KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ DÒNG NẤM PAECILOMYCES SPP. VÀ TRICHODERMA SPP VỚI TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ DÒNG NẤMPAECILOMYCES SPP. VÀ TRICHODERMA SPP VỚI TUYẾNTRÙNG BƯỚU RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) TRONG ĐIỀU KIỆNIN VITRO VÀ NHÀ LƯỚIKHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ DÒNG NẤMPAECILOMYCES SPP. VÀ TRICHODERMA SPP VỚI TUYẾNTRÙNG BƯỚU RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) TRONG ĐIỀU KIỆNIN VITRO VÀ NHÀ LƯỚI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ DÒNG NẤM

PAECILOMYCES SPP VÀ TRICHODERMA SPP VỚI TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) TRONG ĐIỀU KIỆN

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ DÒNG NẤM

PAECILOMYCES SPP VÀ TRICHODERMA SPP VỚI TUYẾN TRÙNG

BƯỚU RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ

Chân thành cảm ơn đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban Chủ Nhiệm Khoa Nông Học

Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật

Cùng quý thầy cô Trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình giảng dạy em trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị ở Bộ môn Bảo vệ thực vật Viện Cây

Ăn Quả Miền nam, các bạn trong và ngoài lớp, đặc biệt là các bạn cùng thực hiện đề tài đã động viên, giúp đỡ nhiệt tình trong quá trình học và thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010 TRẦN THỊ KIỀU LÂM

TÓM TẮT

Đề tài “ Khảo sát khả năng đối kháng của một số dòng nấm Paecilomyces spp

và Trichoderma spp với tuyến trùng bướu rễ (Meloidogyne spp.) trong điều kiện in

vitro và nhà lưới ” được tiến hành tại phòng nghiên cứu Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện

Cây Ăn Quả Miền Nam thời gian từ ngày 12 tháng 01 năm 2010 đến ngày 12 tháng 7 năm 2010

Mục đích nghiên cứu tiềm năng sử dụng nấm Paecilomyces spp và

Trichoderma spp trong phòng trừ sinh học tuyến trùng gây bướu rễ Meloidogyne spp

Kết quả nghiên cứu

Dịch trích của bốn dòng nấm Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces sp (2),

Paecilomyces sp TH, Paecilomyces sp (1) có hiệu quả nhanh làm chết 50% ấu trùng

tuổi 2 Meloidogyne spp sau 6 giờ thí nghiệm, 99% ấu trùng tuổi 2 sau 48 giờ thí nghiệm Nấm Trichoderma spp có tác dụng chậm, tỷ lệ chết của ấu trùng tuổi 2 sau 24 giờ thí nghiệm là 25% (Trichoderma sp (1)), 35% (Trichoderma sp (2)) và 99% sau

Sau 60 ngày nhân sinh khối Bốn dòng nấm Paecilomyces spp đều phát triển

tốt trên cả hai vật liệu, trong đó nấm được cấy trên cám Balong cho mật số cao hơn

trên bột gạo Dòng nấm Paecilomyces lilacinus có mật số bào tử cao nhất 7,65 x1016(cám Balong) Dòng nấm Paecilomyces sp (2) có mật số bào tử thấp nhất 1,23 x109

(cám Balong)

Cả bốn dòng nấm Paecilomyces spp đều không ảnh hưởng đến khả năng nảy

mầm và sự sinh trưởng của cây cà chua

Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chế phẩm nấm Paecilomyces spp cho thấy trong điều kiện in vitro, cả bốn dòng nấm Paecilomyces spp không ảnh

hưởng đến khả năng nảy mầm của cây cà chua Trong điều kiện nhà lưới, cả bốn dòng

nấm Paecilomyces spp có tác động giúp cây sinh trưởng tốt hơn, trong đó dòng

Paecilomyces sp TH tác động tốt nhất Dòng Paecilomyces lilacinus có hiệu quả

phòng trừ tuyến trùng cao nhất trong bốn dòng Paecilomyces spp

Qua kết quả thí nghiệm, có thể sử dụng dòng Paecilomyces lilacinus trong phòng trừ sinh học tuyến trùng gây bướu rễ Meloidogyne spp

MỤC LỤC

Trang tựa ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

Chương 1 1

GIỚI THIỆU CHUNG 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Yêu cầu 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về nấm Paecilomyces spp 3

2.2 Sơ lược về nấm Trichoderma spp 4

2.3 Sơ lược về tuyến trùng Meloidogyne spp 5

2.3.1 Phân loại 6

2.3.2 Đặc điểm tuyến trùng (Meloidogyne spp.) 6

2.3.3 Đặc tính sinh học 7

2.3.4 Tác hại của bệnh bướu rễ 7

2.3.5 Triệu chứng gây hại của tuyến trùng Meloidogyne spp 8

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 9

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 9

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước 10

2.4.3 Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp 11

Chương 3 13

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Vật liệu thí nghiệm 13

3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm, phân tích thống kê và xử lí số liệu 22

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.3.1 Xác định khả năng đối kháng với tuyến trùng Meloidogyne spp của một số dòng nấm Paecilomyces spp và Trichoderma spp 13

3.3.2 Khảo sát khả năng phát triển của 4 dòng nấm Paecilomyces spp trên môi trường PDA 16

3.3.3 Chọn môi trường nhân sinh khối nấm Error! Bookmark not defined

3.3.4 Đánh giá ảnh hưởng của một số chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến khả năng nảy mầm, sự sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện in vitro và nhà luới

Error! Bookmark not defined

3.3.4.1 Đánh giá khả năng gây bệnh, gây độc của một số chế phẩm nấm

Paecilomyces spp đến khả năng nảy mầm của cây cà chua trong điều kiện in vitro

18

3.3.4.2 Đánh giá khả năng gây bệnh, gây độc của một số chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến sự sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện nhà lưới 19

3.3.5 Đánh giá hiệu quả quản lý tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp của các chế phẩm nấm Paecilomyces spp trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới 20

Chương 4 23

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả xác định khả năng đối kháng của một số dòng nấm (Paecilomyces spp và Trichoderma spp.) với tuyến trùng Meloidogyne spp trong điều kiện in vitro 23

4.2 So sánh sự phát triển của bốn dòng Paecilomyces spp trên môi trường PDA 29

4.3 Chọn lọc môi trường nhân nhanh nấm Paecilomyces spp 32

4.4 Kết quả khả năng gây bệnh, gây độc của một số chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến khả năng nảy mầm, sự sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện in vitro và nhà lưới 34

4.5 Hiệu quả phòng trị tuyến trùng Meloidogyne spp của một vài dòng chế phẩm nấm Paecilomyces spp trong điều kiện nhà lưới 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 47

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 6 giờ sau chủng

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 12 giờ sau chủng

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 24 giờ sau chủng

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 36 giờ sau chủng

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 48 giờ sau chủng

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 60 giờ sau chủng

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của dịch trích từ một số dòng nấm (Paecilomyces spp và

