý là sự xuất hiện bệnh thối rễ ở cây có múi do nấm

Fusarium sp và Phytophthora sp đang tàn phá các vùng trồng cây có múi khắp vùng

Đồng bằng sông Cửu Long, làm nhiều nhà vườn trồng cây có múi lâm vào cảnh khốn khó

vì cây chết do bệnh thối rễ Tuy nhiên, việc phòng trừ bệnh thối rễ bằng phương pháp hóa học không đạt hiệu quả cao, chi phí cao, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của người nông dân Trong những năm gần đây việc nghiên cứu và sử dụng các tác

nhân sinh học đối kháng với các tác nhân gây bệnh trong đất được quan tâm nhiều và mở

ra thêm cơ hội trong việc phòng trừ bệnh thối rễ

Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh bằng biện pháp sinh học được các nhà nghiên cứu khoa học quan tâm Trong số nhiều tác nhân sinh học đã được nghiên cứu và ứng

dụng trong sản xuất, trong đó có sử dụng các dòng vi khuẩn Pseudomonas sp làm tác

nhân đối kháng với một số tác nhân gây bệnh có nguồn gốc từ đất

Xuất phát từ thực tiễn trên và đánh giá khả năng phòng trừ của 2 dòng vi khuẩn

trên cây có múi, chúng tôi thực hiện đề tài :” Khảo sát khả năng đối kháng của 2 dòng

vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với nấm Fusarium sp và Phytophthora sp

gây bệnh thối rễ trên cây có múi ở ĐBSCL”

1.2 Mục đích

Tìm ra dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang có khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp và Phytophthora sp gây ra bệnh thối rễ trên các cây có múi

1.3 Giới hạn đề tài

• Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011

• Khảo sát trên 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang (Pse 5 và Pse 8) đã

phân lập sẵn và 2 dòng nấm Phytophthora sp và Fusarium sp

• Khảo sát được thực hiện trên bưởi Lông Cổ Cò, chanh Volka

• Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện In vitro và trong điều kiện nhà lưới

1.4 Nội dung nghiên cứu

• Khảo sát tính độc của 2 dòng vi khuẩn trên 1 số cây có múi : bưởi Lông Cổ Cò

• Đánh giá tính đối kháng của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với

2 nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trên đĩa petri

• Khảo sát khả năng đối kháng của 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas phát huỳnh quang với nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trong điều kiện nhà lưới

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình phát triển cây ăn quả và cây có múi tại Đồng bằng sông Cửu Long

Theo báo cáo của Viện Quy Hoạch và Thiết Kế Nông Nghiệp trong Hội Thảo Trái Cây Việt Nam tại Festival Trái Cây Việt Nam lần thứ nhất, diện tích cây ăn quả trên cả nước đến năm 2008 đạt 775.330 ha, chiếm 8,08% tổng diện tích đất sản xuất nông nghiệp

và chiếm 23,38% đất trồng cây lâu năm của cả nước Diện tích trồng cây ăn quả có xu hướng tăng qua các năm từ 1985 đến 2008, trong khoảng thời gian từ năm 2000 đến năm

2005 diện tích trồng cây ăn quả trong cả nước tăng gấp 3,83 lần Về cơ cấu đất trồng cây

ăn quả: đến năm 2009, 10 loại cây ăn quả có diện tích lớn nhất là 581.000 ha, chiếm 73,9% so với tổng diện tích trồng cây ăn quả, trong đó cây ăn quả có diện tích lớn nhất là cây có múi 139.400 ha (cam, quýt và bưởi) kế đến là chuối 113.900 ha, nhãn 93.500 ha, Vải 82.700 ha, xoài 87.900 ha…

Về sản lượng theo Vụ Kế Hoạch – Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn xác định: sản lượng cây ăn quả trong cả nước trong năm 2009 ước đạt 7 triệu tấn, tăng 2,5 triệu tấn so với năm 2000 Các loại cây ăn có sản lượng cao nhất là chuối: 1.511.300 tấn (21,5%), nhãn: 607.700 tấn (8,68%), xoài 537.900 tấn (7,68%), bưởi 389.400 (5,56%), vải 301.100 tấn …

Trong đó ĐBSCL là vùng trọng điểm với diện tích trồng cây ăn quả là 279.370 ha, chiếm tỷ lệ 36 % so với cả nước Trong khu vực này cây ăn trái được trồng tập trung tại một số tỉnh như: Tiền Giang với diện tích 64.953 ha, Vĩnh Long: 37.362 ha, Bến Tre:

34.920 ha, Hậu Giang: 20.905 ha Với sản lượng 2.874.807 tấn chiếm 41,07% so với cả nước Trong đó cây có múi 71.048 ha đạt sản lượng 683.765 tấn (cam, quýt, bưởi)

Tình hình tiêu thụ và xuất khẩu

Sản phẩm trái cây Việt Nam chủ yếu tiêu thụ ở thị trường trong nước là chính và

do tư thương chi phối Việc tiêu thụ qua nhiều khâu trung gian, lưu thông và phân phối, nên gây hiện tượng nơi thừa nơi thiếu cục bộ, lúc chính vụ rớt giá, hết vụ giá tăng

Về xuất khẩu: năm 2009 ngành rau quả Việt Nam xuất khẩu được 437 triệu USD, tăng 7,8% so với năm 2008,với các loại quả được xuất khẩu nhiều nhất là dứa, Thanh long, chuối, chôm chôm, nhãn, vải… Trong đó Thanh long Bình Thuận được xuất khẩu

đi Trung Quốc và các nước khu vực Đông Nam Á và năm 2010 đã xâm nhập thị trường Châu Âu và Nhật Bản Năm 2011, chôm chôm và nhãn cũng có triển vọng vào thị trường

