Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng nấm mốc có khả năng chịu acid, kháng và hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng tân cương, thái nguyên

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc đề tài nghiên cứu này, cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc ủng hộ, giúp đỡ hƣớng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trƣớc hết, tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ts Nguyễn Nhƣ Ngọc Bộ mơn Vi Sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Ths Nguyễn Thị Mai Lƣơng Bộ môn Bảo vệ Thực Vật, Khoa Quản lý Tài Nguyên Rừng Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tận tình định hƣớng, hƣớng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn sinh viên phịng thí nghiệm Vi Sinh - Hóa Sinh nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, khích lệ giúp tơi vƣợt qua khó khăn suốt q trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2019 Sinh viên Đinh Thị Ngọc Lan i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình phát triển ngành cơng nghiệp trồng chè 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.2 Các nhân tố ảnh hƣởng đến việc canh tác sản xuất chè 1.2.1 Nhóm nhân tố kinh tế kỹ thuật 1.2.2 Nhóm nhân tố điều kiện kinh tế, xã hội 1.2.3 Nhóm nhân tố điều kiện tự nhiên 1.3 Vi sinh vật kháng kim loại 1.4 Ảnh hƣởng axid đến hoạt động vi sinh vật 10 1.5 Ảnh hƣởng hấp thụ nhôm 12 1.5.1 Tác động nhôm đến phát triển chè 12 1.6 Các phƣơng pháp cải thiện đất trồng chè có tính axit, nhiễm nhơm 13 1.6.1 Phƣơng pháp bón vơi 13 1.6.2 Phƣơng pháp bón phân hữu 14 1.6.3 Phƣơng pháp sử dụng vi sinh vật để hấp thụ kim loại 14 1.7 Tình hình nghiên cứu khả kháng hấp thụ kim loại vi sinh vật 17 1.7.1 Trên giới 17 1.7.2 Tại việt Nam 18 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu, hóa chất 21 2.3.1 Vật liệu 21 2.3.2 Hóa chất 21 2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 22 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 22 2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật 25 2.5.2 Phƣơng pháp giữ bảo quản giống 25 2.5.3 Tuyển chọn chủng nấm có khả kháng nhơm với nồng độ cao 25 2.5.4 Định danh chủng nấm mốc tuyển chọn đƣợc phƣơng pháp sinh học phân tử 26 2.5.5 Xác định khả chịu acid chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 27 2.5.6 Xác định khả sinh trƣởng, phát triển hấp thụ nhôm chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 28 2.5.7 Xác định vị trí nhơm hấp thụ lên sinh khối chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 29 2.5.8 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Phân lập chủng nấm có khả kháng nhôm 31 3.2 Kết tuyển chọn chủng nấm có khả kháng nhơm với nồng độ nhôm cao 33 3.2.1 Kết tuyển chọn chủng nấm có khả sinh trƣởng, phát triển với nồng độ dung dịch nhôm 500 mg L-1 34 3.2.2 Kết tuyển chọn chủng nấm có khả sinh trƣởng, phát triển với nồng độ nhôm từ 700 đến 2000 mg -1 35 3.3 Kết định danh chủng nấm đƣợc tuyển chọn phƣơng pháp sinh học phân tử 37 iii 3.4 Kết nghiên cứu khả chịu axid chủng nấm mốc tuyển chọn đƣợc 39 3.5 Xác định khả kháng hấp thụ nhôm chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 40 3.6 Xác định vị trí nhôm hấp thụ vào sinh khối chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng phân lập (MT1) 22 Bảng 2.