Trichoderma spp.) đối kháng đến tỷ lệ chết ATJ2 ở 72 giờ sau chủng

Bảng 4.9: Mật số bào tử các dòng nấm Paecilomyces spp trên môi trường PDA 21

NSC

Bảng 4.10: Mật số bào tử nấm Paecilomyces spp trong bột gạo và cám Balong ở 21

NSC

Bảng 4.11: Mật số bào tử nấm Paecilomyces spp trong bột gạo và cám Balong ở 60

NSC

Bảng 4.12: Ảnh hưởng của các dòng chế phẩm Paecilomyces spp đến khả năng nảy mầm của cà chua trong điều kiện in vitro

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của một số dòng chế phẩm Paecilomyces spp đến sự sinh

trưởng của cây cà chua trong điều kiện nhà lưới

Bảng 4.14: Sự sinh trưởng của thân cây cà chua sau 40 ngày chủng ATJ2

Bảng 4.15: Sự sinh trưởng của rễ cây cà chua sau 40 ngày chủng ATJ2

Bảng 4.16: Chỉ số bướu rễ trên cây cà chua sau khi xử lý chế phẩm Paecilomyces spp Bảng 4.17: Mật số tuyến trùng trong đất sau khi xử lý chế phẩm Paecilomyces spp

trong 200ml đất ở 5 tuần sau chủng ATJ2

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.2: Mật số tuyến trùng trong 200g đất ở 5 tuần sau chủng ATJ2

Biểu đồ 4.1: Diễn biến tỷ lệ chết trung bình của ATJ2 ảnh hưởng của dịch trích

của một số dòng nấm (Paecilomyces spp và Trichoderma spp.) ở các thời điểm theo

dõi

TLTT: Trọng lượng tươi thân TLKT: Trọng lượng khô thân TLTR: Trọng lượng tươi rễ TLKR: Trọng lượng khô rễ

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Đặt vấn đề

Tuyến trùng ký sinh thực vật là nhóm vi sinh vật gây hại nguy hiểm và mức độ

gây hại rất lớn Trong đó tuyến trùng gây bướu rễ (Meloidogyne spp.) được xem là loài

tuyến trùng gây hại nghiêm trọng nhất, đây là loài phân bố rộng rãi trên thế giới và ký sinh rất nhiều cây trồng có giá trị kinh tế quan trọng Năng suất cây rau bị thất thu do tuyến trùng gây bướu rễ thay đổi từ 29-90% tùy thuộc vào giống, mùa vụ và hệ thống cây trồng Tuyến trùng gây bướu rễ là nguyên nhân thất thu năng suất hàng năm ở vùng nhiệt đới đến 29% ở cà chua, 23% ở cà nâu, 22% ở đậu bắp, 28% ở đậu, 15% ở

ớt, 26% ở cải bắp và 24 % ớ khoai tây (Đặng Thùy Linh và Nguyễn Huy Cường, 2009) Các phương pháp phòng trị tuyến trùng ký sinh thực vật cổ điển, thường dùng các loại hóa chất tổng hợp nên dễ đưa đến hiện tượng kháng thuốc và khó phòng trị hiệu quả với các mầm bệnh có trong đất Do các loài vi sinh vật gây bệnh có khả năng phân bố khá sâu trong đất Việc sử dụng nông dược cũng để lại dư lượng độc chất trên nông sản, dễ gây hại cho người tiêu dùng đồng thời cũng gây ô nhiễm môi trường, nhất là khi được xử lý vào đất Vì vậy, việc sử dụng các tác nhân phòng trừ sinh học

để phòng trị bệnh cây là hướng bền vững nhằm hạn chế tác hại của các nông dược đến

con người và môi trường

Vì vậy, đề tài “ Khảo sát khả năng đối kháng của một số dòng nấm

Paecilomyces spp và Trichoderma spp với tuyến trùng bướu rễ (Meloidogyne

spp.) trong điều kiện in vitro và nhà lưới ” đã được thực hiện

1.2 Mục tiêu

Xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp của một số dòng nấm Paecilomyces spp và Trichoderma spp trong điều kiện in vitro và nhà lưới

1.5 Đối tượng nghiên cứu

Một số dòng nấm Paecilomyces spp., Trichoderma spp và tuyến trùng bướu rễ

Meloidogyne spp

1.6 Giới hạn đề tài

Các dòng nấm Paecilomyces spp., Trichoderma spp sử dụng trong thí nghiệm

có nguồn từ Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây Ăn Quả Miền Nam Đề tài chỉ đánh

giá hiệu quả phòng trừ của các dòng nấm Paecilomyces spp., Trichoderma spp đối với tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp trong điều kiện in vitro và nhà lưới

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về nấm Paecilomyces

Paecilomyces là loài nấm ký sinh đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới

Nấm này có thể được tìm thấy ở nhiều môi trường, đất canh tác, đất bỏ hoang, rừng,

trên các đồng cỏ, trong các bể trầm tích hoặc ngay cả ở bùn cống Một số loài được

phân lập từ côn trùng, có thể tìm thấy trong trứng của một số loại trứng tuyến trùng

Paecilomyces là loài nấm thường xuyên được phát hiện trên các đồng ruộng, ở chỗ đất

bao quanh rễ của cây, nơi mà đất trồng, vi sinh vật và rễ cây có mối quan hệ gắn bó Giới hạn nhiệt của loài này rất rộng, từ 8°C đến 38°C , vùng cực thuận là từ 26°C đến

30°C Paecilomyces cũng có phổ pH rất rộng, vì vậy Paecilomyces có thể sống trong

nhiều loại môi trường khác nhau

Một số dòng nấm Paecilomyces spp được đánh giá là có ích trong phòng trừ một số loài côn trùng gây hại và cả trên tuyến trùng Paecilomyces fumosoroseus được ghi nhận là loài gây bệnh cho một số côn trùng gây hại, trong khi đó Paecilomyces

lilacinus là loài có khả năng ký sinh trên tuyến trùng Morgan Jones và ctv, (1984) ghi

nhận Paecilomyces lilacinus là một trong những tác nhân sinh học, rất hiệu quả trong

phòng trừ tuyến trùng ký sinh cây trồng Theo Jatala (1980) và Dunn (1982)

Paecilomyces lilacinus có khả năng ký sinh trứng tuyến trùng gây bướu rễ

(Meloidogyne spp.) (Nguyễn Thị Hài, 2008)

Đặc điểm nấm của Paecilomyces

Paecilomyces đã được phân loại vào nhóm nấm bất toàn Deuteromycetes, Paecilomyces cũng được phân vào chi Isarioidea, là chi bao gồm các loài nấm có quá

trình sinh trưởng và phát triển còn sơ khai, kém hoàn thiện Hình dạng của

Paecilomyces là một sợi nấm dài và phức tạp, trên đó có nhiều sợi nấm Sợi nấm là

cấu trúc một chùm sợi tỏa ra từ một nhánh Sợi nấm có khả năng sinh sản gọi là

conidiophores Từ điểm cuối của một nhánh, ngay vị trí bào tử, sản sinh ra nhiều

nhánh, từ nhánh mới bào tử mọc và sẽ phát triển khi gặp môi trường thích hợp, có đủ

chất dinh dưỡng Một quần thể nấm Paecilomyces khi gặp môi trường thạch chứa

đường mạch nha sẽ sinh trưởng rất nhanh, đạt đến kích thước khoảng 5 – 7 cm trong

vòng 14 ngày ở nhiệt độ 25°C Lúc đầu khuẩn lạc Paecilomyces sẽ có màu trắng, nhưng sau đó khi bào tử hình thành thì khuẩn lạc Paecilomyces chuyển sang màu đỏ

rượu nho, hồng tím, những hypha sinh dưỡng sẽ trở nên trong suốt, phẳng và rộng khoảng 2,5 – 4,0 µm, conidiophores sản sinh từ những hypha bị chìm trong chất thạch, dài khoảng 400–600 µm Hoặc cũng có thể sản sinh từ những hypha nổi phía trên với độ dài bằng một nửa, các nhánh sản sinh từ một phần cơ bản của sợi nấm bị

phình to ra, đâm ra thành 1 cái cổ nhánh rõ ràng, và cứ thế lớn lên Các bào tử nấm

thay đổi từ hình elip sang hình thoi, từ trơn nhẵn chuyển sang hơi xù xì (Nguyễn Thị Hài, 2008)