Mỹ Các thị trường xuất khẩu chủ yếu trái cây Việt Nam là Trung Quốc, Đài Loan, Hồng Kông, Thái Lan, Singapore, Hà Lan, Nga, Nhật, Mỹ, Úc Trong đó Trung Quốc chiếm 41% giá trị kim ngạch xuất khẩu của trái cây Việt Nam

2.2 Giới thiệu một số giống cây có múi

- Chanh Tàu bông tím (Citrus limonia): cây có tán hình oval, phân cành dày đặc nhưng

cành ngắn nên tán cây thấp Cành có ít gai hoặc có gai ngắn Lá hơi xoăn, màu xanh nhạt khi non sang xanh đậm khi trưởng thành Vỏ quả màu xanh đậm và sần, khi chín có màu xanh hơi vàng, đáy quả có núm Con tép màu vàng nhạt, nhiều nước, mùi vị thơm, khá chua Cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên đất phù sa ngọt ven sông Trong sản xuất, đa số các nhà vườn trồng chanh tàu thường áp dụng phương pháp nhân giống bằng chiết cành nên cây có khả năng cho quả sau khi trồng 1,5 – 2,0 năm Giống chanh này dễ

bị nhiễm bệnh loét, Tristeza, chảy mủ gốc, trong canh tác nên chú ý để phòng trừ các loại dịch hại này để cây sinh trưởng phát triển tốt và kéo dài tuổi thọ cho cây (Viện Nghiên Cứu CAQMN, 2009)

- Chanh Volka (Citrus volkameriana) : là giống lai giữa chanh lemon và cam chua, có

nguồn gốc từ Ý Chanh Volka gần đây được quan tâm như là một giống gốc ghép triển vọng nhờ tính chống chịu bệnh malsecco, Tristeza, chịu lạnh tốt và tương đối chịu mặn Cây có múi ghép trên chanh Volka, dễ tương dung, cây mọc mạnh, ra quả sớm, nhiều quả, quả to, vỏ dày, nước trung bình (Nguyễn Văn Kế, 2008)

- Bưởi Lông Cổ cò (Citrus maxima (Burm.) Merr.): dễ trồng, sinh trưởng mạnh và cho

quả quanh năm Tán cây có khuynh hướng vươn cao, cành phân bố tương đối đều Lá có phủ lớp lông mịn, khi còn non có màu xanh nhạt, trưởng thành có màu xanh đậm, Cành

lá có hình tim ngược, bìa lá gợn sóng ít, đuôi lá nhọn, phiến lá có hình bầu dục, không có hoặc ít phủ lên cánh lá Quả có dạng quả lê cụt Túi tinh dầu trên bề mặt quả biểu hiện rất

rõ khi quả đi vào thời kì chín, túi phình to ra với mật độ dày hơn so với quả non, chuyển

từ màu xanh mốc sang màu xanh nhạt, lớp lông tơ mịn vẫn bao phủ quanh quả Con tép khó tróc khỏi vách múi, tép có màu hồng hơi đỏ, nhiều nước, vị hơi chua, không đắng, không the Bưởi Lông Cổ Cò là một trong những giống bưởi được trồng phổ biến ở ĐBSCL sau bưởi Năm roi và bưởi Da xanh.(Viện Nghiên Cứu CAQMN, 2009)

2.3 Khái quát bệnh thối rễ ở các cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

2.3.1 Tình hình bệnh thối rễ cây có múi tại đồng bằng sông Cửu Long

Bệnh thối rễ cây có múi xuất hiện trên tất cả các vùng trồng cây có múi ở Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp và Hậu Giang Năm 2000 khoảng trên 1.300 ha quýt Tiều tại Lai Vung bị chết do bệnh thối rễ gây ra Trong các năm 2001 đến 2004, vùng trồng Cam Mật tại hai huyện Trà Ôn và Tam Bình cũng đang bị bệnh thối rễ và chết dần Theo đánh giá của cán bộ địa phương số cây bị chết có thể lên đến 40% diện tích cam của hai huyện Tại thành phố Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang bệnh thối rễ cũng gây hại khá nghiêm trọng ở các vườn trồng cam và quýt Đường (Phạm Văn Kim, 2004)

Theo Sở Nông nghiệp và PTNT tỉnh Tiền Giang, Bệnh vàng lá, thối rễ hiện gây hại trên 3.332 ha cây có múi Nhiều nhất là Tam Bình: 2.268 ha và Trà Ôn: 637 ha Trong

đó, bệnh vàng lá gây nhiễm với tỷ lệ từ 10 – 30% diện tích (cao nhất 50%) ở các huyện

Tam Bình, Mang Thít, Trà Ôn và Vũng Liêm; bệnh thối rễ trên cây có múi (tỷ lệ nhiễm 8 – 24%) ở Tam Bình và Trà Ôn

2.3.2 Triệu chứng

Bệnh xuất hiện triệu chứng trên lá, lá bị biến vàng và cả gân lá bị vàng (khác với triệu chứng của bệnh vàng lá Greening), vàng lá có thể xảy ra trên một vài nhánh hay trên toàn cây, triệu chứng xuất hiện trên lá già, sau đó đến các lá non Khi cây bị bệnh bị lay động mạnh hoặc có gió mạnh làm cho lá vàng bị rụng nhiều, có khi trơ cả cành và cây chết dần

Khi quan sát bộ rễ theo hình chiếu xuống của cành bị bệnh, thì thường những rễ theo hướng này bị hư, thối, đặc biệt là rễ non bị thối và tuột khỏi vỏ, như vậy rễ sẽ mất khả năng hấp thu dinh dưỡng và nước để nuôi cây