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy, làm thuần, giữ giống (MT2) 23 Bảng 2.3 Thành phần môi trƣờng tuyển chọn chủng nấm mốc có khả kháng nhơm (MT3) 23 Bảng 2.4 Thành phần môi trƣờng xác định khả chịu acid chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn (MT4) 24 Bảng 2.5 Thành phần môi trƣờng xác định khả sinh trƣởng, phát triển hấp thụ nhôm chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn (MT5) 24 Bảng 2.6 Bảng ký hiệu mẫu đất 29 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng nấm phân lập đƣợc 31 Bảng 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc chủng nấm mốc có khả sinh trƣởng, phát triển với nồng độ dung dịch nhôm 500 mg L-1 34 Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc chủng A7 với nồng độ dung dịch từ 700 đến 2000 mg L-1 36 Bảng 3.4 Mức độ tƣơng đồng chủng Penicillium janthinellum A7 với trình tự tƣơng đồng genbank 38 Bảng 3.5 Khả sinh trƣởng phát triển chủng nấm mốc nồng độ 100 mg L-1 giá trị pH khác (g sinh khối khô L-1) 39 Bảng 3.6 Khả sinh trƣởng, phát triển hiệu suất hấp thụ nhôm chủng nấm mốc nồng độ nhôm khác 40 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sản lƣợng xuất chè tồn cầu từ năm 2006 - 2015 [25] Hình 1.2 Sản lƣợng xuất chè Việt Nam từ năm 2006 -2015 [25] Hình 1.3 Cơ chế hấp thụ sinh học kim loại vi sinh vật 15 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng A1, A5, A7 33 Hình 3.2 Hình thái chủng A7, A5, A4 sinh trƣởng, phát triển đƣợc với nồng độ nhôm 500 mg L-1 35 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng A7 với nồng độ lần lƣợt từ 700, 1000, 2000 mg L-1 36 Hình 3.4 Sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 mơi trƣờng Hansen dịch thể pH 3,0 bình đối chứng chủng A11 khơng có khả kháng nhơm 40 Hình 3.5 Phổ X – Ray (sử dụng tia chiếu điện tử) 42 Hình 3.6 Hình ảnh chụp SEM độ phóng đại khác Chủng nấm Penicillium janthinellum A7 nồng độ 500 mg L-1 43 Hình 3.7 Hình ảnh chụp SEM độ phóng đại khác Chủng nấm Penicillium janthinellum A7 nồng độ 2000 mg L-1 44 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chè xanh (Camellia sinensis) công nghiệp lâu năm cho giá trị kinh tế cao phát triển lâu dài, đồ uống đƣợc tiêu thụ rộng rãi giới Với tác dụng giải khát, kích thích hệ thần kinh trung ƣơng, giúp tiêu hố chất mỡ, giảm đƣợc bệnh béo phì chống lão hoá Khoa học đại sâu nghiên cứu, tìm hiểu tìm nhiều hoạt chất có giá trị sản phẩm chè nhƣ: Cafein, tanin, vitamin A, B1, B2, B6… Hơn chè giữ vị trí quan trọng kinh tế quốc dân, góp phần tạo việc làm tăng thu nhập cho ngƣời trồng chè Cây chè mặt hàng nông sản xuất chủ lực nƣớc ta, hàng năm mang cho nƣớc ta nhiều ngoại tệ góp phần vào cơng cơng nghiệp hố, đại hố đất nƣớc Vì phát triển ngành chè vấn đề đƣợc coi trọng, Việt Nam nằm tốp nƣớc xuất chè lớn giới, thúc đẩy tốc độ tăng trƣởng nơng nghiệp nói riêng kinh tế nƣớc ta nói chung Trong q trình canh tác lƣợng lớn phân đạm (đặc biệt ammonium sulfate) đƣợc bón vào đất trồng chè nhằm tăng hàm lƣợng amino acid chè, đồng thời tạo màu sắc hấp dẫn hƣơng vị đậm đà sản phẩm chè… Nhƣng việc lạm dụng bón phân đạm mức dẫn đến lƣợng lớn ammonium sulfate dƣ thừa với nồng độ cao làm cho lƣợng lân đạm (ammonium sulfate) bón vào đất trồng chè nhanh chóng bị chuyển đổi thành nitrate vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng có khả chịu acid Hậu lƣợng đáng kể nitrate sulfate đƣợc tích luỹ dần đất trồng chè, làm pH đất giảm xuống c n 4,0 chí thấp hơn, từ làm tăng hàm lƣợng nhơm linh động đất trồng chè