2.2 Sơ lược về nấm Trichoderma

Đặc điểm nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma phân bố khắp nơi trên thế giới và thường chiếm ưu thế trong

thành phần vi sinh vật đất Chúng có thể sống trong đất, trên xác bã thực vật, Nhiệt

độ tối hảo cho sự phát triển của hầu hết các loài nấm Trichoderma là 25 - 300C ( Lại

Văn Ê, 2003) Theo Kubicek-Pranz (1998), những loài Trichoderma có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới (như T citrinoviride) sẽ có khoảng nhiệt độ tối hảo cao hơn những loài có nguồn gốc ôn đới (như T polysporum và T viride)

Trichoderma là một loại vi nấm được phân lập từ đất, thường hiện diện ở vùng

xung quanh hệ thống của rễ cây Đây là loại nấm hoại sinh có khả năng ký sinh và đối

kháng trên nhiều loại nấm bệnh cây trồng Nhờ vậy nhiều loài Trichoderma spp đã

được nghiên cứu như là một tác nhân phòng trừ sinh học (BCAs) và đã được thương mại hóa thành thuốc trừ bệnh sinh học (biofungicides), phân sinh học (biofertilizers)

và chất cải tạo đất (soil amendments) (Harman và ctv, 2004)

Tùy theo dòng nấm, việc sử dụng nấm Trichoderma trong nông nghiệp đã tỏ ra có

nhiều thuận lợi như: (i) Tập đoàn khuẩn lạc nấm phát triển nhanh, tạo thành cộng đồng

vi sinh vật xung quanh vùng rễ cây (ii) Nấm có khả năng phòng trị, cạnh tranh hoặc tiêu diệt các tác nhân gây bệnh (iii) Cải thiện sức khỏe của cây trồng (plant health) (iv) Kích thích sự phát triển của rễ nhờ tiết ra các chất điều hòa sinh trưởng (phytohormones) (Harman 2000)

Đặc điểm phân loại và hình thái học của nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm Bất Toàn (Deuteromycetes), bộ nấm Bông (Moniliales), họ Moniliaceae và chi Trichoderma

(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) Nấm này có giai đoạn sinh sản hữu tính thuộc lớp Ascomycetes, bộ Hyporcaelos và chi Hypocrea (Agrios, 1997)

Ở giai đoạn phát triển đầu, khuẩn lạc của Trichoderma có màu trắng nếu được

nuôi cấy trên môi trường giàu dinh dưỡng như PDA và trong suốt nếu được nuôi trên môi trường CMA (Corn Meal dextrose Agar) Trong quá trình phát triển nấm thường tiết sắc tố vàng vào môi trường nuôi cấy, nhất là khi được nuôi cấy trên môi trường PDA ( Nguyễn Ngọc Châu, 2000)

Bào tử của nấm Trichoderma thường mọc thành chùm, ban đầu có màu trắng sau

chuyển thành màu xanh (Cook và Baker, 1989) Bào tử nấm thường có hình bầu dục, kích thước (3 - 5) x (2 - 4) μm (dài/ngang EMBED Equation.3 1,3), vách trơn láng

hoặc sù sì (McCray, 2002) Tất cả các loài Trichoderma đều có khả năng sinh bào tử

áo (chlamydospore) Bào tử áo có hình cầu méo và đa số tồn tại ở dạng đơn bào

.( Nguyễn Ngọc Châu, 2000)

Đa số các dòng nấm Trichoderma được ứng dụng trong nông nghiệp đều có khả

năng phân cắt các carbohydrates, chlorophenols và các loại nông dược chứa xenobiotic.( Nguyễn Ngọc Châu, 2000)

Cơ chế tác động chính của nấm Trichoderma sp là ký sinh và tiết ra các kháng

sinh trên các loài nấm gây bệnh .( Nguyễn Ngọc Châu, 2000)

2.3 Sơ lược về tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Bệnh bướu rễ được phát hiện đầu tiên ở Arkansas thuộc Hoa Kỳ (Tullis, 1934),

thành phần tuyến trùng gây bệnh khá phức tạp bao gồm một số loài Meloidogyne được ghi nhận trên lúa như: M incognita (Ibrahim và ctv, 1972), M javanica (Linde, 1956),

M arenaria (Linde, 1956), M oryzae ( Maas và ctv, 1978) Cho đến nay đã thống kê

được khoảng gần 80 loài tuyến trùng ký sinh thuộc giống Meloidogyne, trong đó có 4 loài tuyến trùng ký sinh gây hại quan trọng nhất là M incognita, M arenaria, M

javanica, M hapla (Nguyễn Ngọc Châu, 2003) Tuyến trùng M graminicola không

hại trên đậu nành, khoai lang, ngô và một số cây khác (Golden và Birchfield, 1968) Tuy nhiên, qua khảo sát ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Nguyễn Thị Thu (2) và ctv

(1990) ghi nhận Meloidogyne graminicola cũng tấn công trên cây đậu nành ngoài ký chủ chính là cây lúa

2.3.1 Phân loại tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Vị trí của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp trong hệ thống phân loại (theo

Maggenti, 1982)

2.3.2 Đặc điểm tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Đặc điểm hình dạng của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp là giống tuyến trùng nội ký sinh, hình

dạng thay đổi tùy giai đoạn sinh trưởng Ấu trùng các tuổi J1, J2, J3 có hình dạng

giống nhau Con trưởng thành có kích thước lớn dạng lãi, con cái có dạng quả lê hay

dạng tròn, màu trắng (Lamberti và Taylor, 1979)

(1) Meloidogyne incognita (Kofoid White, 1919) Chitwood, 1949

Con cái dài 0,73 mm (0,57 – 0,85), rộng 0,54 mm (0,36 – 0,66), kim chích hút 14 – 15

µm Con đực dài 1,78 mm (1,70 – 1,90), kim chích hút dài 22,8 µm (22,2 – 23,6)

Tuyến trùng tuổi 2 dài 0,37 mm (0,35 – 0,40), kim chích dài 10 µm Trứng dài 97 µm

(92 – 103), rộng 38,2 µm (37,8 – 42,8)

(2) Meloidogyne arenaria (Neal, 1889) Chitwood, 1949

Con cái dài 0,78 mm (0,66 – 0,82), rộng 0,58 mm (0,35 – 0,80), kim chích dài 14 – 16

µm Con đực dài 1,35 mm (1,18 – 1,45), kim chích dài 21,5 µm (19,6 – 21,6) Tuyến

trùng tuổi 2 dài 0,44 mm (0,38 – 0,47), kim chích dài 10,4 µm Trứng dài 96,7 µm

(95,6 – 104,4), rộng 37,4 µm (36,1 – 42,8)

