ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU BỆNH THỐI RỄ DO NẤM Fusarium solani GÂY RA TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Nguyễn Ngọc Anh Thư Mục tiêu đề tài nhằm tìm ra dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani và tìm ra g ốc ghép có khả năng chống chịu tốt với nấm Fusarium solani gây bệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

Fusarium solani GÂY RA TRÊN CÂY CÓ MÚI

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

NGÀNH : NÔNG HỌC KHÓA : 2008- 2012

SINH VIÊN THỰC HIỆN: PHÙNG THỊ LIÊN

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2012

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

Fusarium solani GÂY RA TRÊN CÂY CÓ MÚI

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Tác giả:

PHÙNG THỊ LIÊN

Khóa lu ận được đệ trình để hoàn thành yêu cầu

c ấp bằng kỹ sư nông nghiệp ngành Nông học

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:

TS Võ Thị Thu Oanh

KS Nguyễn Ngọc Anh Thư

TP Hồ Chí Minh, tháng 07/2012

L ỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ

Thị Thu Oanh, KS Nguyễn Ngọc Anh Thư người đã tận tâm hướng dẫn, luôn động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và ban chủ nhiệm khoa Nông học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và trao dồi kiến thức

Ban Lãnh Đạo Viện, Bộ môn Bảo vệ thực vật Viện Cây ăn quả miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Quý thầy cô khoa Nông học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em vốn kiến

thức quý báu trong quá trình học tập

Các anh chị làm việc tại Bộ môn Bảo vệ thực vật Viện Cây ăn quả miền Nam đã nhiệt tình chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Các bạn làm chung đề tài tại Viện cây ăn quả miền Nam đã luôn bên cạnh quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình

Các bạn trong và ngoài lớp đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và

thực hiện đề tài

Thành ph ố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện Phùng Thị Liên

TÓM T ẮT

Phùng Thị Liên, khoa Nông Học – Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Tháng 7 năm 2012

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VÀ ĐÁNH GIÁ

KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU BỆNH THỐI RỄ DO NẤM Fusarium solani GÂY

RA TRÊN CÂY CÓ MÚI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Giảng viên hướng dẫn: TS Võ Thị Thu Oanh

KS Nguyễn Ngọc Anh Thư

Mục tiêu đề tài nhằm tìm ra dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm

Fusarium solani và tìm ra g ốc ghép có khả năng chống chịu tốt với nấm Fusarium

solani gây bệnh vàng lá thối rễ trên các cây có múi

Đề tài có 4 thí nghiệm:

Thí nghi ệm 1: Khảo sát khả năng đối kháng của 12 dòng vi khuẩn đối kháng

đối với nấm Fusarium solani trong điều kiện in-vitro Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, 13 NT, 12 NT tương ứng với 12 dòng vi khuẩn và 1 NT đối chứng, 5 LLL

Kết quả cho thấy dòng vi khuẩn Bacillus subtilis AĐ có khả năng đối kháng cao

nhất với nấm Fusarium solani, kế đến là 2 dòng vi khuẩn Pseudomonas 2 và 141-2

Thí nghiệm 2: Khảo sát tính độc của 4 chủng vi khuẩn: Pseudomonas 2, 141-2,

Pseudomonas fluorescens N, Bacillus subtilis AĐ trên gốc ghép chanh Volka trong

điều kiện nhà lưới Thí nghiệm bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 NT tương ứng với 4 dòng vi khuẩn và 1 NT đối chứng, 4 LLL

Kết quả 45 NSC cho thấy các dòng vi khuẩn Pseudomonas 2, Bacillus subtilis

AĐ, Pseudomonas fluorescens N có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của cây

chanh Volka

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium

solani gây ra trong điều kiện in-vitro trên 11 số giống cây có múi: chanh Volka, bưởi Thúng, bưởi Bung, bưởi Trấp, bưởi Lông Cổ Cò, bưởi 5 Dù, bưởi Tứ quý, Bưởi Bánh

Xe, cam Mật, chanh Tàu và bưởi Đường Da Láng Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên, 11 NT, 3 LLL

Kết quả cho thấy tất cả các giống cây có múi đều bị nhiễm nấm Fusarium

solani Trong đó các giống mẫn cảm là cam Mật, chanh Tàu, chanh Volka, các giống

có khả năng chống chịu tốt là bưởi Lông Cổ Cò, bưởi Bánh Xe và bưởi Bung

Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium

solani gây ra trong điều kiện nhà lưới trên 6 giống cây có múi: chanh Volka, bưởi Thúng, bưởi Lông Cổ Cò, bưởi 5 Dù, bưởi Tứ Quý, Bưởi Bánh Xe Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 NT, 3 LLL

Kết quả 120 NSC cho thấy tất cả các giống đều bị nhiễm nấm Fusarium solani

Trong đó bưởi Thúng có khả năng chống chịu tốt nhất, kế đến là bưởi Tứ Quý và bưởi Lông Cổ Cò

M ỤC LỤC

TRANG TỰA i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Giới hạn đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan tình hình phát triển cây ăn quả và cây có múi tại Đồng bằng sông Cửu Long 3

2.2 Khái quát bệnh thối rễ trên cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 4

2.2.1 Triệu chứng 4

2.2.2 Tác nhân gây bệnh thối rễ 4

2.2.3 Điều kiện phát sinh và phát triển 5

2.2.4 Biện pháp phòng trừ bệnh vàng lá thối rễ cây có múi 6

2.3 Sơ lược về nấm Fusarium sp 11

2.3.1 Vị trí phân loại 11

2.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái 11

2.3.3 Sự phân bố 12

2.3.4 Phổ ký chủ 12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 13 3.3 Vật liệu nghiên cứu 13 3.4 Phương pháp nghiên cứu 14 3.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng đối với nấm

Fusarium solani trong điều kiện in-vitro 14 3.4.2 Khảo sát tính độc của các chủng vi khuẩn đối kháng (được chọn ở thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng với nấm

Fusarium solani trong điều kiện in-vitro) trên gốc ghép chanh Volka trong điều kiện nhà lưới 16

3.4.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra trên một số giống trong điều kiện in-vitro 17 3.4.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống trong điều kiện nhà lưới 18 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 20 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng đối với nấm

Fusarium solani trong điều kiện in-vitro 21

4.2 Khảo sát tính độc của các chủng vi khuẩn đối kháng đối với nấm Fusarium solani trên gốc ghép chanh Volka trong điều kiện nhà lưới 27

4.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống cây cây có múi trong điều kiện in-vitro 30 4.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống trong điều kiện nhà lưới 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 PHỤ LỤC 46