Trong điều kiện này, chè đƣợc cho hấp thụ lƣợng nhôm đáng kể, hàm lƣợng nhôm sản phẩm chè cao gây hại đến sức khoẻ cho ngƣời tiêu dùng Hơn nữa, hàm lƣợng nhôm thể ngƣời cao đƣợc giả thuyết có mối liên kết với nhiều bệnh khác nhƣ chứng trí não, xơ não, gãy xƣơng bệnh Alzheimer Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp giải để khắc phục tình trạnh nhiễm nhơm nhƣ cải thiện độ chua đất vơi hay sử dụng phân bón hữu nhƣng không mang lại hiệu cao Một biện pháp đƣợc nghiên cứu mang lại hiệu phổ biến việc sử dụng vi sinh vật để cải thiện đất trồng chè Với mục đích tìm chủng vi sinh vật có khả chịu acid hấp thụ nhôm để ứng dụng vào việc xử lý đất trồng chè nhằm hƣớng tới phát triển bền vững ngành công nghiệp chè nƣớc ta Trên sở này, thực đề tài “Phân lập, tuyển chọn định danh chủng nấm mốc có khả chịu acid, kháng hấp thụ nhôm từ đất trồng chè vùng Tân Cƣơng, Thái Nguyên” PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình phát triển ngành cơng nghiệp trồng chè 1.1.1 Trên giới Với lịch sử đời đƣợc biết đến Trung Quốc, sau chè phát triển nƣớc Đơng Nam Á phía bắc Ấn Độ, nƣớc Châu Phi Châu Mỹ La Tinh Ban đầu thị trƣờng chè chƣa rộng lớn, nhƣng nƣớc sản phẩm chè có mặt thị trƣờng quốc tế Theo đánh giá chuyên gia Đỗ Ngọc Quý Nguyễn Kim Phong chè đƣợc trồng 58 nƣớc khắp châu lục Trên giới có 4.657.000 chè, sản lƣợng sản xuất tiêu thụ 5.057.000 Trong Châu Á chiếm 80 % diện tích chè tồn giới, số c n lại châu lục khác Các nƣớc tiêu thụ chè có 115 nƣớc, gồm Châu Âu có 28 nƣớc, Châu Mỹ có 19 nƣớc, Châu Á có 29 nƣớc, Châu Phi có 34 nƣớc Châu Đại Dƣơng có năm Mức tiêu thụ bình quân 0,19 kg/ ngƣời/ năm [7] Hàng năm, 43% sản lƣợng chè giới đƣợc dành cho xuất Xuất chè chiếm vai tr quan trọng kinh tế nhiều nƣớc, đặc biệt vấn đề an toàn lƣơng thực Theo đánh giá giá FAO, hoạt động xuất mang lại 33% thu nhập xuất từ sản phẩm nông nghiệp Kenya, 55% SriLanka, 2% Indonesia 5% Tanzania Ở srilanka, thu nhập từ xuất chè tƣơng đƣơng với 66% chi tiêu nhập lƣơng thực Còn Kenya thu nhập xuất chè đủ để chi phí tồn chi tiêu nhập lƣơng thực Từ góp phần cho ngành công nghiệp chè ngày phát triển [14] 1.1.2 Tại Việt Nam Chè trồng lâu đời Việt Nam, năm gần việc triển khai giao đất khoán chè cho ngƣời lao động theo nghị định phủ với giải pháp ngành chè Việt Nam giải tạo việc làm cho ngƣời lao động Đặc biệt thị trƣờng tiêu thụ chè ngày rộng lớn khắp toàn cầu tạo động lực khuyến khích ngƣời lao động chủ động đầu tƣ thâm canh chè để đạt suất, chất lƣợng cao Ngoài ra, trồng chè kỹ thuật tạo thảm thực vật có tác dụng phủ xanh đất trống đồi núi trọc, chè có tác dụng chống xói m n, bảo vệ mơi trƣờng [17] Cây chè đƣợc phân bố rộng phạm vi nƣớc nhƣ vùng Tây Bắc (gồm Sơn La, Lai Châu), vùng Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn (gồm Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Lào Cai), vùng Trung du Bắc Bộ (gồm Phú Thọ, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Bắc Kạn, Bắc Giang, Thái Nguyên), vùng Bắc Trung Bộ (gồm Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh), vùng Tây Nguyên (gồm Gia Lai, Kontum, Lâm Đồng), vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho chè sinh trƣởng phát triển tạo nên lƣợng lớn chè xuất thị trƣờng [16] Từ ngành chè cịn trở thành nghành công nghiệp quan trọng hàng đầu sớm ngành công nghiệp chế biến dài ngày Hiện có 107 đầu mối xuất tổng cơng ty chè Việt Nam chiếm 46,5 % khối lƣợng 67,23 % tổng giá trị tổng giá trị kim ngạch xuất Qua cho thấy Việt Nam chè có vị trí quan trọng kinh tế quốc dân tạo lƣợng lớn chè xuất toàn cầu nhƣ Việt Nam đƣợc thể rõ qua hai biểu đồ hình 1.1 1.2 Do phát triển ngành chè nƣớc ta phát huy đƣợc vai tr kinh tế hộ gia đình, lợi vùng, đơn vị để áp dụng tiến giống, kỹ thuật canh tác chế biến mà góp phần to lớn việc sử dụng có hiệu đất đai, lao động nơng nghiệp, góp phần nâng cao đời sống vật chất, văn hóa tinh thần ngƣời dân Chính điều khẳng định việc đầu tƣ phát triển cho ngành chè hƣớng [7] Với nồng độ dung dịch nhôm bổ sung vào mơi trƣờng cao tỉ lệ sinh trƣởng phát triển giảm, khuẩn lạc ngày nhỏ đi, phân bố khuẩn lạc đĩa ngày không sau ngày nuôi cấy đồng thời chủng mơi trƣờng Hansen có bổ sung nồng độ dung dịch nhôm với lần lƣợt 700, 1000, 2000 mg C n chủng c n lại hầu nhƣ khơng sinh trƣởng đƣợc Vì vậy, có chủng A7 sinh trƣởng, phát triển dải nồng độ dung dịch nhôm So sánh với kết Ngô Thị Tƣờng Châu cộng (2018) tuyển chọn đƣợc hai chủng nấm mốc F8 F13 phát triển tốt mơi trƣờng Hansen thạch đĩa (pH 3,0) chứa nhôm với nồng độ lên đến 700 mg L-1.[6] Nhƣ chủng nấm mốc A7 đƣợc cho chiếm ƣu tổng số chủng nấm mốc chịu acid kháng nhơm đƣợc xác định Vì chủng nấm mốc đƣợc chọn làm đối tƣợng cho nghiên cứu 3.3 Kết định danh chủng nấm đƣợc tuyển chọn phƣơng pháp sinh học phân tử Sau tuần nuôi cấy chủng A7 môi trƣờng Hansen, pH 4,0 không chứa nhôm gửi đến ph ng xét nghiệm công ty TNHH DV Nam Khoa để xác định tên chủng phƣơng pháp xác định trình tự 28S rRNA (đối với nấm mốc) so sánh với ngân hàng genbank Sau trình định danh kết trình tự gen 28s rRNA chủng (A7) nhƣ sau: CGAAGGAGCTTCACACGGGCGCGGGCACCCCATCCCAGACGG GATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGATGGGGG CCGCTCCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACCCCGAAGGG GCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAG GCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTC AGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAGAAAGATTGAGG GGGGTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAA GCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGG GCCCGCCCCCCGGGAGCCGGGGGGCGGGGGCCCAACACACAAGCCG TGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATA 37 CCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTC TGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCC GGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGCTAATC GCTCAGACTGCAATCTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCTTCGGCGGGC GCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCAGACGGCGGGCCCG CCGAAGCAACTAGGTATGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAG AGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAA CCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGAGTTTGACCAACTT TCCGGCTCTGGGGGGTCGTTGCCAACCCTCCTGAGCCAGTCCGAAGG CCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGG Bảng 3.4 Mức độ tƣơng đồng chủng Penicillium janthinellum A7 với trình tự tƣơng đồng genbank Chủng nấm Độ tƣơng đồng (%) Mã số truy cập Genbank Penicillium janthinellum 100 AB293968 Penicillium chrysogenum 99 KY352035 Penicillium citrinum 99 KY347018 Penicillium cosmopolitanum 98 MH859863 Penicillium shearii 97 MH857352 Penicillium roseopurpureum 97 MH861558 Kết phân tích trình tự đoạn gen 28S rRNA chủng A7 phần mềm Sequecing Analysis 5.3, đồng thời so sánh trình tự với sở liệu GenBank NCBI phần mềm BLAST so