2.3.3 Tác nhân gây bệnh

Phạm Văn Kim và ctv (1997) đã thực hiện thành công việc chứng minh tác nhân

gây bệnh vàng lá, rụng lá (thối rễ) của cây cam Mật (Citrus sinensis) và quít Tiều (Citrus

reticulata) là nấm Fusarium solani Nấm F solani cần có điều kiện đất bị oi nước lâu dài

để gây bệnh, vì khi chủng bào tử nấm F solani cho cây trong điều kiện đất ráo nước

(thoáng khí) thì sau ba tháng cây vẫn không thể hiện triệu chứng của bệnh Nhưng nếu tạo điều kiện oi nước thì sau một tháng bệnh đã xuất hiện và gây triệu chứng vàng lá, rụng lá và thối rễ

Lê Thị Thu Hồng và ctv (2002) đã nghiên cứu bệnh vàng lá chết nhanh cây quít

Tiều tại Lai Vung, Đồng Tháp và cũng có cùng kết luận là bệnh này do nhiều tác nhân

gồm Fusarium, Pythium, Phytophthora và một số tuyến trùng gây ra, mà trong đó sự tương tác giữa tuyến trùng và nấm Fusarium solani là quan trọng Ngoài ra, do bệnh thối

rễ thường kết hợp với các bệnh Greening và Tristeza nên gây triệu chứng chết nhanh cho cây quít Tiều

Theo Dương Minh và ctv (2003)trong khi nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma spp để đối phó với nấm F solani bằng biện pháp trồng cây con trong đất cát cồn (đất không có hữu cơ) và chủng bào tử F solani với mật số 105/300 g đất, và cũng có cùng kết luận là F solani là tác nhân gây bệnh thối rễ cây có múi tại Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Tiền Giang Nhóm nghiên cứu đã phân lập được nấm F solani

từ rễ các loại cây như cam Mật, quít Tiều, cam Soàn (Citrus sinensis), chanh Tàu (Citrus

lemon), bưởi (Citrus maxima) và cây chanh Volka (Citrus volkameriana) dùng làm gốc

tháp và tất cả các chủng nấm F solani này đều gây bệnh thối rễ Đồng thời qua khảo sát,

nhiều vườn Nhãn và Chôm Chôm mắc bệnh thối rễ, nhóm khảo sát cũng xác nhận bệnh

thối rễ Nhãn, Chôm Chôm và vú sữa cũng do nấm F solani gây ra

Theo Phạm văn Kim ( 2000) triệu chứng sọc nâu dọc theo mạch dẫn ở rễ hoặc cổ

rễ là do enzyme của mần bệnh phá hủy vách của mạch mộc, đồng thời oxy hóa các hợp chất phenol (do tế bào kí chủ tiết ra) Sự oxy hóa này cho ra các phân tử màu, xâm nhập vào và nhuộm nâu các mạch mộc kí chủ

Bệnh xuất hiện trong môi trường đất, do các tác nhân trong môi trường đất gây ra

như: nấm Fusarium solani, nhiều mẫu nấm Pythium sp., Phytophthora sp., Sclerotium sp Nhiều mẫu tuyến trùng Tylenchulus sp., Radophulus sp và có cả tuyến trùng

Meloidogyne sp cũng đã được ghi nhận (Hòa và ctv., 2005)

2.3.4 Điều kiện phát sinh, phát triển bệnh thối rễ

Bệnh xuất hiện quanh năm, nhưng bệnh thường bắt đầu phát triển phổ biến vào đầu mùa nắng, khoảng tháng 11 và 12 dương lịch hằng năm Cây chết hàng loạt vào tháng 1 đến tháng 4 dương lịch và có thể tiếp tục kéo dài trong mùa mưa năm sau

Với các vườn mới lên liếp trồng cây có múi, cây bắt đầu chết vì bệnh thối rễ từ năm thứ năm cho đến năm thứ bảy trở về sau, tùy cách canh tác của từng vườn

Với các vườn đã lên liếp lâu năm và được cải tạo lại để trồng cây có múi (quít hoặc cam) thì cây trồng bắt đầu bị thối rễ chết cây vào sau vụ thu hoạch trái thứ hai và cây chết nhiều vào sau khi thu hoạch trái lần thứ ba và lần thứ tư

Khi trồng cây có múi theo lối trồng ba hàng trên mỗi liếp thì hàng giữa bị bệnh và chết trước hai hàng hai bên

Các vườn có cây bệnh và chết đều là những vườn không được bón phân hữu cơ mà chỉ được bón phân hóa học Gần như các vườn đều không được bón vôi

Đất ở các vườn bệnh thường có thành phần sét cao trong sa cấu, chai cứng trong mùa nắng và dẻo quánh trong mùa mưa Ngoài ra, đất của các vườn có bệnh xảy ra rất chua, pH trong khoảng từ 3,9 đến 4,5 Thường gặp nhất là pH = 4,3 như trên vườn Sapoche bị bệnh tại Trà Vinh (Phạm Văn Kim, 2000) và trên vườn quít Tiều bị bệnh tại Lai Vung – Đồng Tháp (Lê Thị Thu Hồng, 2002) Dương Minh và ctv (2004) báo cáo các vườn cây có múi mắc bệnh tại 5 tỉnh Cần Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Tiền Giang có pH từ 3,9 đến 4,4

Bệnh thối rễ phát sinh gây hại ở giai đoạn cây con và cây trưởng thành Điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển và gây hại nặng là thời tiết ẩm ướt, hoặc trời mưa Ngoài ra mức độ tác hại còn phụ thuộc vào các yếu tố: đất đai, phân bón, chăm sóc