B.amyloliquefaciens : Bacillus amyloliquefaciens

B.subtilis : Bacillus subtilis

B subtilis AĐ : Bacillus subtilis AĐ

Fusarium solani : Fusarium solani

P fluorescens : Pseudomonas fluorescens

P.fluorescens N : Pseudomonas fluorescens N

T hazinum : Trichoderma hazinum

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nấm Fusarium solani 25

Hình 4.2 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nấm Fusarium solani ở 7

ngày sau chủng 26

Hình 4.3 Cây chanh Volka ở thời điểm 45 ngày sau khi chủng các dòng vi khuẩn 29

Hình 4.4 Cây chanh Volka ở thời điểm 45 ngày sau khi chủng các dòng vi khuẩn 30

Hình 4.5 Khả năng đối kháng của các giống cây có múi sau khi chủng nấm Fsarium

solani tại các thời điểm 35

Hình 4.6 Các giống CCM ở thời điểm 4 tháng sau chủng nấm Fusarium solani trong

điều kiện nhà lưới 39

Hình 4.7 Các giống CCM ở thời điểm 4 tháng sau chủng nấm Fusarium solani trong

điều kiện nhà lưới 40

Hình 7.1 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nấm

Fusarium solani 47

Hình 7.2 Thí nghiệm đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium

solani gây ra trong điều kiện in-vitro 49

Hình 7.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của 6 giống cây có múi đối với

nấm Fusarium solani trong nhà lưới 50

Hình 7.4 Toàn cảnh thí nghiệm khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn đối kháng

nấm Fusarium solani trong điều kiện nhà lưới 51

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 3.1 Các dòng vi khuẩn tham gia thí nghiệm 15 Bảng 4.1 Bán kính vòng vô khuẩn (mm) của các chủng vi khuẩn khi chủng với nấm

Fusarium solani ở các thời điểm khảo sát 22

Bảng 4.2 Hiệu suất đối kháng (%) của các chủng vi khuẩn khi chủng với nấm Fusarium

solani ở các thời điểm khảo sát 23

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đối kháng nấm Fusarium solani đến sinh

trưởng của cây chanh Volka trong nhà lưới 27

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đối kháng nấm Fusarium solani đến tỷ lệ

rễ thối và tỷ lệ rễ mới của cây chanh Volka trong điều kiện nhà lưới 28

Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh của 11 giống CCM ở các thời điểm sau khi chủng nấm Fusarium

solani trong điều kiện in-vitro 31

Bảng 4.6 Chỉ số bệnh của 11 giống CCM đối với nấm Fusarium solani ở các thời

điểm sau khi chủng trong điều kiện in-vitro 33

Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh trên lá của 6 giống CCM sau khi chủng nấm Fusarium solani ở

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Phát huy lợi thế về khí hậu, thổ nhưỡng ở một nước nhiệt đới, các tỉnh tại Việt Nam đã hình thành các vùng nguyên liệu trái cây khá tập trung phục vụ cho chế biến công nghiệp và tiêu dùng Đặc biệt là vùng Đồng bằng Sông Cửu Long có diện tích

trồng cây ăn trái lớn nhất Số lượng giống cây ăn trái này được lưu thông khắp cả nước

kể cả sang một số nước láng giềng

Cây có múi được trồng phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long với nhiều chủng

loại phong phú, đa dạng, và nổi tiếng như: cam Sành, bưởi Năm Roi, bưởi Da xanh tương ứng với nhiều vùng sản xuất nổi tiếng như: bưởi Da Xanh ở Bến Tre, quýt Tiều ở Lai Vung – Đồng Tháp, bưởi Năm Roi ở Phú Hữu – Châu Thành – Hậu Giang và Bình Minh - Vĩnh Long Chúng trở thành một trong những loại cây ăn quả chủ lực tại đây, mang lại cho nhà vườn một nguồn lợi lớn

Hiện nay ngoài những yếu tố thuận lợi cho sự phát triển cây có múi thì các nhà vườn đang gặp các khó khăn như sự suy thoái vườn cây, dịch bệnh tấn công và một số nguyên nhân khác đã khiến cho không ít nhà vườn điêu đứng, trong đó bệnh vàng lá, thối rễ đang bộc phát mạnh

Biện pháp phòng trị bệnh chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học có hiệu quả không cao, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường Trong khi đó ứng dụng vi khuẩn đối kháng và gốc ghép chống chịu vào phòng trừ bệnh đem lại hiệu quả tích cực đối với nông nghiệp, ưu việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học, đồng thời mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu

tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đề tài “ Đánh giá hiệu quả sử dụng vi

khuẩn đối kháng và đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra trên cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long” được tiến hành

1.2 M ục đích

Tìm ra dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani gây

bệnh vàng lá thối rễ trên các cây có múi

Tìm ra gốc ghép có khả năng chống chịu tốt với nấm Fusarium solani gây bệnh

vàng lá thối rễ trên các cây có múi

1.3 Yêu c ầu

Đánh giá các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani

gây ra bệnh vàng lá thối rễ trên các cây có múi

Đánh giá tính chống chịu bệnh thối rễ của một số gốc ghép CCM

1.4 Gi ới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2012

Khảo sát trên 11 dòng vi khuẩn đã phân lập sẵn và dòng nấm Fusarium solani

được cung cấp bởi bộ môn BVTV – Viện Cây ăn quả miền Nam

Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ được thực hiện trên bưởi Lông Cổ

cò, cam Mật, bưởi Thúng, bưởi Bung, bưởi Tứ quý, bưởi Đường da láng, bưởi Trấp, bưởi bánh xe, bưởi Đỏ, chanh Tàu và chanh Volka

Thí nghiệm thực hiện trong điều kiện in-vitro và nhà lưới

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình phát triển cây ăn quả và cây có múi tại Đồng bằng sông Cửu Long

Theo Tổng cục Thống Kê (Việt Nam) diện tích cây ăn quả cả nước năm 2009 đạt 774.000 ha, chiếm 8,06 % tổng diện tích đất sản xuất nông nghiệp và chiếm 23,34

% diện tích đất trồng cây lâu năm của cả nước Diện tích cây ăn quả có xu hướng tăng qua các năm từ 1985 đến 2011, trong khoảng thời gian từ 2000 đến 2005 diện tích trồng cây ăn quả tăng gấp 3,83 lần

Về cơ cấu trồng cây ăn quả: đến năm 2009, 10 loại cây ăn quả có diện tích lớn

nhất là 518.000 ha, chiếm 73,9 % so với tổng diện tích trồng cây ăn quả, trong đó cây

ăn quả có diện tích lớn nhất là cây có múi 139.400 ha

Theo Vụ Kế Hoạch - Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn: sản lượng cả nước trong năm 2009 ước đạt 7 triệu tấn, tăng 2,5 triệu tấn so với năm 2000 Cao nhất

là chuối: 1.511.300 tấn (21,5 %), nhãn 607.700 tấn (8,6 %), xoài 537.900 tấn (7,68 %), bưởi 389.400 (5,56 %)…

Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp Và Phát triển Nông thôn sản lượng cây ăn quả cả nước năm 2011: cam quýt đạt hơn 700 nghìn tấn, bằng xấp xỉ năm trước; sản lượng chuối đạt 1,67 triệu tấn, tăng 2 %; xoài đạt 595,8 nghìn tấn, tăng 2,7 %; nhãn đạt 616,4 nghìn tấn, tăng 7,4 %