sánh với bảng 3.4 cho thấy trình tự tƣơng đồng 100% với trình tự đoạn gen 28S rRNA chủng Penicillium janthinellum Kết cho phép kết luận chủng (A7) Penicillium janthinellum A7 Đƣợc biết loài Penicillium nấm mốc thƣờng đƣợc tìm thấy đất, chất hữu làm thối mầm bệnh trái rau Loài thƣờng 38 nhóm sinh vật học Eurotinomes (Eurotinomes loại nấm, có ba họ, 49 chi 928 loài) Ascomycota (ngành nấm lớn nhất, với 64.000 lồi) Chúng đƣợc đánh giá khơng cạnh việc kiểm tra sinh học chất hữu cơ, chúng sản xuất loại kháng sinh nhƣ penicillin griseofulvin, chất chuyển hóa độc hại (mycotoxin) nhƣ ochratoxin A, patulin penitrem A thực Phẩm ngũ cốc Pho mát Một số Penicillium giải Phóng Phốt Pho cố định (P) đất làm cho có sẵn cho Đặc biệt Penicillium có khả chịu đựng cho chủ chống lại tác nhân khác bao gồm độc tính kim loại Các chủng Penicillium khác tăng cƣờng khả chịu đựng chủ chống độc tính kim loại mức độ khác Ví dụ, độc tính nhơm kẽm đƣợc giảm bới chủng penicillium janthinellum penicillium simplicissimum cách tổng hợp axit citric [29] 3.4 Kết nghiên cứu khả chịu axid chủng nấm mốc tuyển chọn đƣợc Một đặc tính đất axit, có ion nhơm, tính axit mạnh ion nhơm nhiều Chính việc thay đổi giá trị pH nhằm mục đích tìm giá trị pH phù hợp cho nấm mốc sinh trƣởng phát triển tốt , giúp nấm mốc hấp thu làm giảm nồng độ nhơm đáng kể để chè sinh trƣởng, phát triển tốt Nghiên cứu khả chịu axid chủng nấm mốc Penicillium janthinellum A7 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng Hansen dịch thể chứa 100 mg nhôm thay đổi pH từ 2,2 đến 5,0 Sau ni cấy ngày máy lắc ổn nhiệt 30 C, 150 vòng/phút thu đƣợc kết sau: Bảng 3.5 Khả sinh trƣởng phát triển chủng nấm mốc nồng độ 100 mg L-1 giá trị pH khác (g sinh khối khô L-1) pH Chủng 2,2 2,4 -1 2,6 2,8 Sinh khối khô (g L )của chủngPenicillium 6,2133 6,2384 6,2782 6,2027 7,3976 6,2505 janthinellum A7 39 Hình 3.4 Sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 môi trƣờng Hansen dịch thể pH 3,0 bình đối chứng chủng A11 khơng có khả kháng nhơm Chủng nấm mốc Penicillium janthinellum A7 phát triển tốt môi trƣờng Hansen dịch thể chứa nhôm nồng độ dung dịch nhôm 100 mg giá trị pH từ 2,2 đến 5,0, đặc biệt pH 3,0 (Bảng 3.5, Hình 3.4) Trong đó, Wang.J cộng (2016) xác định đƣợc hai chủng S4 S7 phát triển tốt môi trƣờng chứa nhôm với giá trị pH từ 3,2 đến 3,1 [45] Vì giá trị pH 3,0 đƣợc chọn cho nghiên cứu 3.5 Xác định khả kháng hấp thụ nhôm chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn Sau ngày nuôi cấy môi trƣờng Hansen dịch thể chứa nồng độ nhôm khác (pH 3,0) máy lắc ổn nhiệt 30 C, 150 vòng/phút, sinh khối tạo thành hiệu suất hấp thụ nhôm chủng nấm mốc đƣợc xác định thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Khả sinh trƣởng, phát triển hiệu suất hấp thụ nhôm chủng nấm mốc nồng độ nhôm khác Chủng Penicillium janthinellum A7 Chỉ tiêu theo dõi Khối lƣợng sinh khối 14,0763 khô (g Hiệu suất hấp thụ (%) 40 Nồng độ nhôm (mg ) 500 700 1000 2000 8,7522 9,5061 8,5720 7,0501 98,066 96,997 93,843 90,955 Tại nồng độ nhôm 500 mg janthinellum A7 (8,7522 g sinh khối chủng Penicillium đạt 62,18% so với đối chứng (không chứa nhôm) hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 đạt 98,066 % Tại nồng độ nhôm 700 mg (9,5061 g sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 ) đạt 67,53% so với đối chứng (không chứa nhôm) hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 đạt 96,997 % Tại