(3) Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949

Con cái dài 0,65 mm (0,47 – 0,71), rộng 0,44 mm (0,32 – 0,52), kim chích dài

14,8 µm Con đực dài 0,98 – 1,42 mm, kim chích dài 20,9 µm Tuyến trùng tuổi 2 dài

0,43 mm (0,36 – 0,47), kim chích dài 10,8 µm Trứng dài 85,5 µm (74 – 96,5), rộng

31, 8 µm (28 – 34) (Lê Lương Tề, 2007)

Đặc tính sinh học của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Theo Phạm Ngọc Tuấn (1990) thì Birchfield (1964) quan sát thấy trên

Echinochloa colorum, con cái tuyến trùng bướu rễ M graminicola nằm bên trong

bướu rễ và đẻ trứng trong bọc trứng Vòng đời của tuyến trùng bướu rễ M

graminicola từ 26 – 51 ngày tùy theo thời tiết trong năm Ấu trùng có thể xâm nhập

vào rễ trong 5 giờ sau chủng

Theo Võ Thanh Hoàng, tuyến trùng bướu rễ M graminicola là tuyến trùng nội

ký sinh, ấu trùng có dạng con lãi kim, khi phát triển giới tính, tuyến trùng cái đổi thành dạng quả lê, trong khi tuyến trùng đực vẫn giữ dạng lãi kim

Theo Wallace (1969) tỷ lệ sinh sản của tuyến trùng bướu rễ M graminicola tốt

nhất ở đất cát thô, trong khi đó sự xâm nhập tốt nhất ở đất cát thường

Tuyến trùng bướu rễ M graminicola cũng được tìm thấy hầu hết ở các loại đất

của Đồng Bằng Sông Cửu Long, trừ vùng đất phèn nhiễm mặn của Cà Mau

(Nguyễn Thị Thu (2) và ctv, 1988)

Sa cấu đất cũng có ảnh hưởng đến khả năng gây hại của tuyến trùng, đất nhẹ giúp tuyến trùng dễ di chuyển, dễ lây lan và cũng thích hợp cho việc đẻ trứng Ở đất cạn tuyến trùng tập trung ở khoảng 4 – 12 cm mặt, trong khi ở đất có dẫn thủy tuyến trùng tập trung ở khoảng 2 – 6 cm mặt (Võ Thanh Hoàng)

2.3.3 Tác hại của bệnh bướu rễ do tuyến trùng Meloidogyne spp gây ra

Ước tính hàng năm thiệt hại do tuyến trùng ký sinh thực vật gây ra cho nền nông nghiệp thế giới trung bình là 12,38% Đối với các quốc gia phát triển, thiệt hại do tuyến trùng gây ra cho một số cây trồng có giá trị về lương thực và xuất khẩu là 8,8%, trong đó ở các quốc gia đang phát triển là 14,6% Ở Mỹ hàng năm thiệt hại do tuyến trùng bướu rễ gây hại ra cho nền nông nghiệp lên đến hàng trăm triệu dollar Ở Nga tuyến trùng gây hại trên cây cà chua, dưa chuột làm giảm năng suất 80% Ở Srilanca hàng năm phải tiêu tốn hơn một triệu dollar cho các biện pháp phòng trừ tuyến trùng

và nếu có dịch hại xảy ra thì mức gây hại tăng lên 20 lần Tại Mexico, sự thiệt hại do

tuyến trùng bướu rễ M incognita gây ra trên cà chua, khoai tây, cà phê và bắp có thể thất thu năng suất từ 30-100% Tuyến trùng M incognita cũng được ghi nhân gây hại

rất nặng tại Brazil, chỉ trong hai năm 1976 và 1977 hơn 3 triệu cây cà phê đã bị hủy diệt vì loài tuyến trùng này (Đặng Thùy Linh và Nguyễn Huy Cường, 2009)

2.3.4 Khả năng gây hại của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Theo Rao (1969) và Rey (1975) thì M graminicola được xem là tác nhân gây

hại quan trọng, có khả năng lưu tồn trên lúa hay trong đất tại Ấn Độ Ở Lào tuyến trùng ký sinh thực vật thường gây hại nặng trên lúa ở giai đoạn mạ, làm mạ vàng và

khô đi, nếu bị nhiễm nặng mạ có thể chết (Maner,1968) (Nguyễn Thị Thu (2) và Prot,

1997 dẫn nhập)

Theo Trịnh Thị Thu Thủy và ctv (2005) khi nghiên cứu biến động số lượng

quần thể tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp hại cây Hồ tiêu ở Miền Trung và miền

Tây Nguyên, đã phát hiện được 29 loài tuyến trùng ký sinh thực vật, thuộc 10 họ khác nhau trên các vườn trồng cây Hồ tiêu ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum Trong đó, 8 loài tuyến trùng đã được thêm vào danh mục thành phần tuyến trùng ký sinh gây hại cây hồ tiêu đã biết trước đây Trong 29 loài tuyến

trùng đã phát hiện, loài tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp là chủ yếu nhất và phổ

biến.( Vũ Triệu Mân, 2007 dẫn nhập)

Ở Việt Nam, M javanica là tuyến trùng ký sinh tương đối phổ biến sau loài M

incognita, gây hại chính trên cây lạc và cây chuối (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Có 3 loài tuyến trùng tấn công trên đậu nành là M incognita, M javanica, M

arenaria (Ibrahaim và El-Seady, 1982)

Theo Appel và Lewis (1982) thì M incognita tấn công sẽ làm giảm trọng

lượng hạt, chiều cao cây và số lượng các nốt sần trên rễ của cây đậu nành Cây có triệu chứng cằn cỗi, vàng úa và có khuynh hướng héo vào mùa khô (Franklin, 1982)

Theo Đặng Ngọc Kính (1982) nếu một cây mạ khi chủng 10 bướu rễ có thể làm giảm 30 – 50 % chiều cao và 65% năng suất

Theo Patnaik (1969) với mức độ nhiễm nặng vào khoảng 12.000 ấu trùng M

graminicola trên một cây, cây mạ sẽ mất màu và lá sẽ bắt đầu khô héo Rao và Biswas

(1974) cũng cho biết năng suất hạt giảm đi phụ thuộc mức độ nhiễm của cây lúa Patnaik(1969) ghi nhận trong thí nghiệm có tới 62 con tuyến trùng (trong đó có 45 thành trùng cái đang sinh sản) trên một cây lúa và mặc dù cây lúa có 1785 bướu mà cây lúa vẫn không biểu hiện triệu chứng bệnh ra trên thân lá (Nguyễn Thị Phong Lan,

1989 dẫn chứng)

2.3.5 Triệu chứng gây hại của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Tùy từng loại tuyến trùng ký sinh mà biểu hiện triệu chứng trên cây ký chủ có các đặc điểm khác nhau Cho đến nay đã thống kê được khoảng gần 80 loài ký sinh

thuộc giống này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M incognita,

M arenaria, M javanica, M hapla (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Văn Thanh,