Điều kiện đất và nước rất đặc trưng cho vùng ĐBSCL giữ vai trò rất quan trọng đối với bệnh thối rễ Đất có thành phần sét cao trong sa cấu tạo ra tình trạng tế khổng trong đất rất nhỏ, làm cho đất khó thoát nước sau các đợt mưa dài ngày vào giữa và cuối mùa mưa Nước chiếm các tế khổng lâu dài nên rơi vào tình trạng yếm khí do oi nước Tình trạng này kéo dài làm cho rễ cây trồng cạn phải hô hấp yếm khí lâu dài, các chất độc

do các tiến trình sinh hóa trong tế bào rễ sinh ra không được oxit hóa để giải độc, tích lũy trong tế bào và gây ngộ độc cho tế bào Từ đó các tế bào ở phần rễ non, nơi các tiến trình sinh hóa xảy ra mạnh nhất, sẽ bị chết dần từng tế bào và tạo ra các mảng thối của rễ non

Nấm Fusarium sp có sẵn ngoài đất, có cơ hội xâm nhập vào rễ qua các vết thối này và

bắt đầu tấn công dần phần rễ này Kể từ khi bắt đầu xâm nhập cho đến khi triệu chứng bệnh thể hiện cần có thời gian ủ bệnh vài tháng, do đó ở các vườn, bệnh không xuất hiện ngay mùa mưa, lúc đất bị oi nước, và triệu chứng bệnh thường xuất hiện nghiêm trọng trong mùa nắng (Nguyễn Văn Hòa, 2008).

2.4 Đặc điểm sinh thái, hình thái của nấm Fusarium sp và Phytophthora sp

2.4.1 Nấm Fusarium sp

Thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), họ Tubercularia, bộ nấm bông (Hyphomycetales) Giai đoạn sinh sản hữu tính chưa xác định rõ ràng đối với nầm

Fusarium spp Tuy nhiên trong nghiên cứu gần đây từ việc dùng đoạn trình tự ITS

(Internal Transcribed Spacer) đã chỉ ra rằng Fusarium spp gần với nhóm Liseola ,có giai đoạn hữu tính là Gibberella (O’Donnell và ctv., 1998; trích dẫn bởi CABI, 2003).

Đặc điểm sinh học, sinh thái

Nấm Fusarium là loại nấm sống trong đất, có thể tồn tại dưới dạng bào tử hậu,

bào tử hậu có hình tròn, là các bào tử một tế bào với vách tế bào dày và có sức chống

chịu cao Các tác nhân gây bệnh thối rễ Fusarium có thể có trong rễ các cây không kí chủ, kể cả cây cỏ dại và cây trồng Mối tương quan giữa bệnh thối rễ Fusarium với tuyến

trùng đã được nghiên cứu, và nấm xâm nhập vào cây qua vết thương do tuyến trùng gây

ra, và cũng có những nghiên cứu cho thấy tuyến trùng ảnh hưởng đến tính kháng bệnh

thối rễ Fusarium (theo CABI, 2003)

Nấm có giai đoạn sinh sản vô tính, có tế bào sinh bào tử trần Fusarium đặc trưng

bởi hệ sợi nấm gồm các sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu khác nhưng

thường có màu trắng Fusarium có cành bào tử phân sinh, giá trần bào tử đơn độc hoặc tụ

tập trong các đệm giá hoặc thành đệm giá nhầy đơn hoặc phân nhánh, các tế bào sinh bào

tử trần là các thể bình đơn độc hoặc thành cụm trên đỉnh giá bào tử trần, đỉnh các nhánh của giá hoặc trực tiếp trên thân giá, trên các sợi nấm không phân hóa hình thái Bào tử trần thường ẩm ướt tụ họp thành khối cầu ở đỉnh thể bình hoặc hình chuỗi Nấm có 2 dạng bào tử: bào tử trần lớn và bào tử trần nhỏ Bào tử trần lớn có một đến nhiều vách ngăn hình lưỡi liềm có hoặc không có gót ở ngăn gốc Bào tử trần nhỏ không có hoặc có

1 – 2 vách ngăn hình elip, hình trứng, hình trụ, hình gần cầu, thường không có màu hoặc

có màu trắng nhạt Bào tử trần lớn là bào tử đặc trưng của nấm, một số loài không có bào

tử trần nhỏ, có hoặc không có bào tử áo, một số loài có thể có quả túi (Nguồn: http:/en.Wikipedia org/Wiki/fusarium)

Phân bố

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), thì nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới,

Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế, đặc biệt

ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nước như Australia, Panama, Mỹ, Philippines, Đài

Loan và các nước Đông Nam Á

Phổ ký chủ

Fusarium có rất nhiều loài khác nhau nên khả năng kí chủ rất rộng trên nhiều loại

cây trồng khác nhau như: cây ăn quả, cây rau màu và một số cây trồng khác và có thể sống trong đất trong một thời gian dài, trong xác bã thực vật dưới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp

điều kiện thuận lợi bào tử sẽ phát triển và lây lan (Bùi Xuân Đồng, 1986)

Nấm gây hại nặng trên một số cây trồng đặc biệt là cây ăn quả như: chuối, xoài, nhãn, ổi, cam, quýt, đu đủ Ngoài ra một số dòng nấm gây bệnh cho người và động vật

như: ung thư họng ở người, ung thư bán cầu não trên ngựa và chuột (Thiel và ctv, 1991)

Theo Labuschagne và ctv (1996), cho rằng nấm Fusarium solani tấn công và gây hại nặng trong điều kiện cây bị stress Bệnh thối rễ (do nấm Fusarium solani) sẽ nặng

hơn trong điều kiện ngập nước, bón nhiều phân ure, tinh bột dự trữ trong rễ giảm và có sự

hiện diện của tuyến trùng Tylenchulus sp

Fusarium có khả năng ký chủ rất rộng trong các điều kiện khác nhau ở khoảng

nhiệt độ 50C – 400C, nhưng phát triển thuận lợi nhất là 180C – 300C và ẩm độ 80 – 90% (Bugnicourt, 1939)

