Ở nước ta nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu của công nghệ sinh học trong thuỷ sản vẫn còn rất mới mẻ, mặc dù đã có rải rác những ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất đại trà một số đối tượng như cá rô phi đơn tính, rô phi đỏ, việc tạo ra các men probiotics hay vaccine cho tôm còn rất mới [21].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng men vi sinh để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít. Trong những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh [2] và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt. Tuy nhiên, cần có một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng.
Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được Lê Thị Bích Phượng et al., Lê Tấn Hưng
et al., Võ Thị Hạnh et al., Trần Thị Cẩm Hồng khảo cứu [5,6, 10, 11, 14].
Những nhóm vi khuẩn probiotic có tiềm năng được sử dụng làm thức ăn nuôi thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Moraxella [16]. Thành phần men vi sinh trong NTTS gồm những sản phẩm chính là dùng vi sinh vật sống. Những nhóm thường sử dụng bao gồm: Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Nitrosomonas, Nitrobacter, Saccharomyces.
Theo thông tin trên sản phẩm một số chế phẩm sinh học, thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic là tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, một số vitamin thiết yếu và chất khoáng. Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học giúp xử lý nước và nền đáy ao thường bổ sung các chủng xạ khuẩn và nấm sợi (thuộc nhóm Streptomyces, Aspergillus ...).
Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cs., tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và nhịp sử dụng khác nhaụ Tác giả cho biết với nghiệm thức không sử dụng, sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì nghiệm thức sử dụng hàng ngày là tốt nhất. Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột ở ngày thứ 18, mật số vi khuẩn Vibrio tổng cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng luôn giữ được ổn định. Điều này cho thấy hiệu quả tích cực của men vi sinh trong sản xuất giống tôm càng xanh [13].
Theo Nguyễn Đình Trung, một trong những cơ chế hoạt động của men vi sinh là các men có tác dụng phân huỷ các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất hữu cơ đơn giản. Vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy trì độ trong trong ao nuôi tôm các tháng
cuối không nhỏ hơn 30 cm. Vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trường thích hợp sẽ phát triển số lượng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của nguyên sinh động vật, các vi sinh vật và Vibrio có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng, giảm các tác nhân gây bệnh cho tôm nuôị Nhờ đó, hạn chế sử dụng các hoá chất và thuốc kháng sinh, giảm thay nước trong quá trình nuôi, góp phần cải thiện chất lượng nước trong hệ thống NTTS [19].
Theo Võ Thị Thứ và cs., thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôị Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng nhanh [17, 18].
Nghiên cứu sử dụng 3 loại men vi sinh Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio spp trong môi trường bể ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1-76,6%. Kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu về hiệu quả và phương thức sử dụng men vi sinh trong môi trường ương nuôi tôm càng xanh nhằm cải thiện môi trường và nâng cao năng suất ương ấu trùng [15].
Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh (ES-01 và BS-01 của Trung tâm nghiên cứu ứng dụngsinh học phục vụ NTTS Sóc Trăng) góp phần đưa năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng suất [128].
Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh [126].
Tóm lại, ứng dụng probiotic trong nghề NTTS sẽ đem lại lợi ích tích cực trong việc phòng tránh bệnh và cải thiện môi trường. Dù trong nước đã sản xuất được một số chế phẩm men vi sinh nhưng số lượng cũng như chủng loại còn hạn chế, mang tính đặc trưng vùng miền. Người dân làm nghề NTTS hiện nay chủ yếu tiêu dùng sản phẩm men vi sinh có nguồn gốc xuất xứ từ nước ngoài như Pond clear, Vitabio AQ, Super
VS,... có giá thành cao, chưa thật phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng trong nước. Một đặc điểm nữa của chế phẩm men vi sinh là khả năng thích ứng với môi trường nhanh, có sự trao đổi giữa các chủng bản địa và chủng công nghiệp trong chế phẩm nên sự thoái hóa chủng xảy ra nhanh, chủng công nghiệp khó duy trì đặc tính tốt trong thời gian lâụ Có thể một vài năm đầu sử dụng chế phẩm này là tốt nhưng năm sau lại không có hiệu quả. Vì vậy, thị trường luôn đòi hỏi các chế phẩm mới có bổ sung những chủng giống mớị Xuất phát từ thực tế trong nước, hướng nghiên cứu của đề tài là phù hợp và cần thiết, làm cơ sở cho sự phát triển nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm probiotic trong nước.
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2010 đến tháng 5/2011.
Địa điểm thu mẫu: Mẫu tôm sú Penaeus monodon (5 con/mẫu, khối lượng 25÷30g/con) và mẫu bùn (0,5kg/mẫu) được thu ở đầm nuôi tôm tại khu vực Quý Kim - phường Hải Thành - quận Dương Kinh - thành phố Hải Phòng.