2003) Meloidogyne spp là nhóm gây hại bộ phận bên dưới mặt đất như thân ngầm, rễ,

củ, chủ yếu làm tổn thương bộ rễ, bộ rễ bị quăn queo ít rễ con và biến dạng, cây sinh

trưởng kém, lá vàng úa Tuyến trùng Meloidogyne spp sau khi ký sinh vào trong mô

rễ ký chủ, ngoài việc chích hút dinh dưỡng của cây, tuyến trùng còn tiết ra các chất kích thích làm cho các tế bào xung quanh vùng bị tấn công phát triển mạnh hình thành các đại bào tạo nên các bướu rễ làm rễ bị huỷ và mất dần khả năng hấp thu nước và dinh dưỡng Bướu rễ là nơi tuyến trùng ký sinh định cư và sinh sản, đôi khi trong bướu

rễ còn tồn tại nhiều giai đoạn tuyến trùng khác nhau Bướu rễ được hình thành sau 1 -

2 ngày nhiễm, một số cây trồng hình thành bướu rễ chỉ sau 24 giờ nhiễm Qua vết thương ở rễ do tuyến trùng ký sinh gây ra làm cho các vi sinh vật khác xâm nhập dễ dàng và bệnh trở nên nặng hơn

Appel và Lewis (1982) báo cáo rằng khi tuyến trùng M incognita tấn công cây

đậu nành sẽ làm giảm trọng lượng hạt, chiều cao cây và số lượng các nốt sần trên rễ

Cây đậu nành có triệu chứng cằn cỗi, vàng úa và có khuynh hướng héo vào mùa khô

(Franklin, 1982)

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Theo Nguyễn Bá Khương (1978) có tới 20 loài tuyến trùng gây hại đã được tìm

thấy ở các tỉnh phía Nam, quan trọng nhất là tuyến trùng nốt sưng như M incognita,

M javanica, M Arenaria

Nguyễn Thị Thu (2) (1988) đã dẫn chứng tài liệu của Wallace (1969) tỷ lệ sinh

sản của tuyến trùng bướu rễ M graminicola tốt nhất ở đất cát thô, trong khi đó sự xâm nhập tốt nhất ở đất cát thường M graminicola cũng được tìm thấy hầu hết ở các loại

đất của Đồng Bằng Sông Cửu Long, trừ vùng đất phèn nhiễm mặn của Cà Mau

Meloidogyne spp là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất và có số lượng

thành phần loài rất lớn khoảng 88 loài khác nhau (Vũ Triệu Luân vả Lê Lương Tề, 1998) Theo Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh (2000), đến nay có 5 loài

Meloidogyne hiện diện ở Việt Nam Meloidogyne arenaria phân bố ở Sơn La (thị xã

Sơn La), Hải Phòng (Minh Đức), Nam Hà (Lý Nhân), Thái Bình (Quỳnh Dao)

Meloidogyne cynariensis phân bố ở Lâm Đồng (Đà Lạt) Meloidogyne graminicola phân bố ở Nghệ An (Nghi Lộc, Nghĩa Đàn, Quỳnh Lưu, Nam Đàn) Meloidogyne incognita phân bố ở khắp mọi nơi Meloidogyne javanica phân bố ở Cao

Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Phú Thọ, Thái Bình, Hải Phòng, Hà Nam, Nam Định, Ninh

Bình, Quảng Bình, Lâm Đồng

Theo Trần Vũ Phến (1987) dẫn chứng tài liệu của Yik và Brichfield (1978) cho

biết tuyến trùng cái M graminicola đẻ khoảng 260 đến 325 trứng, tuyến trùng trưởng

thành với tỷ lệ con đực trên con cái 1/12

Theo Hollis (1966) và Panik (1969) quan sát thấy rằng M graminicola đòi hỏi

41 giờ để ấu trùng có thể cố định trong mô phân sinh rễ Bướu rễ sẽ được thành lập sau

4 giờ xâm nhiễm Trong rễ, con đực hình giun, con cái phình to ra

Theo Lê Lương Tề (1977), tuyến trùng bướu rễ sẽ kéo dài vòng đời ở điều kiện

nhiệt độ thấp, và theo Corinek (1965), tuyến trùng bướu rễ chỉ đẻ trứng khi nhiệt độ

lớn hơn hay bằng 14 0C, tuyến trùng bướu rễ sẽ chết nếu như nhiệt độ lớn hơn 400C

Trứng tuyến trùng M graminicola nở tốt nhất ở 25 – 30 0C Ở nhiệt độ khoảng

21 – 23,50C, mật số tuyến trùng trong đất và số bướu hình thành sẽ cao nhất (Võ

Thanh Hoàng)

Theo Nguyễn Thị Thu (2) và ctv (1997) hai ngày sau chủng, một số lượng lớn

tuyến trùng tuổi 2 (J2) đã được ghi nhận hiện diện trong rễ cây lúa ở cả hai chế độ

nước Số lượng tuyến trùng xâm nhập vào rễ gia tăng theo thời gian quan sát Hai ngày

sau chủng 31,4% J2 chủng đã xâm nhập vào trong rễ cây lúa trong điều kiện đất bão

hòa, trong khi đó thì trong điều kiện ngập nước chỉ có 7,1% J2 đã xâm nhập vào trong

rễ Sự xâm nhập cao nhất xảy ra vào 16 ngày sau chủng với sự hiện diện của 76,4% J2

trong rễ ở điều kiện đất bão hòa và 40,6% J2 trong điều kiện đất ngập nước

Tại vùng đồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Thị Thu (2) và ctv ( 2002) ghi

nhận có một số loài tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne hiện diện gây hại trên lúa như

M graminicola, M incognita, M Javanica Tuy nhiên, loài tuyến trùng bướu rễ

M graminicola chiếm ưu thế hơn còn các loài khác chỉ phát hiện thấy rải rác trên một

số chân ruộng cao hoặc ruộng luân canh lúa - màu Ngoài ra, tuyến trùng bướu rễ

M graminicola cũng được ghi nhận tấn công cả trên đậu nành

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Tuyến trùng (Nematodes) được biết đến từ lâu ở Ai Cập khoảng 1500 năm

trước công nguyên Năm 1930, Nagakura đã nghiên cứu được giống Meloidogyne

Đây là loài tuyến trùng bướu rễ gây hại nặng trên nhiều loài cây trồng (Goddi 1887)

Meloidogyne incognita (Kofoid – White, 1949) là loài phổ biến ở vùng nhiệt

đới, gây hại hầu hết các loại cây trồng và cây dại như: cà chua, thuốc lá, ớt, hồ tiêu, cà

pháo, bầu bí, chuối, dứa, …

Nhiệt độ thích hợp cho tuyến trùng bướu rễ M graminicola nằm trong khoảng

28 - 300C Tốc độ phát triển các giai đoạn của tuyến trùng như trứng, ấu trùng phụ

thuộc vào nhiệt độ, ẩm độ Do đó trong những năm khô hạn cây bị bệnh do tuyến trùng

giảm đi, điều kiện trong đất không cho phép ấu trùng sống lâu dài nên không kịp gây

hại cho cây trồng ( Taylor, 1968)

Mặc dù tuyến trùng bướu rễ M graminicola được ghi nhận gây hại chủ yếu

trong điều kiện đất bảo hòa (Tandingan, 1993), hoặc trên lúa mọc trong điều kiện đất rẫy (Plowright và Bridge, 1990) và không ghi nhận gây hại trên đất ngập nước (Prot và Matias, 1994), nhưng mật số ATJ2 lại hiện diện rất cao trong điều kiện ngập nước so với điều kiện lúa rẫy (Prot và Matias, 1994)