2.2 Khái quát bệnh thối rễ trên cây có múi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

2.2.1 Triệu chứng

Theo Nguyễn Thị Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh (2002), bệnh gây hại ở cổ rễ

và giáp mặt đất Trên rễ lúc đầu là một chấm nhỏ màu nâu sau chuyển sang nâu đen và lan rộng bao quanh phần vỏ cổ rễ, vỏ bị thối khô, nứt và bong tróc ra để trơ phần gỗ phía trong Nấm có thể ăn sâu vào thân làm thân bị khô đen, các rễ phía dưới cũng bị

thối đen Cây bị bệnh lá vẫn lớn bình thường, nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá

ngả màu vàng xanh, và sau đó rụng đi, các lá già rụng trước sau đó dẫn đến các lá trên Nhìn vào cây thấy gốc trơ trụi chỉ còn lại lá đọt Lúc đầu chỉ một vài nhánh biểu hiện vàng lá rụng lá, nhưng sau đó hoàn toàn cây sẽ bị rụng lá Cây cho nhiều chồi ngắn, lá

nhỏ, nhiều hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn Đào rễ lên thấy phía cành bị

rụng lá thấy rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần vào rễ lớn Bệnh

nặng tất cả các rễ cây đều bị thối và cây chết

2.2.2 Tác nhân gây bệnh thối rễ

Phạm Văn Kim (1997) đã thực hiện thành công việc chứng minh tác nhân gây

bệnh vàng lá thối rễ của cam mật (Citrus cinensis) và quýt tiều (C reculata) qua các bước thực hiện qui trình Kock và đã công bố tác nhân gây bệnh này là nấm Fusarium

solani

Lê Thị Thu Hồng và ctv (2002) đã nghiên cứu bệnh vàng lá chết nhanh trên cây quít Tiều tại Lai Vung, Đồng Tháp và cũng kết luận là bệnh này do nhiều tác nhân gồm

Fusarium, Pythium, Phytophthora và tuyến trùng gây ra, trong đó sự tương tác giữa

nấm Fusarium và tuyến trùng là quan trọng nhất

Nguyễn Ngọc Anh Thư và ctv (2011) đã kiểm chứng tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cành giâm chanh volka trong điều kiện nhà lưới cho thấy bệnh vàng lá thối

rễ trên cây có múi xảy ra không chỉ do một tác nhân mà là tác nhân cộng gộp, chỉ hiện

diện một nấm Fusarium solani hoặc Phytophthora palmivora thì không gây bệnh vàng

lá thối rễ nặng mà bệnh vàng lá xảy ra khi có sự xuất hiện cùng lúc 2 tác nhân hay do

cây trong tình trạng ngập nước và có sự hiện diện của nấm Fusarium solani

Đây là hiện tượng tương đối phức tạp trên cây có múi, vì ngoài những tác nhân

trên thì có nhiều yếu tố khác có thể tác động và tạo cộng hưởng thêm cho sự thiệt hại, trong đó phải kể đến là đất trồng qua nhiều năm không được cung cấp phân hữu cơ, dẫn đến hiện tượng đất thiếu một số nguyên tố vi lượng trầm trọng Bên cạnh đó, bệnh vàng

lá Greening hầu như hiện diện khắp nơi làm cây càng suy yếu hơn và dễ mẫn cảm với bệnh Do việc canh tác, tạo vụ nghịch làm hư bộ rễ sau đó nấm bệnh tấn công vào

2.2.3 Điều kiện phát sinh và phát triển

Bệnh có thể xảy ra quanh năm nhưng lẻ tẻ, không đáng kể Bệnh thường phát triển thành dịch vào đầu mùa nắng, tháng 11 - 12 hàng năm Cây chết hàng loạt vào tháng 1 đến tháng 4 và có thể tiếp tục kéo dài trong mùa mưa năm sau

Với vườn mới lên líp trồng cây có múi, cây bắt đầu chết vì bệnh thối rễ từ năm thứ năm cho đến năm thứ bảy trở về sau, tuỳ cách canh tác của từng vườn Với các vườn đã lên líp lâu năm và được tạo lại để trồng cây có múi (quít hoặc cam) thì cây trồng bắt đầu thối rễ và chết cây vào sau vụ thu hoạch trái thứ hai và cây chết nhiều sau vụ thu hoạch trái thứ ba và thứ tư

Khi trồng cây có múi theo lối trồng ba hàng trên mỗi líp thì hàng giữa bị bệnh và chết trước hai hàng bên Các vườn cây bệnh và chết đều là những vườn không được bón phân hữu cơ mà chỉ được bón phân hoá học Gần như các vườn đều không được bón vôi

Điều kiện đất và nước rất đặc trưng cho vùng ĐBSCL giữ vai trò rất quan trọng đối với bệnh thối rễ cây ăn trái Đất có thành phần sét cao trong sa cấu tạo ra tình trạng

tế khổng trong đất rất nhỏ, làm cho đất khó thoát nước sau các đợt mưa dài ngày vào giữa và cuối mùa mưa Đất bị nước chiếm các tế khổng lâu dài nên rơi vào tình trạng yếm khí do oi nước Tình trạng này kéo dài làm cho rễ cây trồng cạn phải hô hấp yếm khí lâu dài, các chất độc do các tiến trình sinh hóa trong tế bào rễ sinh ra, không được oxít hoá để giải độc, tích luỹ trong tế bào và gây ngộ độc cho tế bào Từ đó các tế bào ở phần rễ non, nơi các tiến trình sinh hóa xảy ra mạnh nhất, sẽ bị chết dần từng tế bào và

tạo ra các mảng thối của rễ non Nấm Fusarium solani có sẳn ngoài đất, có cơ hội xâm

nhập vào rễ thông qua các vết thối này và bắt đầu tấn công dần phần rễ này Kể từ khi bắt đầu xâm nhập cho đến khi triệu chứng bệnh thể hiện cần có thời gian ủ bệnh vài tháng, do đó ở các vườn, bệnh không xuất hiện ngay mùa mưa, lúc đất bị oi nước, mà bệnh thường xuất hiện nghiêm trọng trong đầu mùa nắng

(Theo Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre, 2008)

2.2.4 Biện pháp phòng trừ bệnh vàng lá thối rễ cây có múi

Biện pháp canh tác :

Thực hiện giống như những biện pháp đối với bệnh khác là sử dụng cây giống

sạch bệnh, có hàng cây chắn gió, lên liếp cao, có rảnh thoát nước tốt, có bờ bao để ngăn

lũ, thoát úng

Nên rải vôi trước khi trồng để loại trừ mầm bệnh có trong đất Hàng năm nên cung cấp thêm vôi xung quanh gốc, quét vôi vào gốc cây trên 50cm vào cuối mùa nắng