2.4.2 Nấm Phytophthora sp

Giới thiệu về Phytophthora sp

Về sắp xếp tiến hóa, Phytophthora là một thành viên thuộc bộ Peronosporales bên

trong lớp Oomycetes trong giới Chromista Oomycetes bao gồm bốn bộ, và hai trong số

đó gồm Saprolegiales và Peronosporales là các tác nhân gây bệnh cây nghiêm trọng Hai

bộ khác gồm những nấm nhỏ, chủ yếu gồm những sinh vật gần giống nấm sống trong

nước Bên trong bộ Peronosporales, họ Pythiaceae chứa Phytophthora

Phổ ký chủ

Một loài nấm Phytophthora có thể gây bệnh trên nhiều cây như P capsici gây hại khoảng 40 loại cây trồng khác, nấm P nicotianae hại trên 400 cây trồng và nấm P

palmivora hại trên 150 loài Nấm P palmivora có thể gây nhiều bệnh như đen vỏ cacao,

thân và trái đu đủ, thối rễ và tàn lụi trên quýt, thối chồi trên cọ, sọc đen trên cao su, thối

rễ loét thân sầu riêng hay P capsici gây thối rễ trên tiêu , thối rễ và trái ở dưa, bí đỏ P

parasitica gây bệnh thối noãn dứa, bệnh mốc sương đen thuốc lá, bệnh thối rễ cây có múi

( theo Adré Drenth và Barbara Sendall, 2001)

Sự phân bố

Theo André Drenth, Phytophthora là giống thuộc lớp nấm noãn phân bố rộng rãi

trên toàn thế giới, là “vật gây bệnh cây trồng” bao gồm xấp xỉ 60 loài (Erwin và Ribeiro,

1996) Những loài Phytophthora gây hại trên nhiều loại cây trồng và là nguyên nhân

chính gây nên một số bệnh dịch nghiêm trọng trên thế giới, gây thiệt hại hàng năm đến hàng tỉ đô la, trong đó phải kể đến vụ mất mùa khoai tây gây nạn đói ở Châu Âu thế kỷ

19 mà tác nhân là nấm Phytophthora infestans( theo Bourke trích dẫn bởi André Drenth, 1964) Bệnh rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới ẩm ướt trên toàn thế giới và gây nên nhiều bệnh khác nhau cho cây ăn quả nhiệt đới như: thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, cháy lá, thối

quả Nấm Phytophthora palmivora là nguyên nhân của hàng nghìn bệnh nghiêm trọng

trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: thối rễ và thối quả cây có múi, thối thân và thối

đu đủ

Chu kì sống

Sinh sản vô tính của Phytophthora gồm bào tử nang, bào tử động, hậu bào tử và

sinh sản hữu tính (bào tử noãn) Sợi nấm sinh dưỡng lưỡng bội sản sinh ra bào tử nang vô tính mà có thể nảy mầm trực tiếp, hoặc có thể phân chia để sản sinh ra 8 – 12 bào tử động, mỗi bào tử động trải qua một quá trình lan truyền và bơi vào nang trước khi nảy

mầm Một số loài Phytophthora cinnamoni cũng sản sinh số lượng lớn hậu bào tử sợi

nấm Tái sinh lưỡng tính là kết quả của việc sản sinh bào tử noãn Tất cả các kiểu bào tử đều có khả năng nhiễm bệnh, bào tử hậu và bào tử noãn đều có thể tồn tại qua đông và ở

trạng thái nghỉ Tất cả các loài Phytophthora đều có giai đoạn truyền qua đất và hơn nữa một số loài như P palmivora còn truyền qua cả không khí (theo André Drenth)

Phương thức sinh sản

Tất cả các dòng phân lập được của Phytophthora đều có tính lưỡng tính, điều đó

có nghĩa là chúng có thể sản sinh cấu trúc sinh sản hữu tính đực và cái ( theo Galindo và Gallegly được André Drenth trích dẫn, 1960)

Khi các dòng phân lập được đối ngược nhau về giới tính tiếp xúc với nhau có thể kích thích qua lại để hình thành túi giao tử Phương thức sinh sản của các loài

Phytophthora quyết định khả năng phát dịch Hình thức sinh sản hữu tính đóng vai trò

quan trọng trong vòng đời của Phytophthora Sinh sản hữu tính cho phép kết hợp lại những cặp gen tương ứng ở trường hợp của những loài Phytophthora mang tính dị tản

Bào tử noãn có thể hoạt động như một cấu trúc cho phép tồn tại trong một thời gian dài khi không có sự hiện diện của cây ký chủ và có thể duy trì sự nhiễm bệnh vào mô cây kí chủ trong điều kiện khí hậu nóng và khô

Phương thức lan truyền

Các tác nhân gây bệnh lưu tồn dưới dạng bào tử trứng hoặc bào tử hậu trong đất và được di chuyển theo vật liệu nhân giống, đất, hoặc nông cụ có chứa mần bệnh Du bào tử động cũng có thể di chuyển theo nước trong các kênh lạch, kênh tưới tiêu xâm nhập vào

kí chủ ( theo Cẩm nang chẩn đoán bệnh ở Việt Nam, 2009)