Địa điểm phân tích, xử lý mẫu: Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biển - Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Vi khuẩn Bacillus spp có trong bùn ao nuôi tôm và hệ tiêu hóa của tôm sú.
2.2.2. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn
ạ Môi trường phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus spp [23]: - Môi trường NA (Nutrient agar) có bổ sung thêm 1,5% NaCl (w/v) - Môi trường NB (Nutrient broth) có bổ sung thêm 1,5% NaCl (w/v)
b. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus [9, 23] - Môi trường TCBS (Thiosulphate citrate Bilesalt Sucroza agar)
- Môi trường LB (Luria Bertani broth)
2.2.3. Một số thuốc thử và hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa, sinh lý [4].
- Dung dịch H2O2 3% dùng cho phản ứng catalase
- Dung dịch Tetramethyl P-Phenylenediamin - cotihydrochloride 1% dùng cho phản ứng oxidase
- Muối NaCl tinh khiết cho nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
- Mẫu tôm sú và bùn được thu ngẫu nhiên trong đầm nuôi tôm sú vào lúc sáng sớm, sau đó được đem về phòng thí nghiệm xử lý và phân tích.
- Vợt được rửa bằng xà phòng, sau đó rửa lại bằng nước máy, rửa lại bằng nước trong đầm nuôi tôm. Dùng vợt để bắt tôm trong đầm, chọn tôm khỏe mạnh, cho vào túi nilon sạch, đã được khử trùng, giữ trong đá lạnh đem về phòng thí nghiệm.
- Rửa gầu (cuốc) thu mẫu đáy giống như rửa vợt. Dùng gầu xúc bùn từ đáy ao, sau đó cho vào túi nilon sạch được khử trùng giữ trong đá lạnh đem về phòng thí nghiệm.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
- Toàn bộ dụng cụ và dung dịch NaCl 1,5% (w/v) đều được khử trùng theo tiêu chuẩn sử dụng cho vi sinh vật. Mọi thao tác đều được thực hiện trong buồng cấy vô trùng.
- Mẫu tôm được rửa sạch bằng dung dịch NaCl 1,5%, dùng dao chuyên dụng mổ lấy ống tiêu hóa (ruột và dạ dày). Ống tiêu hóa được nghiền nát bằng chày và cối sứ . Dịch nghiền được hòa vào 5ml dung dịch NaCl 1,5%, sau đó cho sốc nhiệt bằng cách ủ trong bể nước nóng 800C trong 20 phút, sau đó ngâm ngay vào nước lạnh (nước máy). Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn [88].
- Mẫu bùn được pha vào dung dịch NaCl 1,5%. Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn.
2.3.3. Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và giữ giống vi khuẩn Bacillus spp spp
+ Phân lập: Thực hiện phân lập vi khuẩn gồm các bước sau [4]:
- Tiến hành pha loãng hệ thống (hệ số pha loãng 10), dịch huyền phù đến độ pha loãng 10-4 bằng nước muối sinh lý 0,85%. Ở mỗi mức pha loãng, lấy 100µl cho vào hộp lồng có môi trường NẠ Dùng que trang bằng thủy tinh dàn đều dịch pha loãng trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch ráo nước. Úp ngược hộp lồng và đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h.
- Vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường TCBS ở nhiệt độ 28 – 300C trong 24h.
- Khuẩn lạc Bacillus spp được tinh sạch lại, sau đó cấy chuyển sang ống thạch nghiêng bằng cách cấy ria, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C.
- Khuẩn lạc Bacillus spp được lưu giống bằng dung dịch Glycerol 20% ở nhiệt độ -800C.
2.4. Xác định khả năng ức chế Vibrio spp gây bệnh
- Vi khuẩn gây bệnh V. alginolyticus và V. parahaemolyticus sử dụng trong nghiên cứu này do Trung tâm Nghiên cứu Môi trường và Dịch bệnh Thủy sản- Viện
Nghiên cứu NTTS I cung cấp, gồm mỗi loài 1 chủng, được trung tâm phân lập từ tôm sú bị bệnh tại đầm ao nuôi khu vực Quý Kim - Hải Phòng.
2.4.1. Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus.
Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp của Lemos et al., và Purivirojkul
et al., [73, 88]. Cấy vạch chủng V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trước, sau đó cấy các chủng Bacillus spp vuông góc với đường cấy Vibriọ Thực hiện kiểm tra này trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl (w/v). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 24h và 48h.