Bón nhiều phân hữu cơ để cải thiện đặc tính đất kết hợp với cung cấp nấm đối

kháng Trichoderma, tăng cường hoạt động của các vi sinh vật trong đất

Thăm vườn thường xuyên để phát hiện bệnh sớm, cắt bỏ những cành bị vàng, rễ theo hình đối chiếu

(Theo Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre , 2008)

Xới nhẹ xung quanh gốc và tưới thuốc Ridomyl Gold hoặc Acrobat khi có bệnh xuất hiện và chỉ sử dụng Trichoderma sau khi xử lý thuốc 15 - 20 ngày

Rải thuốc trừ tuyến trùng xung quanh rễ (sử dụng Regent 0.3 G)

(Theo Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bến Tre, 2008)

Biện pháp giống kháng

Graham (1990) đã nghiên cứu sử dụng gốc ghép kháng nấm Phytopthora

nicotianae gây bệnh thối rễ cho thấy nhóm gốc ghép như cam chua, cam pineapple, quýt Cleopatra và Carrizo citrange có khả năng chống chịu bệnh nhưng không bằng khả năng chống chịu bệnh của gốc ghép thuộc nhóm Trifoliate orange và Swingle citromelo

Timmer và ctv, 1991 tiến hành thử nghiệm gốc ghép ngoài đồng ở Avon Park và

St Cloud cho thấy mật số của nấm cao nhất trên Palestine sweet lime, cam ngọt và chanh volka, thấp hơn ở quýt Cleopatra và thấp nhất ở 2 giống Trifoliate orange và Swingle citromelo

Theo Labuschange và ctv (1996) giống gốc ghép như Carrizo có khả năng

chống chịu tốt với bệnh do thối rễ do nấm Fusarium gây ra

Nguyễn Ngọc Anh Thư và ctv (2006) tiến hành thử một số gốc ghép phòng trừ

bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi trong điều kiện đĩa petri và ly nhựa cho kết quả

giống cây có múi có khả năng chống chịu tốt với nấm Fusarium solani là chanh Tàu,

bưởi Đỏ, Citromelo, Carry

Năm 2010, Nguyễn Thị Hằng đã báo cáo rằng các giống bưởi Lông Cổ Cò, bưởi Bánh Xe có khả năng chống chịu tốt với nấm Fusarium solani trong điều kiện in-vitro

Bi ện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh

Một số vi sinh vật có tính đối kháng với các nấm gây bệnh thối rễ trên cây trồng

có thể kể đến là các chủng vi khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, xạ khuẩn

Streptomyces, n ấm Trichoderma,

Theo Pal và ctv (2006) hiệu quả phòng trừ sinh học bằng vi sinh vật là kết quả

có lợi do nhiều dạng tương tác khác nhau giữa các vi sinh vật, trong đó tác nhân gây

bệnh bị ức chế do sự hiện diện và hoạt động của các vi sinh vật là tác nhân phòng trừ sinh học, theo một hoặc nhiều cơ chế khác nhau :

+ Đối kháng trực tiếp : cơ chế siêu kí sinh, ăn mồi

+ Đối kháng phối hợp : cơ chế tiết kháng sinh, tạo men phân giải, sản phẩm thải

biến dưỡng hoặc ngăn cản về mặt lý/ hóa học

+ Đối kháng gián tiếp : cơ chế cạnh tranh, kích kháng cây chủ

- Baccilus spp

Lemessa (2006) cho rằng nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sản

xuất chất chuyển hóa thứ sinh như chất kháng sinh, hợp chất bay hơi và không bay hơi

và enzyme thủy phân Một vài chất kháng sinh được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus

spp như: bacilomycin, myconbacillin, iturin A, surfacing, mycosubtilin, fugistatin, subsporin, bacilysin, chlorotetetain,…

Vi khuẩn Bacillus amyliquefaciens IN937; Bacillus pumilis INR7, SE34;

Bacillus subtilis GB03 và Bacillus cereus C4 được thử nghiệm trên cây cà chua và ớt trong điều kiện ngoài đồng cho thấy sự gia tăng đáng kể về đường kính thân, diện tích

của thân, diện tích bề mặt lá, trọng lượng rễ, cành và số lá, cải thiện sức khỏe của cây ghép và gia tăng sản lượng trái, tuy nhiên mầm bệnh và bệnh không giảm ở cà chua và

ớt (Lucy, 2004)

He và ctv (2002) thì nghiên cứu có kết quả rằng 2 chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis BS1 và Bacillus subtilis BS2 được phân lập từ lá, thân ớt không chỉ ức chế sự phát triển của sợi nấm mà còn ngăn chặn sự phát triển của bệnh thán thư từ 57,34%-94,08% do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra

Kim và ctv (2003) đã nghiên cứu khả năng đối kháng của 2 chủng Bacillus

subtilis GB-0365 và Bacillus sp GB-017 v ới các chủng nấm gây bệnh như: Botritys

cinerea, Fusarium sp., Pythium sp., Colletotrichum gloeosporioides,…kết quả cho thấy

2 chủng vi khuẩn đều có khả năng đối kháng với các nấm gây bệnh trên

- Pseudomonas spp

Ở Thái Lan, thành công của việc sử dụng vi khuẩn đối kháng với nấm

Rhizoctonia solani, gây bệnh đốm vằn trên lúa đã được ghi nhận Ruộng lúa được phun

vi khuẩn đối kháng Pseudomonas spp và Bacillus spp 3 lần trong mỗi vụ Vi khuẩn đối kháng ức chế sự tạo hạch nấm của Rhizoctonia solani Sau 5 vụ phun vi khuẩn đối

kháng liên tục, bệnh giảm một cách đáng kể và giúp tăng năng suất so với đối chứng

mà không cần đến thuốc trừ bệnh đốm vằn (Phạm Văn Kim, 2000)

Chi vi khuẩn Pseudomonas sống ở vùng rễ bao gồm Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia và Pseudomonas aureofacien,… có tác

dụng phòng trị hầu hết các tác nhân gây bệnh trong đất như nấm Pythium,

Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia và Gaeumannomyces Khi áp dụng trên hạt giống

và tưới rễ thì giúp hạn chế được bệnh chết héo cây, thúi nhũn đồng thời giúp cây tăng trưởng và tăng năng suất trong các mùa trồng (Agrios, 1997)

Pseudomonas fluorescens có th ể ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Phytopthora

capsici gây b ệnh thối rễ ở tiêu đến 72% Các chất kháng sinh do Pseudomonas

fluorescens ti ết ra còn có tác dụng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Phytophthora

capsici đến 90% (Paul và Sarma, 2006)

- Streptomyces spp

Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm

tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Các loài Streptomyces và một số xạ khuẩn khác

cho thấy có thể bảo vệ nhiều loại cây trồng tránh khỏi nhiều loại nấm đất gây bệnh, cả đối với các thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng (Tahvonen, 1982)