2.4.3 Nghiên cứu các biện pháp phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp

Việc đánh giá thiệt hại do tuyến trùng gây ra đã được tiến hành nhưng để có đầy đủ cơ sở dữ liệu và kỹ thuật cho việc đánh giá thì khó khăn hơn nhiều so với côn trùng ( Bhatti và Singh, 1992)

Trichoderma được sử dụng như là một tác nhân để kiểm soát sinh học bệnh bướu rễ do Meloidogyne spp gây ra (Windham, 1993)

Sự kết hợp của Trichoderma harzianum và chế phẩm Neem trong việc phòng

trừ tuyến trùng gây bướu rễ trên cây cà chua cho kết quả tốt hơn so với khi chỉ sử dụng

Trichoderma harzianum ( Kumar và Kana, 2006)

Năm 1989, Windham và cộng sự đã báo cáo khả năng sinh sản của loài tuyến

trùng gây bướu rễ Melodoigyne arenaria giảm xuống khi đất được xử lý trước bằng

Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii Khi phối hợp T.harzianum với sản

phẩm cây Neem (Azadirachta indica) bón vào đất thì quần thể tuyến trùng Tylenchulus

semipenetrans trên cây ăn trái giảm xuống rõ rệt Một số công thức khác của T harzianum cũng có khả năng kiểm soát tuyến trùng M javanica rất tốt Trên cây cà

chua bị nhiễm tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne, và nếu đất được xử lý bằng T

harzianum, thì số lượng bướu rễ giảm đi

Một vài kết quả nghiên cứu đã cho thấy khả năng quản lý sự phát triển của

tuyến trùng bằng nấm Paecilomyces lilacinus trong thực tế là rất cao (Stirling,

Mankau, 1978, Stirling và ctv, 1979 và Al-Hazmi và ctv, 1982) Sử dụng bào tử nấm

Paecilomyces lilacinus để kiểm soát tuyến trùng M incognita (Davide và Batino,

1985) trên bông vải có hiệu quả

Cabanillas và Barber (1986) đã công bố kiểm soát thành công khả năng phá

hoại của tuyến trùng Meloidogyne spp trên ruộng cà chua thông qua quá trình ký sinh trên trứng của tuyến trùng bằng nấm P lilacinus

Tại Peru, Jatala và ctv (1979 ) đã sử dụng nấm P lilacinus để quản lý sinh học tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp., nhà khoa học đã quan sát được quá trình nấm

ký sinh trứng tuyến trùng, và cho thấy khả năng áp dụng biện pháp kiểm soát tuyến

trùng này ở nhiều vùng trên thế giới Đến năm 1981, Jatala và ctv đã công bố kiểm

soát thành công tuyến trùng M incognita bằng nấm P lilacinus trên cà chua

Thí nghiệm xử lý nấm Paecilomyces lilacinus và vi khuẩn Pasteuria penetrans trên cây thuốc lá bị nhiễm M javanica, cho thấy số bướu giảm và sinh trưởng của cây

tốt hơn (Shepherd và Barker, 1990), và kết quả tương tự đã được ghi nhận trên cây

khoai tây (Prasal Krishna, 1992) Nấm P.lilacinus làm giảm số nốt sần, mật số tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp và hiệu quả càng cao khi kết hợp với các nấm đối kháng khác (Monacrosporium lysipagum) (Khan và ctv., 2005) Theo kết quả nghiên cứu của Ibrahim và ctv (1987), để phòng trừ bệnh bướu rễ do Meloidogyne incognyta trên cây bắp sử dụng P lilacinus có hiệu quả làm giảm 71% bướu rễ và 90% túi trứng

Trong khi đó sử dụng thuốc Temik 10G (hoạt chất aldicard) hoạt chất làm giảm 58%

bướu rễ và 83% túi trứng Đối với cây cà chua sử dụng P lilacinus có hiệu quả làm

giảm 66% bướu rễ và 81% túi trứng và khi sử dụng thuốc Temik 10G (hoạt chất aldicard) làm giảm 68% bướu rễ và 60% túi trứng Năm 1987, Stephan và Saad chứng

minh rằng nấm Paecilomyces lalicinus ký sinh trên trứng của tuyến trùng bướu rễ

Meloidogyne incognita trong điền kiện in vitro Điều kiện phát triển tốt nhất trên môi

trường đất pha cát của Paecilomyces lalicinus là ở 25oC Đến năm 2007, Oliver và

Loper một lần nữa đã chứng minh thêm lần nữa nấm Paecilomyces lalicinus ký sinh trên trứng của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita Ngoài ra Dhawan và ctv(2004) đã chứng minh trứng của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita bị nấm P lilacinus ký sinh với tỉ lệ kí sinh trứng 55-70% ở liều lượng 0.03 x 108 bào tử/ml

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 1/2010 đến tháng 7/2010

Địa điểm thực hiện đề tài: Tại Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

3.2 Nội dung nghiên cứu

Xác định khả năng đối kháng với tuyến trùng buớu rễ Meloidogyne spp của một số dòng nấm Paecilomyces spp và Trichoderma spp điều kiện in vitro

Khảo sát khả năng phát triển của 4 dòng nấm Paecilomyces spp trên môi trường PDA và chọn lọc vật liệu nhân nhanh sinh khối nấm Paecilomyces spp

Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến khả năng nảy mầm, sự sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện in vitro và nhà luới

Đánh giá hiệu quả quản lý tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp của các chế phẩm nấm Paecilomyces spp trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới

3.3 Vật liệu thí nghiệm

Bốn dòng nấm Paecilomyces spp.: Paecilomyces lilacinus (Nhật), Paecilomyces sp phân lập từ rệp sáp vú sữa ((1)), Paecilomyces sp phân lập từ (2)

((2)), Paecilomyces sp phân lập từ rầy chồng cánh (TH)

Hai dòng nấm Trichoderma spp.: Trichoderma sp (1) , Trichoderma sp (2) sẽ

được thu thập từ Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Cây Ăn Quả Miền Nam

Cây cà chua bị bệnh bướu rễ do tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp gây ra

Đất đã được khử trùng, hạt cà chua, chậu

Bột gạo, cám Balong, đĩa petri, que cấy, nước cất, môi trường PDA, PDB, đèn cồn, buồng đếm hồng cầu, pipet, que cấy, kính lúp SZX -7(phóng đại 8 lần), cốc thủy tinh, rây số 30, rây số 60, rây số 360, buồng đếm tuyến trùng, kính hiển vi, nước cất, rây, giấy, chậu

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Xác định khả năng đối kháng với tuyến trùng buớu rễ Meloidogyne spp của một số dòng nấm Paecilomyces spp và Trichoderma spp điều kiện in vitro

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 18 nghiệm thức với ba lần lặp lại Mỗi lần lặp lại là một efpendort chứa huyền phù tuyến trùng và dịch trích

của nấm Dịch trích từ sáu dòng nấm: Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces sp (1),

Paecilomyces sp (2), Paecilomyces sp TH, Trichoderma sp (1) , Trichoderma sp (2),

ở ba mức liều lượng là 100% (liều lượng chuẩn ban đầu), 75% và 50% được trình bày

ở bảng 3.1

Nhân nuôi nấm sử dụng trong thí nghiệm

Từ mẫu nấm nguồn ban đầu cấy trên môi trường PDA, PDB trong điều kiện 25

± 1OC, trong phòng nuôi cấy, trong 24 đến 48h, để nhân mật số và giữ nguồn

Thu thập, nhân nuôi và chuẩn bị huyền phù ấu trùng tuổi 2 (Meloidogyne spp.)