nồng độ nhôm 1000 mg sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 (8,5720 g ) đạt 60,89% so với đối chứng (không chứa nhôm) hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 đạt 93,843 % Tại nồng độ nhôm 2000 mg sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 (7,051 g ) đạt 50,09% so với đối chứng (không chứa nhôm) hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 đạt 90,955 % Qua cho thấy khả sinh trƣởng phát triển hiệu suất hấp thụ nhôm chủng nấm mốc giảm dần nồng độ nhôm tăng dần So sánh với kết nghiên cứu Ngô Thị Tƣờng Châu cộng (2018) nghiên cứu đƣợc hiệu suất hấp thụ nhôm từ môi trƣờng Hansen dịch thể chứa nhôm với nồng độ 500 mg chủng Eupenicillium javanicum F8 đạt 87,59 % chủng Penicillium variabile F13 đạt 87,94 % [6] kết nghiên cứu hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 cao nhiều 3.6 Xác định vị trí nhơm hấp thụ vào sinh khối chủng nấm mốc đƣợc tuyển chọn Sau thực nuôi lắc ngày thu sinh khối chủng nấm mốc Penicillium janthinellum A7, sinh khối đƣợc sấy khơ chụp SEM 41 Hình 3.5 Phổ X – Ray (sử dụng tia chiếu điện tử) Từ hình 3.7 bƣớc đầu khẳng định chủng nấm mốc Penicillium janthinellum A7 hấp thụ lƣợng nhôm vào sinh khối Sử dụng đầu d điện tử ngƣợc BSE (Backscattered electrons điện tử phản xạ ngƣợc trở lại sau va vào nguyên tử bề mặt mẫu) để thu cấu trúc bề mặt sợi thấy đƣợc khác nguyên tử số trung bình thành phần cấu tạo cho độ tƣơng phản khác nhau, nên vùng mẫu sinh khối chủng nấm Penicillium janthinellum A7 có thành phần nguyên tố khác dễ dàng nhận thấy ảnh 3.7 Với nồng độ 500 mg 2000 mg Kết thu đƣợc đƣợc thể hình 3.8 3.9 42 đƣợc gửi mẫu chụp SEM 2000 x 1000 x 10000 x 4000 x Hình 3.6 Hình ảnh chụp SEM độ phóng đại khác Chủng nấm Penicillium janthinellum A7 nồng độ 500 mg L-1 43 1000 x 2000 x 4000 x 10000 x Hình 3.7 Hình ảnh chụp SEM độ phóng đại khác Chủng nấm Penicillium janthinellum A7 nồng độ 2000 mg L-1 Từ hai hình 3.6 3.7 quan sát thấy hạt trắng sáng vật liệu nhôm phân bố bề mặt sợi Khi chiếu chùm tia điện tử đầu thu phổ tán xạ lƣợng X vào mẫu, tia X đặc trƣng đƣợc sinh Từ thu đƣợc phổ tia X đặc trƣng, biết đƣợc ngun tố nhơm có tồn phân bố bên sợi chủng nấm Cùng sử dụng kính hiển vi điện tử Nguyễn Minh Tấn cộng (2017) quan sát thấy, ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) rơm rạ trƣớc sau xử lý kiềm, dễ ràng nhận sợi rơm trƣớc xử lý kiềm bề mặt nhẵn mặt cắt ngang cấu trúc lỗ nhỏ sần sùi, 44 sau xử lý kiềm loại bỏ đƣợc lignin, hemicellulose tạp chất bề mặt sợi rơm gấp sóng, vết nứt xuất hiện, diện tích bề mặt sợi rơm tăng lên, cấu trúc lỗ to tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân phản ứng cơng vào, từ cải thiện hiệu suất phản ứng đồng trùng hợp [19] 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ mẫu đất vùng Tân cƣơng Thái nguyên phân lập đƣợc 15 chủng nấm mốc Trong đó, có 10 chủng nấm mốc có khả sinh trƣởng phát triển tốt mơi trƣờng Hansen có bổ sung 100 mg L-1 nhôm C n lại chủng khả sinh trƣởng, phát triển - Tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc Penicillium janthinellum A7 có khả sinh trƣởng, phát triển với nồng độ dung dịch nhôm cao 500 đến 2000 mg L-1 - Định danh đƣợc chủng đƣợc tuyển chọn phƣơng pháp sinh học phân tử chủng Penicillium janthinellum A7 - Xác định đƣợc khả chịu acid chủng đƣợc tuyển chọn pH 3,0 sinh khối khô chủng nấm mốc 7,3976 g L-1 cao so với sinh khối pH c n lại - Xác định đƣợc