Theo Blaak và ctv (1993) thì các loài Streptomyces spp có thể kí sinh hoặc tấn công các nấm gây thối rễ như Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora,

Phytomatotricum, Aphanomyces, Scelerotinia, Verticillium,….Dịch rễ cây có thể kích thích sự tăng trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khống chế nấm bệnh, trong đó xạ

khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp chất kháng nấm Có trên 50

loại kháng sinh phổ biến khác nhau được ly trích từ các loài xạ khuẩn Streptomyces,

trong đó phải kể đến là Streptomycin, Neomycin, Chloramphenicol và Tetracyclines Ngoài ra xạ khuẩn còn tổng hợp nhiều loại men phân giải như chitinases, glucanases, peroxidases và những men phân giải khác có thể phân hủy nấm hại

Đặng Thị Kim Uyên và ctv (2010) đã tiến hành khảo sát hiệu quả của xạ khuẩn

Streptomyces sp ch ủng SOFRI 1 đối với bệnh do nấm Fusarium solani trên cây chanh Volka (Citrus volkariana) cho k ết luận Streptomyces- SOFRI 1 không chỉ có tác dụng

tốt trong việc khống chế nấm Fusarium solani phát triển và gây bệnh trên cây chanh

mà còn có tác dụng kích thích khả năng nảy mầm và phát triển của cây chanh Volka, thích hợp cho việc sử dụng chúng như một vi sinh vật đối kháng trong việc quản lý

bệnh thối rễ do Fusarium solani gây ra

- Trichoderma spp

Phạm Văn Kim và ctv (2004) đã tìm ra 5 dòng nấm Trichoderma spp triển vọng

phân lập từ các vườn cam quýt tại Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ đều có khả năng

khống chể sự phát triển của nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cam quýt trong điều

kiện pH thấp (3,9-4,2) ở ĐBSCL Hiệu quả trị bệnh càng cao khi đất vườn được cung

cấp đầy đủ hữu cơ từ nguồn bã thực vật trong vườn (10-15 kg/ cây trưởng thành) để các dòng nấm đối kháng hoạt động hữu hiệu Việc cung cấp thêm dinh dưỡng (NPK với tỉ

lệ 1:3:2 và Ca cho các vườn lên liếp trên 10 năm) cũng góp phần rút ngắn thời gian tái

phục hồi rễ của cam quýt bị bệnh

Theo Dương Minh (2010) nghiên cứu sử dụng sản phẩm Tricô-ĐHCT trên 11 ha cam sành tại huyện Tam Bình và 8,5 ha cam sành tại Trà Ôn - Vĩnh Long đã giúp nhà vườn phục hồi 60-70 % rễ tùy theo điều kiện canh tác, cây cho năng suất ổn định, đạt

chất lượng và phẩm chất tốt

Trần Hoàng Linh (2011) tiến hành nghiên cứu đánh giá khả năng đối kháng của một số vi sinh vật có ích đối với tác nhân gây bệnh thối rễ vú sữa trong điều kiện in-vitro cho kết quả các dòng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các tác

nhân gây bệnh thối rễ cụ thể: Dòng nấm T hazinum 4 có hiệu suất đối kháng với nấm

Fusarium solani, dòng n ấm T hazinum 5, T hazinum 6, T putida có khả năng đối kháng

tốt với nấm F oxysporum, dòng nấm T hazinum 4 và T hazinum 6 có hiệu suất đối

kháng cao với nấm P splendens

2.3 Sơ lược về nấm Fusarium sp

Loài : Fusarium solani (Mart)

2.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái

Nấm Fusarium là loại nấm sống trong đất, có thể tồn tại dưới dạng bào tử hậu,

bào tử hậu có hình tròn, là các bào tử một tế bào với vách dày và có sức chống chịu

cao Tác nhân Fusarium gây bệnh thối rễ có thể có trong rễ các cây không phải ký chủ,

kể cả cây cỏ dại và cây trồng ( CABI, 2003)

Theo Vũ Triệu Mân, 2008, nấm Fusarium solani có sợi nấm đa bào, có vách

ngăn, tản nấm màu trắng đến vàng kem, phớt hồng Bào tử phân sinh có 2 dạng: bào tử

lớn đa bào, có 3-5 vách ngăn, kích thướt trung bình là 29,4 x 3,9 µm, hình cong lưỡi

liềm và bào tử nhỏ đơn bào, kích thướt trung bình là 18,1 x 4,0 µm, hình trứng, bầu dục dài hoặc hình quả thận Ngoài ra nấm còn sinh ra bào tử hậu hình cầu, màng dày, màu nâu nhạt

A B C

Hình 2.1 Loài Fusarium solani: A: Đại bào tử; B: Tiểu bào tử; C: Hậu bào tử

2.3.3 Sự phân bố

Theo Bùi Xuân Đồng (1986), thì nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới,

Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nước như Australia, Panama, Mỹ, Philippines, Đài Loan và các nước Đông Nam Á

2 3.4 Phổ ký chủ

Fusarium có nhiều loài khác nhau nên khả năng ký chủ rất rộng trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: cây ăn quả, cây rau màu và một số cây trồng khác và có thể sống trong đất một thời gian dài, trong xác bã thực vật dưới nhiều dạng khác nhau, bào

tử nấm có thể tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài, sau đó gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ phát triển và lây lan (Bùi Xuân Đồng, 1986)

Nấm Fusarium solani tấn công và gây hại nặng trong điều kiện cây bị stress

Bệnh thối rễ (do nấm Fusarium solani) sẽ nặng hơn trong điều kiện ngập nước, bón

nhiều phân urê, tinh bột dự trữ trong rễ giảm và có sự hiện diện của tuyến trùng

Tylentchulus sp (Labuschagne và ctv.,1996)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2012 đến tháng 6/2012

Địa điểm: Phòng thí nghiệm và nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, Viện Cây ăn

quả miền Nam

3.2 N ội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng đối với Fusarium

solani trong điều kiện in-vitro

Đánh gía tính độc của các chủng vi khuẩn đối kháng (được chọn ở thí nghiệm

khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng với nấm Fusarium solani

trong điều kiện in-vitro) trên gốc ghép chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani trên một số

giống cây có múi trong điều kiện in-vitro

Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani trên một số

giống cây có múi trong điều kiện nhà lưới

3.3 Vật liệu nghiên cứu

Petri, ống nghiệm, micropippet, lam đếm bào tử Thoma, nước cất khử trùng, bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, bông gòn không thấm nước, bông gòn thấm nước,

ống chích y tế, viết, thước, sổ theo dõi thí nghiệm, hộp nhựa, hạt chanh Volka, hỗn hợp đất, cây cam sành, chậu nhựa K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaOCl2, v.v

Tủ cấy vi sinh, tủ lạnh dùng trữ mẫu, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng, máy xay sinh tố, cân 4 số, cân điện tử, máy đo pH, kính hiển vi soi nổi, kính hiểm vi huỳnh quang, kính hiển vi cho ảnh ngược, máy đếm khuẩn, lò vi ba, cân bàn, máy nước cất, tủ điều chỉnh nhiệt độ ẩm độ, cân kỹ thuật 2 số lẻ