Dựa vào đặc điểm hình thái và triệu chứng gây hại đặc trưng để thu tuyến trùng

bướu rễ Meloidogyne spp từ các mẫu bệnh bướu rễ ngoài đồng Từ mẫu rễ thu về

chọn rễ có bướu rễ, rửa dưới vòi nước chảy, xem dưới kính lúp SZX – 7 và tách lấy túi trứng, túi trứng được chuyển cẩn thận qua rây thép có hai lớp giấy thấm, ở phía dưới

có đặt một đĩa petri có chứa nước cất ở 25 ± 1OC, sau 24 - 48h trứng nở

Tùy theo nhu cầu huyền phù tuyến trùng được pha loãng bằng nước cất

Xác định mật số bằng kính hiển vi soi ngược và buồng đếm tuyến trùng

Nguồn ấu trùng chủng vào chậu có chứa 3 – 4kg đất đã khử trùng và trồng cây

cà chua dễ nhiễm tuyến trùng Chủng dung dịch tuyến trùng vào 4 vị trí sâu 3cm quanh gốc thân, lấp đất lại và tưới nước thường xuyên Sau một tháng thu ấu trùng và trứng tuyến trùng

Chuẩn bị dịch trích nấm

Nấm Paecilomyces spp được nuối cấy trên môi trường PDB sau 10 ngày cấy

khuẩn ty mọc đầy bình tam giác đuờng kính 4,5cm thì tiến hành thu họach sinh khối nấm và dịch trích nấm Phần dung dịch thu được được lọc qua giấy lọc hai lần (đường kính lỗ lọc 20μm) để loại bỏ phần sợi nấm còn lại, tiếp tục lọc qua dụng cụ lọc microfilter với đường kính lỗ lọc là 0,2μm để loại bỏ bào tử nấm và các chất cặn bã có trong dung dịch Dịch trích thu được bằng cách này được coi như liều lượng chuẩn

“100%” và các dung dịch kế tiếp “75%” và “50%” được tạo ra bằng cách pha thêm một lượng nước thích hợp (Muhammad, 2003)

Dùng 0,1ml huyền phù chứa 60 con ấu trùng tuổi 2 (ATJ2) cho vào 1ml dịch trích của nấm theo ba liều lượng thí nghiệm (100%, 75%, 50%)

Bảng 3.1 Các dòng nấm Paecilomyces spp., Trichoderma spp.và liều lượng sử

17 NT17 Trichoderma sp (1) 75%

18 NT18 Trichoderma sp (1) 50%

19 NT19 Đối chứng (nước) 100%

Chỉ tiêu theo dõi

Số ấu trùng chết trong mỗi efpendort ở các thời điểm 6h, 12h, 24h, 36h, 48h,

60h, 72h sau chủng

Sau từng khoảng thời gian chủng, hỗn hợp trong mỗi efpendort được rút ra cho

vào đĩa đếm tuyến trùng và đếm số ấu trùng tuổi 2 chết Những con không chuyển

động, cơ thể trong, duỗi thẳng thì được coi là đã chết

Tỉ lệ chết được tính theo công thức:

3.4.2.1 Khảo sát sự phát triển của bốn dòng nấm Paecilomyces spp

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức với 5 lần

lặp lại Mỗi lần lặp lại là một đĩa petri Mỗi dòng nấm là một nghiệm thức, tương

đương với 4 dòng nấm Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces sp (1), Paecilomyces sp

(2), Paecilomyces sp TH

Môi trường nuôi cấy PDA sau khi được hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút

được đổ ra đĩa petri (đường kính 90mm) với lượng 20 ml/ đĩa Khi môi trường đã

nguội tiến hành cấy khoanh nấm, lấy từ mép khuẩn lạc đường kính 0,5 cm có cùng độ

tuổi (5 NSC) vào giữa đĩa petri, ủ ở 25 ± 1oC trong thời gian 21 ngày

Phương pháp chuẩn bị huyền phù bào tử: Bào tử nấm được thu từ khuẩn lạc 21

ngày tuổi trên đĩa môi trường PDA ở 25 ± 1oC bằng cách cho 10ml nước cất vô trùng

lên bề mặt khuẩn lạc và cào nhẹ bằng miếng lam vô trùng Lọc lấy dịch bào tử và đếm

trên buồng đếm hồng cầu Thomas, dịch bào tử được pha loãng đến các liều lượng là

103 bào tử/ml

Các chỉ tiêu theo dõi

Đo đường kính khuẩn lạc (cm): Bắt đầu đo đường kính khuẩn lạc vào thời điểm

3 ngày sau cấy vào môi trường PDA, đo định kỳ 3 ngày một lần Kết thúc đo khi

khuẩn lạc phủ đầy đĩa (21NSC)

Đường kính trung bình được tính theo công thức:

d = (d1 + d2)/2 Trong đó:

d: đường kính trung bình của khuẩn lạc

d1, d2: hai đường chéo vuông góc đo trên bề mặt khuẩn lạc

Màu sắc, hình thái và sự phân bố của khuẩn lạc được quan sát bằng mắt thường

3 ngày/lần

Mật số bào tử được đếm một lần ở thời điểm 21NSC ở tất cả các nghiệm thức

Đếm mật số bào tử /ml bằng buồng đếm hồng cầu Thomas và tính theo công thức:

D = (4000×a×103×10-n) / b Trong đó:

D: mật độ bào tử / ml

a : số bào tử trong 5 ô lớn ( 80 ô con)

b: số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con)

103 : số chuyển mm3 thành ml (1000 m3 = 1ml)

10-n : độ pha loãng mẫu

3.4.2.2 Chọn lọc vật liệu nhân nhanh sinh khối nấm Paecilomyces spp

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 8 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức là một bọc vật liệu 50g đuợc chủng nấm Mỗi lần lặp lại là

một bọc Thí nghiệm sử dụng bốn dòng nấm Paecilomyces spp và hai loại vật liệu

nhân sinh khối được trình bày ở bảng 3.2

Nguồn nấm Paecilomyces spp được nhân nuôi trong môi trường PDB trong

điều kiện 25 ± 1 0C Sau 10 ngày khi khuẩn ty phát triển đầy bình tam giác thì tiến hành thu mẫu và chủng vào giá thể bột gạo hay cám Balong Khi nấm phát triển đồng đều trong gía thể Tiến hành thu 1g chế phẩm nấm ở 21, 60 ngày sau chủng ở từng nghiệm thức, cho vào ống nghiệm cùng với 10ml nuớc, lắc đều (1500 vòng/phút), sau

đó pha loãng dung dịch theo nồng phù hợp Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm mật

số nấm trong dung dịch

Bảng 3.2 Các dòng nấm Paecilomyces spp và vật liệu nhân sinh khối sử dụng

trong thí nghiệm

STT Nghiệm thức Dòng nấm sử dụng Vật liệu sử dụng

Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát sự phát triển của nấm trên vật liệu cấy sau 21, 60 ngày sau cấy