khả sinh trƣởng, phát triển hấp thụ nhôm chủng nấm đƣợc tuyển chọn cao nồng độ dung dịch nhôm 500 với khối lƣợng sinh khối chủng Penicillium janthinellum A7 mg 8,7522 g đạt 62,18% so với đối chứng (không chứa nhôm) hiệu suất hấp thụ nhôm chủng Penicillium janthinellum A7 đạt 98,066 % - Vị trí nhơm hấp thụ lên chủng nấm mốc phía sợi nấm 4.2 Kiến nghị - Xác định thêm điều kiện môi trƣờng nuôi cấy khác nhau, tốc độ lắc nuôi lỏng, nồng độ nhôm khác cho d ng nấm mốc vừa phân lập - Nghiên cứu thêm độ pH khác mà nấm mốc sinh trƣởng, phát triển đƣợc - Nghiên cứu khả hấp thụ nhôm với liều lƣợng bổ sung cao - Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm mốc xử lý môi trƣờng đất, nƣớc thải, rác thải… 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Xuân Cự, Trần Thị Tuyết Thu (2014), “Một số tính chất đất hàm lƣợng ngun tố khống búp chè với mức độ thâm canh khác Tân Cƣơng, Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội, 30 (4S), tr 28 – 35 [2] Đặng Văn Minh (2003), “Nghiên cứu số ảnh hƣởng đất trồng chè lâu năm tới số tính chất lý hóa học đất”, Tạp chí khoa học đất (19), tr 48 – 52 [3] Đặng Văn Minh (2005), “Tính chất lý học đất trồng chè lâu năm”, Tạp chí khoa học đất (23), tr 11 – 14 [4] Phan Chí Nghĩa, Nguyễn Văn Toàn (2015), Kết nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm đất tƣới nƣớc đến sản xuất chè vụ đông xuân Phú Thọ, Khoa Nông – Lâm – Ngƣ, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng [5] Trịnh Xuân Ngọ (2009), Cây chè kỹ thuật chế biến, tr 40 – 62 [6] Ngô Thị Tƣờng Châu, Nguyễn Thị Mai Lƣơng, Phùng Thị Ngọc Mai, Đào Văn Huy, Lê Văn Thiện (2018), “Khả chịu acid, kháng hấp thụ nhôm nấm mốc phân lập từ đất trồng chè vùng Tân Cƣơng, Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trƣờng, Tập 34, Số (2018) 1-12 [7] Phạm Văn Việt Hà (2007), “Thực trạng giải pháp chủ yếu nhằm phát triển sản xuất chè thành phố Thái Nguyên”, Luận văn Thác Sĩ Kinh Tế, Đại học Thái Nguyên [8] Nguyễn Thị Hà, Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Thanh Nhàn Đỗ Thị Cẩm Vân, Lê Thị Thu Yên (2007), “Nghiên cứu khả hấp thu số kim loại nặng (Cu2+ Pb2+, Zn2+) nƣớc nấm men Saccharomyces Cerevisiae”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 (2007) 99-106 [9] Bùi Huy Hiền (2012), “Phân hữu sản xuất nông nghiệp bền vững việt nam”, Tổng biên tập Tạp chí Nơng nghiệp PTNT [10] Phan Quốc Hƣng, Nguyễn Hữu Thành, Lê Nhƣ Kiểu, Nguyễn Viết Hiệp (2010), “Tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm rễ Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) có khả chuyển hóa, hấp thụ Cu, Pb, Zn cao để cải tạo đất ô nhiễm kim loại nặng”, Tạp chí Khoa học phát triển 2010: Tập 8, số 5: 832 – 842 [11] Lê Vũ Tuấn Hùng (2018), “Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM kính hiển vi điện tử quét SEM”, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP HCM [12] Nguyễn Thị Thanh Mai, Chu Đức Hà, Phạm Phƣơng Thu, Nguyễn Văn Giang (2017), “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên” [13] Nghiêm Ngọc Minh, Lê Thị Nhi công (2013), “Khả hấp thụ kim loại vi sinh vật hiếu khí”, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học 11(3): 417424, 2013 [14] Nguyễn Thu Thủy Nhật (2012), “Vài nét thị trƣờng chè tình hình sản xuất, chế biến, xuất mặt hàng Việt Nam năm gần đây”,Khóa luận tốt nghiệp [15] Đặng Diệp Yến Nga, Phạm Thị Kim Trong (2015), “Đánh giá ảnh hƣởng vi sinh