Môi trường sử dụng:

Môi trường WA

Môi trường MS

Môi trường NA

Môi trường PDA

Môi trường King’B

Nguồn vi sinh vật:

Dòng nấm Fusarium solani được Bộ Môn BVTV, Viện Cây ăn quả miền Nam

phân lập và tồn trữ

Các dòng nấm Pseudomonas sp và Bacillus sp

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng đối với nấm

Fusarium solani trong điều kiện in-vitro

Phương pháp: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 12 nghiệm

thức, với mỗi một dòng vi khuẩn đối kháng là 1 nghiệm thức và 1 nghiệm thức đối chứng, 5 LLL, 1 đĩa petri/ NT/LLL

Bảng 3.1 Định danh các dòng vi khuẩn tham gia thí nghiệm

8 B.amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens

9 B.subtilis Bacillus subtilis

10 141-2 Chưa định danh

11 P.fluorescens N Pseudomonas fluorescens N

12 B subtilis AĐ Bacillus subtilis AĐ

Chuẩn bị nguồn nấm và vi khuẩn:

Nấm Fusarium solani được nuôi trên đĩa petri có chứa 10ml môi trường PDA ở

10 ngày sau cấy

Vi khuẩn được nhân mật số trên môi trường King’B ở 48 giờ

Các bước tiến hành:

Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa petri trên môi trường NA, với 2 điểm xung quanh cách tâm 2,5 cm là 2 khoanh giấy thấm có đường kính 5 mm thấm huyền phù vi

khuẩn; ở giữa là khoanh khuẩn ty nấm Fusarium solani có đường kính 5 mm

Các đĩa lưu trữ trong điều kiện vô trùng và nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi:

Đo bán kính vòng vô khuẩn và tính hiệu suất đối kháng theo công thức Abott ở

4, 5, 6 và 7 ngày sau cấy

AE(%) = [(C – T)/C]*100

Trong đó : AE (antagonistic efficacy): hiệu suất đối kháng

C: bán kính khuẩn lạc của nấm Fusarium solani tương ứng ở nghiệm

Phương pháp: Thí nghiệm bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 NT, 4 LLL, 9

cây/NT/LLL Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt là đối chứng, Pseudomonas 2, 141-2,

P.fluorescens N, B.subtili s AĐ

Chuẩn bị đất: Hỗn hợp đất gồm đất sét đập nhuyễn và cát với tỷ lệ 2:1 được

thanh trùng 2 lần và cho vào chậu nhựa, tưới nước vừa ẩm

Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Vi khuẩn được nhân sinh khối trên môi trường KB

ở 36 giờ Lấy 1 ml ở mỗi chủng vi khuẩn đem pha và kiểm tra mật số, xử lý 50 ml trên mỗi chậu ở mật số 106

Chỉ tiêu theo dõi:

Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng bằng phương

pháp đếm số cây có thể hiện triệu chứng bệnh ở 7, 14, 21, 28, 35, 42 ngày sau chủng

Tỷ lệ bệnh chết = (Số cây chết /Tổng số cây quan sát)*100

Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đối kháng đến sự sinh trưởng và

phát triển của cây:

Đo chiều cao cây và chiều dài rễ ở 42 ngày sau chủng

Cân trọng lượng của thân rễ ở 42 ngày sau chủng

Tỷ lệ rễ bị thối và tỷ lệ rễ mới ở 42 ngày sau chủng

3.4.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống trong điều kiện in-vitro

Phương pháp

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 11 NT, 3 LLL, 6 cây/NT/LLL

Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lần lượt là các giống: chanh Volka,

bưởi Thúng, bưởi Bung, bưởi Trấp, bưởi Lông Cổ Cò, bưởi 5 Dù, bưởi Tứ quý, Bưởi

Bánh Xe, cam Mật, chanh Tàu và bưởi Đường Da Láng

Chuẩn bị và cách thực hiện

Nấm được cấy trên môi trường PDA 10 ngày tuổi

Hạt giống được bóc vỏ, khử trùng bề mặt hạt bằng dung dịch Canxi hypocloride

10% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi đặt hạt lên giấy thấm vô

trùng để hạt khô tự nhiên Sau đó đặt trong đĩa chứa môi trường WA để hạt nảy mầm

Khi hạt nảy mầm, lấy 4 hạt cho vào chai có thể tích 500ml có chứa môi trường MS đã

được chuẩn bị sẳn, khi cây có 2 lá mầm ta tiến hành chủng nấm vào Dùng khoan đục

những khoanh nấm có đường kính 5 mm bằng nhau đặt giữa chai

Chỉ tiêu theo dõi:

Theo dõi tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%) rên rễ ở 7, 10, 15, 20, 25, 30 NSC

Tỷ lệ bệnh (%) = (Số cây bị bệnh/Tổng số cây quan sát)*100

Chỉ số bệnh theo công thức Townsend – Heuberger :

Chỉ số bệnh (%) = [ ∑ ( a x b)x 100] / (N x T) Trong đó:

a: Số lượng cây bị bệnh b: Trị số cấp bệnh của mỗi cấp tương ứng

∑ ( a x b): Tổng số của các tích a x b T: Tổng số cây điều tra

N: Trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp

Cấp bệnh của các dòng nấm được đánh giá theo thang của Carling et al (1999)

Cấp 4: Cây chết hoặc lá héo, cây ngã gục

3.4.4 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống trong điều kiện nhà lưới

Phương pháp:

Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, thực hiện trên 6 giống cây có

múi, 3 LLL, 6 cây/NT/LLL

Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6 lần lượt là các giống: chanh Volka, bưởi Thúng,

bưởi Lông Cổ Cò, bưởi 5 Dù, bưởi Tứ Quý, Bưởi Bánh Xe

Chuẩn bị và cách thực hiện:

Nấm Fusarium solani được nuôi trên đĩa petri có chứa 10ml môi trường PDA ở

15 ngày sau cấy, chủng 40 ml dung dịch bào tử với mật số 106

bt/ml/chậu/lần chủng

Hỗn hợp đất gồm đất sét đập nhuyễn và cát với tỷ lệ 2:1 được thanh trùng 2 lần

và cho vào chậu nhựa, tưới nước vừa ẩm

Hạt được khử trùng bề mặt bằng CaOCl2 10 % trong 10 phút, cho vào khay gieo

hạt, ủ cho hạt nẩy mầm và lên cây có chiều cao 10 cm

Tiến hành chủng nấm 2 lần đối với các giống CCM:

+Lần 1: Tiến hành chủng nấm trước khi cấy cây 1 ngày

+Lần 2: Chủng ở 60 ngày sau cấy cây

Chỉ tiêu theo dõi:

• Tỷ lệ bệnh trên lá ở 60, 120 ngày sau chủng

Tỷ lệ bệnh trên lá = (Số cây bị bệnh/Tổng số cây quan sát )x100

• Tỷ lệ rễ thối (%) và chỉ số rễ thối (%) ở thời điểm 60, 120 NSC của 6 giống

CCM

Tỷ lệ rễ thối = (Số cây có rễ thối /Tổng số cây quan sát)*100

Chỉ số bệnh (%) theo công thức Townsend – Heuberger :

Chỉ số bệnh (%) = [ ∑ ( a x b)x 100] / (N x T) Trong đó:

N: Trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phân cấp

Chỉ số rễ thối được đánh giá theo phương pháp của Ahmed và ctv (2010), gồm

Số liệu được thu thập, tổng hợp bằng chương trình Microsoft Excel và phân tích thống

kê bằng phần mềm MSTATC sử dụng ANOVA1

Chương 4

4.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối kháng đối với nấm

Fusarium solani trong điều kiện in-vitro

Thí nghiệm bắt đầu khảo sát ở thời điểm 4 NSC đến 7 NSC Kết quả cho thấy

khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối với sự phát triển của nấm Fusarium

solani trong điều kiện in-vitro (đĩa petri) được thể hiện qua bảng 4.1 như sau:

Bảng 4.1 cho thấy tại thời điểm 4 NSC ở các nghiệm thức đều hình thành BKVVK đối với nấm Fusarium solani (ngoại trừ nghiệm thức 1995) Trong đó nghiệm

thức có BKVVK lớn nhất là B.subtilis AĐ (5,8 mm) khác biệt rất có ý nghĩa so với

nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức còn lại Hai nghiệm thức sử dụng vi khuẩn

Pseudomonas 2, 141-2 cũng có BKVVK và khác biệt rất có ý nghĩa so với các nghiệm

thức còn lại Các nghiệm thức còn lại có BKVVK từ thấp đến trung bình (0,8 mm – 3,0 mm)

Ở thời điểm 5 NSC tương tự 4 NSC, nghiệm thức B.subtilis AĐ vẫn có BKVVK

lớn nhất, kế đến là Pseudomonas 2, 141-2 Sự khác biệt giữa các nghiệm thức này rất

có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Cũng tại thời điểm này các nghiệm

thức Pseudomonas 1, Pseudomonas 3, B.amyloliquefaciens, B.subtilis có sự giảm nhẹ

BKVVK Trong khi đó nghiệm thức Pseudomonas 4 đã không còn BKVVK

Bảng 4.1 Bán kính vòng vô khuẩn (mm) của các chủng vi khuẩn khi chủng với nấm Fusarium

solani ở các thời điểm khảo sát

STT Nghiệm thức Bán kính vòng vô khuẩn ở các thời điểm (mm)

M ức ý nghĩa: **: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức 1 %

Ở thời điểm 6 NSC tương tự 5 NSC Cuối cùng là 7 ngày sau chủng nghiệm

thức B.subtilis AĐ (5,7 mm) vẫn có BKVVK lớn nhất, kế đến là 141-2 (4,2 mm) và

nghiệm thức Pseudomonas 2 với 3,6 mm, khác biệt rất có ý nghĩa so với các nghiệm

thức còn lại (ngoại trừ nghiệm thức 197 (3,0 mm)) Các nghiệm thức Pseudomonas 4,

1995, B subtilis tại thời điểm 7 NSC không còn BKVVK Các nghiệm thức còn lại

có BKVVK chênh lệch nhau không cao từ 2,00 mm – 2,80 mm

Tóm lại, trong 12 dòng vi khuẩn khảo sát với BKVVK có 3 dòng có khả năng

đối kháng cao với nấm Fusarium solani Trong đó dòng vi khuẩn B.subtilis AĐ có khả năng đối kháng cao nhất, kế đến là Pseudomonas 2 và 141-2

Bảng 4.2 Hiệu suất đối kháng (%) của các chủng vi khuẩn khi chủng với nấm Fusarium

solani ở các thời điểm khảo sát

STT Nghiệm thức Hiệu suất đối kháng (%)

Từ bảng 4.2 cho thấy ở 4 NSC tất cả các nghiệm thức tham gia thí nghiệm đều

thể hiện khả năng đối kháng đối với nấm Fusarium solani Trong đó các nghiệm thức

Pseudomonas 1, Pseudomonas 2, B.subtili s AĐ có hiệu suất đối kháng cao nhất, sự

khác biệt giữa các nghiệm thức này rất có ý nghĩa so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa với các nghiệm thức Pseudomonas 3, P

fluorescens, 197, 141-2, P.fluorescens N

Ở thời điểm 5 NSC tất cả các nghiệm thức đều có hiệu suất đối kháng với nấm

Fusarium solani tăng và khi so sánh hiệu suất đối kháng của các nghiệm thức với nhau thì ta nhận thấy không khác so với 4 NSC

Đến 6, 7 NSC các nghiệm thức có hiệu suất đối kháng tiếp tục tăng, ngoại trừ

Pseudomonas 4 có hiệu suất đối kháng giảm ở 7 NSC Vào thời điểm 7 NSC các nghiệm thức có hiệu suất đối kháng cao nhất vẫn là Pseudomonas 1, Pseudomonas 3,

B.subtili s AĐ, Pseudomonas 2, 197, P fluorescens, 141-2, P fluorescens N, các

nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa với nhau nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so

với đối chứng và tất cả các nghiệm thức còn lại

Tóm lại, trong 12 dòng vi khuẩn khảo sát có 8 dòng có hiệu suất đối kháng cao

Trong đó cao nhất là Pseudomonas 1, kế đến là các nghiệm thức Pseudomonas 1,

Pseudomonas 3, B.subtili s AĐ, Pseudomonas 2, 197, P.fluorescens, 141-2, P.fluorescens N

Từ kết quả ở bảng 4.1 và 4.2 cho thấy rằng nghiệm thức B.subtilis AĐ có

BKVVK cao nhất, hiệu suất đối kháng tuy không cao nhất nhưng hiệu suất đối kháng

của B.subtilis AĐ chênh lệch rất thấp so với Pseudomonas 1 và sự khác biệt là không

có ý nghĩa thống kê nên có thể kết luận dòng vi khuẩn B.subtilis AĐ có khả năng đối

kháng cao nhất Kết quả này tương tự với nghiên cứu cho rằng vi khuẩn Bacillus có

khả năng đối kháng tốt với Fusarium solani (Ebtsam và ctv, 2009) Theo Sarhan và ctv (2001), cũng đã chỉ ra rằng B.subtilis có thể ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm

Fusarium bằng cách tiết ra một số chất kháng nấm như subtilin, bacitracin, bacillin và bacillomycin Kế đến là các nghiệm thức 141-2 và Pseudomonas 2 có BKVVK cao kế

tiếp, có hiệu suất đối kháng nằm trong nhóm cao nhất Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Hoseong và ctv (1991) ghi nhận rằng vi khuẩn Pseudomonas có khả

năng sản xuất ra các enzym ngoại bào như chitinase, laminarinase và các enzym ngoại bào này ức chế rõ rệt sự tăng trưởng của sợi nấm Fusarium