Bệnh Phytophthora gây hại trên cây có múi tại Đồng bằng sông Cửu Long

Phytophthora citrophthora được ghi nhận lần đầu tiên trên cây cam ở vùng đông

bằng sông Mekong vào năm 1950 và không quan sát thấy cho đến tận năm 1970 khi nó được tìm thấy trên cây cam ở miền Bắc và miền Trung của Việt Nam Từ đó bệnh đã nhanh chóng lan rộng và hiện nay có ảnh hưởng đến tất cả các vùng trồng cây có múi như

là Thanh Trà – Thừa Thiên Huế và Ninh Bình ở Tiền Giang

Phytophthora citrophthora tấn công vào thân và quả, kết quả dẫn đến triêu chứng

chảy nhựa và thối quả Bệnh phát triển nhanh vào mùa mưa và nghiêm trọng nhất vào tháng 7 và tháng 8 Tháng 3 năm 2002, tỷ lệ bệnh trên cây cam ở nông trường Cao Phong – Hòa Bình là 10% nhưng đã tăng nhanh vào tháng 8 là 20% - 30% Trên quýt bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng, ở một vài vườn tất cả các cây bị bệnh và nhiều cây đã bị chết Những mẫu bệnh sùi cành trên cây có múi ở tỉnh Tiền Giang được xác định là do nấm

Phytophthora citrophthora gây ra

Những nghiên cứu về bệnh Phytophthora trên cây có múi còn rời rạc, không liên

tục ở Việt Nam, và thường hạn chế ở mức điều tra tỷ lệ bệnh và mức độ nghiêm trọng của chúng Chưa có nghiên cứu phát triển chiến lược quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo ra giống kháng bệnh và sử dụng những gốc ghép kháng bệnh Để đảm bảo cho ngành sản xuất cây có múi phát triển trong tương lai thì đòi hỏi phải nghiên cứu những bệnh

Phytophthora và biện pháp quản lý chúng

2.5 Biện pháp phòng trừ bệnh thối rễ cây có múi

Biện pháp hóa học

Đây là biện pháp sử dụng phổ biến hiện nay, nhưng xét về mặt lâu dài thì biện pháp hóa học này thể hiện những mặt trái của nó như làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc, đặc biệt là gây ô nhiễm đến môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người một cách nghiêm trọng

Nên rải vôi trước khi trồng để loại trừ mầm bệnh có trong đất Hàng năm nên cung cấp thêm vôi xung quanh gốc, quét vôi vào gốc cây trên 50 cm vào cuối mùa nắng

Thăm vườn thường xuyên để phát hiện bệnh sớm, cắt bỏ những cành bị vàng, rễ theo hình đối chiếu

Xới nhẹ xung quanh gốc và tưới thuốc Ridomyl Gold hoặc Aliette khi có bệnh xuất hiện

Rải thuốc trừ tuyến trùng xung quanh rễ (sử dụng Regent 0.3 G)

Biện pháp sinh học

Đây là biện pháp ngày càng được chú ý và khai thác trên phương diện an toàn, bảo

vệ môi trường

Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng

và sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số mầm bệnh xuống ngưỡng gây hại Nhờ đó mà bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng đến mặt kinh tế

Những tiến bộ đạt được gần đây trong biện pháp sinh học bao gồm việc định dạng các tác nhân phòng trừ sinh học chẳng hạn như xạ khuẩn (You và ctv.,1996) và nấm

trong đó đó có Trichoderma spp (theo Champer và Scott được André Drenth trích dẫn, 1995), Gliocladium spp (Lim và Chan 1986; Heller và Theilerhedtrich 1994; Chamber

và Scott 1995) và Chaetomium globosum (Heller và Theilerhedtrich 1994) Các tác nhân

này đều có thể làm hạn chế sự phát triển của P cinnamomi, phần lớn là bằng sự phân giải

sợi nấm, nhưng cũng có thể kích thích sự phát triển của vật chủ (El-Tarabily ctv 1996)

Hàng loạt nghiên cứu đã được tiến hành để kiểm tra khả năng phòng trừ của P palmivora

ở cây ca cao, có sử dụng vi sinh vât đối kháng chẳng hạn như Bacillus spp., Aspergillus

tamari, A.gigentus, Botryodiplodia theobromae, Penicillium purpurescens, và Pseudomonas fluorescens, cũng đem lại một số thành công (Galindo, 1992) Hai loài

trong giống Myrotherium cư trú trong đất đã được phát hiện là có thể làm giảm bệnh thối

lá do P palmivora và P katasurae gây ra ở cây dừa Giống nấm này sống được trong

điều kiện đất có nhiệt độ ôn hòa và đất nhiệt đới, do đó tạo điều kiện có thể phòng trừ

sinh học đối với bệnh thối mầm ở dừa (Tuset và ctv., 1992).(theo tài liệu “Quản lý bệnh

Phytophthora cho rau quả Việt Nam” của Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam,

2005)

Hoạt động phòng trừ sinh học có được tiến hành một cách thủ công bằng cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, bằng cách kích thích hoạt động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ sung thêm lớp che phủ hoặc phân hữu cơ (Erwin và Ribeiro, 1996) Chẳng hạn, sử dụng chất hữu cơ (lớp che phủ, vỏ gỗ thông được chế thành phân trộn…) có vi sinh vật hoạt động mạnh và độ pH thấp (Hoitink và Fahy, 1986;

You và Sivastihamparam, 1995), có thể giúp phòng chống được P cinnamomi có trong

các cây trồng trong chậu tại các vườn ươm Việc bổ sung thêm các chất hữu cơ đem lại thành công trên cánh đồng; chẳng hạn như trong phòng chống bệnh trồng lại táo

(Utkhede và Smith, 1994) Mycorhizae cũng có tác dụng phòng trừ sinh học đối với P

cinnamomi giống như đã xác định trong cây thông (AMarais và Kotze, 1976) và dứa

(Guilemin và ctv., 1994) ( theo tài liệu “Quản lý bệnh Phytophthora cho rau quả Việt

Nam” của Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, 2005)

Theo Cook và Baker (1983) phòng trừ sinh học là sử dụng một hay nhiều sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mần bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó

Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ đầu thế kỉ 20 trong đó có vi khuẩn Đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến là

Pseudomonas spp., kế đó là Bacillus spp và Streptomyces ( Burr và ctv., 1978, Weller và

Cook, 1983)

Sử dụng 1 số vi khuẩn đối kháng như Bacillus, Pseudomonas để xử lý hạt trước

khi gieo, nhúng rễ cây con trước khi trồng hoặc đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau

trồng nhằm ức chế, cạnh tranh, hoặc tiêu diệt vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Đỗ Tấn

Dũng, 2001)

2.6 Vi Khuẩn đối kháng

2.6.1 Cơ chế đối kháng của vi khuẩn

Các loại vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng chất kháng sinh, là những sản phẩm trao đổi chất trong quá trình sống của chúng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998), tiết ra enzyme phân hủy thành phần vách tế bào như glucan, chitin, protein, và tiết ra enzyme phân hủy vách tế bào ( Nguyễn Thị Thu Nga, 2003)

*Tiết kháng sinh:

Một vài nhóm Pseudomonas tạo 2,4 – diacetylphloroglucinol ( 2,4 – DAPG) Hai nhóm khác nhau trên cơ sở tạo kháng sinh, một nhóm sinh 2,4 – DAPG hydrogen cyanid

và pyoluteorin (PLT) và một nhóm không tạo ra PLT nhưng sinh ra hai chất trên:

Pseudomonas fluorescens 94/96 tạo ra viscosinamid là một lypopeptid vòng có khả năng

kiểm soát Pythium ultimum (Nguyễn Thị Kim Cúc và Phạm Việt Cường, 2003)

Pseudomonas fluorescens tạo ra các kháng sinh kiểm soát các tác nhân gây bệnh

như: 2,4 – diacetylphloroglucinol (DAPG) (Leji, 2002), pyrolnitrin (PRN) (Cartwright và ctv., 1995), pyoluteorin (PLT), phenazine-l-carboxyelic acid (PCA), 2-hydroxy phenazines, phenazine-1-carboxamide (PCN) (Fernando và ctv., 2005), aerugine[4-hydroxymethyl-2-(2-hydroxypheyl)-2-thiazoline] (Lee và ctv., 2003)

Chi vi khuẩn Bacillus sp đã phát hiện tiết các loại kháng sinh kanosamine (Milner

và ctv., 1996), zwittermicin A (Fernando và ctv., 2005) và bacillomycin (Volpon và ctv., 1999) Ngoài ra, chúng cũng có thể tiết ra một số chất kháng sinh khác như: bacteriocin (Chen và ctv., 2003), iturin A2 (Yoshida và ctv., 2002), prodigrosin (+)-(S)- dihydroaeruginoic (Carmi, 1994 do Nguyễn Thị Thu Nga trích dẫn, 2003)

*Tiết ra các enzyme phân hủy vách tế bào

Vách tế bào nấm gồm nhiều thành phần như glucan, chitin, protein (Phạm Văn Kim, 1999) Vi khuẩn đối kháng có khả năng tiết ra các enzyme phân hủy các thành phần glucan hay chitin hoặc thành phần protein của vách tế bào nấm gây bệnh Vi khuẩn tiết ra

enzyme phân hủy được chitin được tìm thấy ở một số chi vi khuẩn như: Micrococus,

Bacillus, Streptomyces, Serratia, Acromonas,… (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003), glucanase

cũng được tiết ra từ chi Bacillus (Chen và ctv., 2003)

VoiSard và ctv.,(1989) còn cho biết cyani để sản xuất bởi Pseudomonas

fluorescens giúp ngăn chặn bệnh thối đen rễ thuốc lá do Thielaviopsis basicola gây ra,

làm giảm bớt trong đất

Devi và ctv., (1989) nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas phát huỳnh quang có huỳnh quang và không có huỳnh quang được phân lập từ vùng rễ lúa ở miền nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani và được đánh giá là biện pháp đối

phó với bệnh đốn vằn

Ở Thái Lan, thành công của việc sử dụng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia

solani, gây bệnh đốm vằn trên lúa đã được ghi nhận Ruộng lúa được phun với vi khuẩn

đối kháng Pseudomonas sp và Bacillus sp 3 lần trong mỗi vụ Vi khuẩn đối kháng ức chế sự tạo hạch nấm R solani Sau 5 vụ phun vi khuẩn đối kháng liên tục, bệnh giảm một

cách đáng kể và giúp gia tăng năng suất so với đối chứng mà không cần dung thuốc trị bệnh đốn vằn (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Võ Minh Luân (2007) thì sản phẩm Yield Shield với thành phần hoạt chất là

bào tử của Bacillus pumilus, chủng GB34 đã được đăng ký tại mỹ năm 2003 để phòng trị bệnh trên đậu nành Chủng B pumilus T4 cũng kích thích tạo ISR chống lại bệnh trên dưa leo do vi khuẩn Erwinia tracheiphila, cũng như bệnh do nấm Fusarium và

Rhizoctonia

2.6.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong và ngoài nước

Những nghiên cứu trong nước

Nguyễn Trung Thành (2004) đã thành công trong nghiên cứu “ bước đầu chọn lọc

và đánh giá dòng vi khuẩn đối kháng phân lập từ đất để khống chế nấm Rhizoctonia

solani, Sclerotium rolfsii, và vi khuẩn Ralsronia solanacearum gây bệnh trên cây cà

chua” Các dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng kháng với ba tác nhân gây bệnh trong

điều kiện In vitro và trong nhà lưới, vi khuẩn đối kháng đã khống chế được bệnh do nấm

Sclerotium rolfsii gây ra

Phạm Mỹ Liên (2004) nghiên cứu về vấn đề”chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn

Pseudomonas flourescens đối kháng với nấm Sclerotium roflsii gây bệnh trên cây cây cà

chua” cũng đã thành công trong quá trình nghiên cứu

Những nghiên cứu ngoài nước

1935 ở Liên Xô, người ta dùng 1 số loại vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas bón vào đất để chống lại nấm Sclerotium và Botrylis bảo vệ cây trồng

Sakthivel và ctv., (1986) cho biết những vi khuẩn ở vùng rễ trong đó có loài

Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum f sp vasinfectum, Fusarium oxysporum f.sp.cubense, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii và Aspergilus flavus… Các thí nghiệm tiếp theo cũng sử dụng nguồn vi khuẩn này trong phòng trừ sinh

học hiệu quả đối với thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất

Sivamani và ctv., (1987) cho rằng vi khuẩn Pseudomonas có thể dùng như biện pháp sinh học, chống lại tác nhân Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko cây chuối và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv oryzae gây bệnh cháy lá lúa

Lambert và ctv., (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas

cepacia, Serratia liquefacien và Bacillus sp có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ bắp, lúa

Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm

Pseudomonas carolinianum ở Ai Cập được kiểm soát bởi vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens Vi khuẩn đối kháng cao với nấm trong thí nghiệm trên đĩa

Petri và hạn chế được bệnh khi áp dụng trong đất Hiệu quả kiểm soát cao khi trộn vi khuẩn vào đất hơn là chủng vi khuẩn vào vùng rễ trước khi trồng Tác động đối kháng do

sự cạnh tranh về dinh dưỡng, suderophores, những chất có đặc tính kháng khuẩn – HCN

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ 20/2/2011 đến 16/6/2011

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Viện Nghiên Cứu cây Ăn Quả Miền Nam thuộc xã Long Định, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Hai dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và Pseudomonas 8 đã được phân lập sẵn

Các dòng nấm gây bệnh Fusarium sp và Phytophthora sp

Giống: chanh Volka, bưởi Lông Cổ Cò

Môi trường KB lỏng (20g proteosepeptone, 1.5g K2HPO4, 1.5g MgSO4.7H2O, 15ml Glycerol, 15g Agar, 1 lít nước cất)

Môi trường PDA (200g Khoai tây, 20g dextrose, 15g agar, 1 lít nước cất)

Môi trường WA (15g agar, 1 lít nước cất)

Môi trường PCA (20g Khoai tây, 20g cà rốt, 15g agar, 1 lít nước cất)

Các vật liệu khác cần thiết cho thí nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu đánh giá tính độc của các dòng vi khuẩn

Pseudomonas phát huỳnh quang trên các cây có múi trong phòng thí nghiệm

Tiến hành khảo sát với 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và Pseudomonas 8 đã

được phân lập sẵn trên giống: bưởi Lông Cổ Cò Giống cây thí nghiệm được bố trí 3

nghiệm thức, nghiệm thức 1 chủng với dòng Pseudomonas 5, nghiệm thức 2 chủng với dòng Pseudomonas 8, nghiệm thức 3 đối chứng Mỗi nghiệm thức được bố trí với 10 lần

lặp lại, mỗi lần lập lại là 1 ống nghiệm Mỗi ống nghiệm gieo 1 hạt

- Khi hạt nẩy mầm 0,5 – 2 mm, ngâm hạt vào dịch huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị

ở trên, với nồng độ 109 CFU/ ml trong 30 phút

- Hạt làm khô nhanh trên giấy thấm, cấy vào ống nghiệm chứa sẵn môi trường

WA, đặt ở nhiệt độ phòng (27 – 30oC)với thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng và 12 giờ tối Tiến hành theo dõi trong vòng 7 ngày

Chỉ tiêu theo dõi : tỷ lệ chết mầm(%), chiều dài rễ mầm và thân mầm (cm)

3.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn

Pseudomonas sp với các nấm Fusarium sp và Phytophthora sp trên đĩa Petri trong

phòng thí nghiệm

- Vật liệu nghiên cứu: 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và Pseudomonas 8; 2 nấm gây bệnh thối rễ Fusarium sp và Phytophthora sp

- Dụng cụ thí nghiệm : que trang vi khuẩn, Pipet và đầu típ đã được vô trùng

- Sử dụng môi trường PDA cho nấm Fusarium sp phát triển, WA và PCA cho nấm Phytophthora sp phát triển

- Phương pháp nuôi cấy trên đĩa Petri môi trường, cùng điều kiện giống nhau giữa các dòng vi khuẩn đánh giá và nấm gây bệnh, đánh giá khả năng đối kháng dựa vào mức

độ hạn chế sự phát triển của nấm gây hại

- Phương pháp tiến hành : Lấy các mẫu nấm Fusarium và Phytophthora cấy lên môi trường PDA,PCA đã chuẩn bị sẵn (với Fusarium sp trên PDA, Phytophthora sp trên PCA) Dùng Pipet hút 5µl dịch vi khuẩn với các dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và

Pseudomonas 8 chuẩn bị sẵn cấy vào vị trí đối xứng với nấm Cuối cùng đem ủ ở nhiệt

độ phòng (27 – 30o C), khoảng 7 ngày sau xem kết quả đối kháng của các dòng vi khuẩn

- Chỉ tiêu theo dõi: đo khoảng cách vô khuẩn và đánh giá khả năng đối kháng của

các dòng vi khuẩn Pseudomonas 5 và Pseudomonas 8 với nấm bệnh theo 4 cấp dưới đây

< 1mm : Không có khả năng đối kháng (-)

> 1- 3mm : Đối kháng yếu (+)

> 3-7mm : Đối kháng trung bình (++)

> 7mm : Đối kháng mạnh (+++)