2.4.2. Ức chế vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus
Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp kháng sinh đồ (Purivirojkul, 2007) [88] và được lặp lại 3 lần:
- Nuôi cấy chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng LB trong vòng 24h. Sau đó, lấy dịch huyền phù vi khuẩn (100µl) cấy gạt sang hộp lồng có chứa môi trường NẠ
- Các chủng vi khuẩn Bacillus spp được nuôi cấy trong môi trường lỏng NB có bổ sung 1,5% NaCl (w/v) ở nhiệt độ 300C trong vòng 24h. Dùng các đĩa giấy có đường kính 10mm đã khử trùng, nhúng vào dịch nuôi các chủng vi khuẩn Bacillus spp. Sau đó được đặt lên mặt hộp lồng có vi khuẩn Vibrio đã cấy gạt, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C, theo dõi trong vòng 24h và 48h.
2.4.3. Đồng nuôi cấy trong nước biển
Thực hiện thí nghiệm này theo phương pháp của Purivirojkul [88] và được lặp lại 3 lần:
- Từng chủng vi khuẩn Bacillus spp được làm giàu trong 10ml môi trường NB trong vòng 24h, tốc độ lắc là 110 vòng/phút
- Từng chủng vi khuẩn Vibrio spp được làm giàu trong 10 ml môi trường LB trong vòng 24h, tốc độ lắc là 110 vòng/phút.
- Chuẩn bị dãy ống nghiệm 8ml nước biển khử trùng (20ppt), sau đó từng chủng vi khuẩn Bacillus (1ml/chủng) được cho vào ống nghiệm. Cho tiếp từng chủng vi khuẩn Vibrio (1ml/chủng) vào cùng ống nghiệm. Nuôi cấy riêng rẽ Các chủng
Vibrio và Bacillus trong các ống nghiệm có nước biển khử trùng (20 ppt) làm đối chứng. Theo dõi sự phát triển theo 0h, 24h, 48h bằng cách lấy dịch nuôi, gạt trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl và TCBS để đếm số lượng khuẩn lạc.
2.5. Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh vi khuẩn phân lập từ vùng nuôi tôm có khả năng ức chế Vibrio gây bệnh
- Theo dõi sự sinh trưởng của các chủng Bacillus spp trong môi trường NB có bổ sung 1,5% NaCl. Kiểm tra mật độ tế bào tại các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h sau khi cấy bằng máy đo mật độ quang UV/VIS ở bước sóng 620nm.
- Theo dõi các điều kiện phát triển tối ưu của các chủng vi khuẩn Bacillus spp với các điều kiện nhiệt độ, độ muối, pH. Môi trường nền là NB có bổ sung 1,5% NaCl, sau đó được điều chỉnh các thông số nhiệt độ, pH và độ muối theo các dãy giá trị khác nhaụ Nuôi cấy trong tủ ấm ở điều kiện 300C (pH và độ muối). Sau 24h đọc kết quả sinh trưởng ở các dãy giá trị thí nghiệm bằng máy đo mật độ quang UV-VIS ở bước sóng 620nm. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần
+ dãy giá trị nhiệt độ thí nghiệm : 150C, 280C, 350C, 450C, 500C (nhằm để tìm hiểu khả năng thích nghi với nhiệt độ môi trường vùng nuôi và nhiệt độ thích ứng với quy mô sản xuất công nghiệp)
+ dãy giá trị độ muối thí nghiệm (%NaCl): 0; 1,5; 2; 3; 4; 5; 7 (Nhằm xác định khả năng thích nghi tối đa với nồng độ muối, từ đó xác định có thể thích nghi với môi trường ao nuôi)
+ dãy giá trị pH thí nghiệm: 4;5;7;8,5;9,5 (Nhằm xác định khả năng thích nghi với môi trường ao nuôi)
2.6. Phân loại và định danh vi khuẩn
Sau khi kiểm tra khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thủy sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus, các chủng vi khuẩn phân lập được xác định các đặc điểm hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm gram, đặc tính sinh lý và sinh hóạ
ạ Phương pháp nhuộm gram
- Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl trong 24h, sau đó được đem làm tiêu bản nhuộm Gram. Sau khi cố định vết bôi, nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi dưới kính hiển vi quang học (vật kính dầu 100x), vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (−) bắt màu đỏ [4].
b. Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa [4]:
- Sinh lý: Lấy một phần khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập, sau đó hòa vào môi trường NB (10ml) có bổ sung 1,5% NaCl, nuôi lắc ở điều kiện 120 vòng/phút, từ 28 - 300C cho các thí nghiệm về độ muối (0 đến 7% NaCl), pH (3 đến 9,5). Quan sát định tính khả năng sinh trưởng của các chủng trong ống nghiệm. Trong các thí nghiệm về nhiệt độ, các ống nghiệm được nuôi tĩnh ở các nhiệt độ khác nhau (15 đến 550C). Sau đó, ghi nhận định tính sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong ống