Như vậy các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng khá cao, được chọn lọc để đưa vào thực hiện thí nghiệm khảo sát tính độc trên gốc ghép chanh Volka ngoài nhà

lưới là các dòng vi khuẩn B.subtilis AĐ, 141-2 và Pseudomonas 2 Các dòng vi khuẩn

còn lại mặc dù có hiệu suất đối kháng cao nhưng chúng không tạo ra được vòng vô khuẩn cao như các dòng trên nên các dòng này không được chọn

Đồng thời chúng tôi cũng chọn thêm dòng P fuorescens N mặc dù dòng này có

BKVVK không cao nhưng có hiệu suất đối kháng cũng nằm trong nhóm cao nhất và

cũng có nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy P.fluorescens N có hiệu quả đối kháng tốt

với nấm Fusarium solani (Trần Hoàng Linh, 2011)

Hình 4.1 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nấm Fusarium solani

(A): (1) vi khuẩn P.fluorescens N, vi khuẩn B Subtilis AĐ; (B): (1) vi khuẩn 141-2

(C): (1) vi khuẩn Pseudomonas 1, (2) vi khuẩn Pseudomonas 2

A B

Hình 4.2 Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nấm Fusarium solani ở

7 ngày sau chủng

(A): (1) NT đối chứng, (2) vi khuẩn Pseudomonas 4

(B): (1) vi khuẩn B.amyloliquefaciens, (2) vi khuẩn B subtilis

(C): (1) vi khuẩn 1995, (2) vi khuẩn 197

(D): (1) vi khuẩn Pseudomonas 3, (2) vi khuẩn Pseudomonas 4

4.2 Khảo sát tính độc của các chủng vi khuẩn đối kháng đối với nấm Fusarium solani trên gốc ghép chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

Nhằm chọn ra được những dòng vi khuẩn đối kháng có khả năng đối kháng cao

với nấm Fusarium solani mà không gây ảnh hưởng đến xấu đến sự sinh trưởng và phát

triển của cây có múi Thí nghiệm khảo sát tính độc của các dòng vi khuẩn đã được tiến hành Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua bảng các bảng 4.3 và 4.4

B ảng 4.3 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đối kháng đến sinh trưởng của cây chanh

Volka trong nhà lưới

STT Nghiệm thức Chỉ tiêu theo dõi (45 NSC)

Chiều cao cây Chiều dài rễ Trọng lượng thân rễ

Ghi chú: M ức ý nghĩa: ns: S ự khác biệt không có ý nghĩa ; NSC: Ngày sau ch ủng

Qua thí nghiệm chúng tôi nghi nhận được sau 45 ngày sau chủng tất cả các lần

lặp lại của các nghiệm thức không có cây chết và bất thường

Qua bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức chủng vi khuẩn B subtilis AĐ cho chiều

cao cây cao nhất, kế đến lần lượt là các nghiệm thức đối chứng, Pseudomonas 2, 141-2,

Pseudomonas fluoresceens N Tuy nhiên sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa Chiều dài rễ của các nghiệm thức 45 ngày sau chủng tương tự chiều cao cây

Trọng lượng thân rễ của các nghiệm thức cho thấy các nghiệm thức chủng vi khuẩn đều

có trọng lượng rễ cao hơn đối chứng (ngoại trừ vi khuẩn 141-2) Điều này chứng tỏ

các dòng vi khuẩn không gây ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng của cây chanh Volka

B ảng 4.4 Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đối kháng đến tỷ lệ rễ thối và tỷ lệ rễ mới

của cây chanh Volka trong điều kiện nhà lưới

STT Nghiệm thức Chỉ tiêu theo dõi (45 NSC)

M ức ý nghĩa: **: sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê ở mức 1 %

Kết quả 45 ngày sau chủng cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có rễ bị thối Có hai nghiệm thức có tỷ lệ rễ thối thấp hơn so với đối chứng (21,53 %) là B subtilis AĐ (17.36 %) và Pseudomonas 2 (18.75 %) Nghi ệm thức P.fluorescens N có tỷ lệ rễ bị

thối 24,31 % cao hơn không nhiều so với đối chứng (21,53 %) Cao nhất là nghiệm

thức 141-2 với tỷ lệ rễ thối 29,86 % Tuy nhiên khác biệt về tỷ lệ rễ bị thối giữa các

nghiệm thức không có ý nghĩa

Về tỷ lệ rễ mới ở các nghiệm thức có sự khác biệt, trong đó nghiệm thức chủng

Pseudomonas 2 có tỷ lệ rễ mới cao nhất không khác biệt so với đối chứng và nghiệm

thức chủng Bacillus subtilis AĐ nhưng khác biệt rất có ý nghĩa với các nghiệm thức còn

lại Nghiệm thức chủng 141-2 có tỷ lệ rễ mới thấp nhất khác biệt rất có ý nghĩa so với

đối chứng

Như vậy kết quả bước đầu nhận thấy trong 4 dòng vi khuẩn khảo sát có 1 dòng 141-2

mặc dù tỷ lệ rễ thối cao nhất, chiều cao cây, chiều dài rễ và trọng lượng thân thấp nhất

so với đối chứng nhưng không khác biệt so với đối chứng về thống kê nhưng lại có tỷ

lệ ra rễ mới thấp và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại

nên bước đầu có thể nhận định vi khuẩn 141-2 gây ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh trưởng của cây Ba dòng vi khuẩn còn lại Pseudomonas 2, Bacillus subtilis AĐ,

Pseudomonas fluorescens N không gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng của

cây chanh Volka Trong đó dòng Pseudomonas 2 nổi trội hơn 2 dòng còn lại với tỷ lệ rễ

mới ra của cây cao hơn, dẫn đến ảnh hưởng tốt đến quá trình hút chất dinh dưỡng lên nuôi cây nên nghiệm thức chủng Pseudomonas 2 có trọng lượng thân rễ cao nhất Như

vây, dòng vi khuẩn Pseudomonas 2 không những không gây ảnh hưởng xấu đến quá

trình sinh trưởng và phát triển của chanh Volka, mà còn tạo ra rễ mới nhiều hơn và có

khả năng đối kháng tốt với nấm Fusarium solani trong điều kiện in-vitro

Hình 4.3 Chanh Volka ở thời điểm 45 ngày sau khi chủng các dòng vi khuẩn:

A: Nghiệm thức đối chứng; B: Chủng vi khuẩn Pseudomonas 2

Hình 4.4 Chanh Volka ở thời điểm 45 ngày sau khi chủng các dòng vi khuẩn

C: Chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens N

D: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis AĐ

E: Chủng vi khuẩn 141-2

4.3 Đánh giá khả năng chống chịu bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani gây ra

trên một số giống cây cây có múi trong điều kiện in-vitro

E