Sau khi kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thủy sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus, các chủng vi khuẩn phân lập được xác định các đặc điểm hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm gram, đặc tính sinh lý và sinh hóạ
ạ Phương pháp nhuộm gram
- Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl trong 24h, sau đó được đem làm tiêu bản nhuộm Gram. Sau khi cố định vết bôi, nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi dưới kính hiển vi quang học (vật kính dầu 100x), vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (−) bắt màu đỏ [4].
b. Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa [4]:
- Sinh lý: Lấy một phần khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập, sau đó hòa vào môi trường NB (10ml) có bổ sung 1,5% NaCl, nuôi lắc ở điều kiện 120 vòng/phút, từ 28 - 300C cho các thí nghiệm về độ muối (0 đến 7% NaCl), pH (3 đến 9,5). Quan sát định tính khả năng sinh trưởng của các chủng trong ống nghiệm. Trong các thí nghiệm về nhiệt độ, các ống nghiệm được nuôi tĩnh ở các nhiệt độ khác nhau (15 đến 550C). Sau đó, ghi nhận định tính sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong ống nghiệm. Các thí nghiệm về sinh lý vi khuẩn được kiểm tra sau 24h và 48h nuôi cấỵ - Sinh hóa:
+ Phản ứng catalase: nhỏ dung dịch H2O2 3% vào khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn phân lập đã được tinh sạch. Nếu xuất hiện O2 qua việc tạo thành bọt khí thì được gọi là có phản ứng dương tính (+), ngược lại là âm tính (-).
+ Phản ứng oxidase: đặt khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn lên trên mặt giấy lọc, nhỏ dung dịch Tetramethyl P-Phenylenediamin - cotihydrochloride 1%. Nếu xuất hiện màu tím trong khoảng 10 giây, được gọi là phản ứng dương tính (+), nếu không có màu được gọi là phản ứng âm tính (-).
c. Phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên gen 16 S rDNA
+ Tách DNA và thực hiện phản ứng PCR: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lấy dịch và tách chiết DNA theo mô tả của Sakiyama và cs., [102]. Sau đó thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi:
- mồi xuôi 27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
- mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày chi tiết ở Phụ lục 1. Các sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose (1%), nhuộm với ethidium bromide trong 20 phút và quan sát trên máy soi gel. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ QIA Gen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm ở bước sóng 260 và 280nm, tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7. Tiếp tục thực hiện phản ứng PCR cho bước giải trình tự gen bằng các cặp mồi:
27F : 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';
1525R : 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.
780F : 5'- GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R : 5'- CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.
1100F : 5'- GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R : 5'- GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.
Chi tiết về thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự gen được trình bày tại Phụ lục 1. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch và được xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen ABI 3100 Avant. Sử dụng phần mềm BLAST để tìm kiếm thông tin so sánh trình tự gen của các chủng vi khuẩn.
+ Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được phân tích bởi phần mềm CLUSTAL X. Trình tự tham khảo các loài (chủng chuẩn) được lấy từ dữ liệu của ĐBJ, EMBL, GenBank để xác định đến tên loàị Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo Kimura [69], sử dụng phương pháp của Saitou và Nei [100].