Mật số bào tử/1g chế phẩm

3.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến khả năng

nảy mầm, sự sinh trưởng của cây cà chua trong điều kiện in vitro và nhà luới

3.4.3.1 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến khả năng

nảy mầm của cây cà chua trong điều kiện in vitro

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức với 5 lần

lặp lại Mỗi nghiệm thức là một tờ giấy thấm chứa 40 hạt cà chua Mỗi lần lặp lại là

một tờ giấy thấm Nghiệm thức sử dụng nước cất làm đối chứng Thí nghiệm sử dụng

bốn chế phẩm nấm với mật số được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Các chế phẩm nấm sử dụng trong thí nghiệm

STT Nghiệm thức Dòng nấm sử dụng Mật số bào tử (bào tử/g)

Hạt cà chua được ngâm trong 1g chế phẩm nấm từ 12 – 24h, để ráo, sau đó gieo

hạt vào giấy thấm đã được khử trùng, cung cấp đủ ẩm cho hạt, sau đó cho giấy thấm

có chứa hạt vào phòng 12h sáng và 12h tối Sau 10 ngày tiến hành theo dõi (Đặng

Thùy Linh, 2008)

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ hạt nảy mầm (%)

Sự sinh trưởng của cây cà chua được tính theo chỉ số Vigour Index (VI) (Theo

nghiên cứu của Đặng Thùy Linh, 2008) Và được tính theo công thức

VI% = % hạt nảy mầm x trung bình chiều dài cây/tuần

(Trung bình chiều dài cây = Trung bình (chiều dài rễ + chiều dài thân))

Trọng lượng tươi của cây cà chua (g)

3.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm nấm Paecilomyces spp đến sự sinh

trưởng của cây cà chua trong điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 nghiệm thức, 4 lần

lặp lại Mỗi nghiệm thức là một chậu có đường kính 12cm, chứa 1kg đất đã khử trùng

trồng 1 cây cà chua Mỗi lần lặp lại là một chậu Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước

cất Các nghiệm thức của thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3

Hạt cà chua được gieo trong vĩ xốp, sau 7 ngày nảy mầm, cây cà chua được

nhổ, rửa sạch rễ ngâm trong huyền phù chế phẩm nấm trong 1h Sau đó cây cà chua

được trồng vào chậu đất đã được khử trùng, sau 4 tuần tiến hành theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi

Chiều dài thân(cm), chiều dài rễ (cm), trọng lượng tươi(g), trọng lượng khô của

thân (g) và rễ (g)

Cây cà chua sau khi nhổ lên, rửa sạch, để ráo nước tiến hành lấy chỉ tiêu Rễ cà

chua được từ đầu rễ đến điểm phân cách giữa thân và rễ, thân cây cà chua được tính từ

điểm phân cách đến đỉnh sinh trưởng của cây

Cà chua được sấy khô ở 48h trong 500C, sau đó cây cà chua được để ở nhiệt độ

phòng 27 ± 1 0C trong 7 ngày, tiến hành lấy chỉ tiêu chỉ số sinh trưởng

3.4.4 Đánh giá hiệu quả quản lý tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp của các

chế phẩm nấm Paecilomyces spp trên cây cà chua trong điều kiện nhà lưới

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 5 nghiệm thức, 4 lần lập

lại Mỗi nghiệm thức là một chậu có đường kính 20cm, chứa 3kg đất đã khử trùng, và

2 cây cà chua Mỗi lần lập lại là 1 chậu Các nghiệm thức của thí nghiệm được trình

Chậu có 3 kg đất pha cát theo tỷ lệ 2 : 1 đã được khử trùng Hạt cà chua gieo

vào chậu được 2 tuần thì chủng huyền phù ATJ2 Meloidogyne spp có cùng mật số 200

con/chậu Chủng ở 4 vị trí quanh gốc thân cây cà chua

Chế phẩm nấm Paecilomyces spp được hòa nước cất tưới vào các chậu thí

nghiệm theo mức 0,5 gam trên chậu hoặc 1,5 gam trên chậu tưới sau 4 tuần chủng

tuyến trùng (Wolia và ctv., 1991)

Sau 4 tuần chủng huyền phù nấm tiến hành thu mẫu và điều tra

Chỉ tiêu theo dõi

Các chỉ số sinh trưởng của cây: Chiều cao cây (cm), số lá (lá), trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô của thân (g) và rễ (g)

Số u sưng trên rễ, chỉ số bệnh (cấp) trên cây/chậu

Chỉ số bệnh bướu rễ (Root Knot Index) được xác định theo thang đánh giá của Taylor và Sasser (1978) với 5 cấp như:

Các chỉ tiêu được ghi nhận một lần Cây cà chua được nhổ lên, rửa sạch rễ, đếm

số bướu rễ, số lá thành thục Thu 200g đất ở mỗi chậu, trích lọc và đếm tuyến trùng trong đất

Cà chua được sấy khô ở 48h trong 500C, sau đó cây cà chua được để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, tiến hành lấy chỉ tiêu chỉ số sinh trưởng Rễ cà chua được từ đầu

rễ đến điểm phân cách giữa thân và rễ, thân cây cà chua được tính từ điểm phân cách đến đỉnh sinh trưởng của cây

Mật số tuyến trùng trong 200g đất trong chậu, thực hiện theo phương pháp trích lọc tuyến trùng từ đất của vùng rễ cây

Trích lọc tuyến trùng dựa vào phương pháp kết hợp của kỹ thuật gạn và rây lọc tuyến trùng của Cobb và phễu lọc Baermann hiệu chỉnh (Hooper, 1986) Loại bỏ đất,

đá to lẫn vào, trộn đều phần đất thu về và loại bỏ theo hình chóp lập lại cho đến khi còn 200g đất, thêm vào 0,5 lít nước và để khoảng 15 – 20 phút

Khuấy đều phần đất trong cốc, đợi 1 phút Lọc qua rây số 30, loại bỏ phần đất sỏi trên rây, lặp lại 1 - 2 lần

Tiếp theo sử dụng rây 60 lọc lại phần huyền phù đã lọc ở trên giữ lại phần nước lẫn đất và loại bỏ phần đất trong rây, lặp lại 1 - 2 lần

Cuối cùng, lấy phần huyền phù đã lọc ở rây 60 lọc qua rây 360, lặp lại 1 - 2 lần, lấy phần trên rây 360 được chuyển sang cốc 100ml

Rót phần đất lẫn tuyến trùng lên giấy thấm lót trên lưới rây và đặt trên đĩa petri

có chứa nước cất

Để chúng qua đêm và ngày hôm sau quan sát trên kính hiển vi Lấy ống hút, hút 1ml cho vào đĩa đếm dàn đều dung dịch tuyến trùng lên đĩa đếm tuyến trùng để kiểm tra dưới kính hiển vi soi ảnh ngược

3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm, phân tích thống kê và xử lí số liệu

Số liệu thu được sau thí nghiệm được chuyển đổi theo phương pháp phù hợp (Trần Công Thiện, 1999)

Xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm MSTATC 1,2

Đồ thị vẽ bằng phần mềm EXCEL 2003