vật hệ rễ lên khả hấp thu đồng (Cu) đất cỏ đậu” Phát triển Khoa học & Công nghệ, Tập 18, Số 6-2015 [16] Văn Hữu Tập (2016), “Nguyên nhân gây suy thoái đất trồng chè Việt Nam” [17] Trần Thị Bảo Thoa (2014), “Tình hình phát triển chè tỉnh Yên Bái”, Khóa luận tốt nghiệp [18] Trần Đình Tuấn (2007), “Đánh giá hiệu kinh tế sản xuất chè hộ nông dân địa bàn huyện văn chấn Yên Bái”, Luận văn Thạc Sĩ Kinh Tế [19] Nguyễn Minh Tuấn ( 2017), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng tới trình tổng hợp polyme siêu thấm từ rơm rạ”, Khoa Công nghệ Mơi trƣờng - Trƣờng Đại học Cơng nghiệp Việt Trì - Khoa Ngoại ngữ - Trƣờng Đại học Công nghiệp Việt Trì Tài liệu Tiếng Anh [20] Brunker RL and Bott TL (1974), “Reduction of mercury to the element state by a yeast”, Appl Microbiol., 27, pp 870 – 873 [21] Chunlei Li, Yuqing Chenb, Wuhan, People’s Republic of China (2018), “Effects of external calcium on the cell ultrastructure of tea plants under aluminium and fluoride stress”, Research reportFluoride51(3)243– 251July-September2018 [22] Dragana Krstic Ivica Djalovic, Dragoslav Nikezic, Dragana Bjelic ( 2012) “Aluminium in Acid Soils: Chemistry, Toxicity and Impact on Maize Plants”, ISBN 978-953-307-887-8 Hard cover, 270 pages Publisher InTech Published online 20, January, 2012 Published in print edition January, 2012 [23] Gadd GM and Griffiths AJ (1978), “Microorganisms and Heavy metal Toxicity”, Microb Ecol., 4, pp 303 – 317 [24] Gadd GM (1992), “Metals and microorganisms: a problem of definition”, FEMS Microbiol Lett., 100, pp 197 – 204 [25] Gibbs (2016), “Global tea market report "The 7th North American Tea Workshop is held at Niagara Falls, Ontario [26] Kikuchi T (1965), “Studies on the pathway of sulphide production in a copperadapted yeast”, Plant Cell Physiol., 6, pp 195 – 210 [27] Kochian, K V (1995) Cellular mechanisms of aluminium toxicity and resistance in plant Annu Rev Plant Physiol Mol Biol., 46, 237-260 [28] Kanazawa.S, Kunito.T (1996),“Preparation of pH 3.0 agar plate, enumeration of acid-tolerant and Alresistant microor- ganisms in acid soils”, Soil Sci.Plant Nutr., 42 (1996) 165-173 [29] Keith Seifert (2014), “Genome Penicillium janthinellum” [30] Lansing MP, John PH, and Donald AK (2001), “Microbiology”, 5th ed., International Edition ISBN 0-07-112259-1, pp.123-125 [31] Murata K, Fukuda Y, Shimosaka M, Wantanabe K, Saikusa T, and Kimura A (1985), “Phenotypic character of the methylglycoxal resistance gene in Saccharomyces cerevisae: expression in Escherichia coli and application to breeding wild-type yeast strains”, Appl Environ Microbiol., 50, pp 1200 – 1207 [32] Nguyen VAT, Senoo K, Mishima T, and Hisamatsu M (2001), “Multiple Tolerance of Rhodotorula ghtirtis R-1 to Acid, Aluminum Ion and Manganese Ion, and Its Unusual Ability of Neutralizing Acidic Medium”, J Biosci Bioeng., 92(4), pp 366-371 [33] Ngo Thi Tuong Chau, Le Van Thien, Shunjiro Kanazawa (2014), “Identification and characterization of acidity-tolerant and aluminumresistant bacterium isolated from tea soil”, African Journal of Biotechnology, Vol 13(27) 2715-2726 [34] Neha A Gurave, Vrishali V Korde, Snehal S Dhas and Mahesh Disale (2015), “Isolation and identification of heavy metal resistant bacteria from petroleum soil of Loni, Ahmednagar”, European Journal of Experimental Biology, 2015, 5(12):6-11 [35] Pierluigi Barone, Daniele Rosellini, Peter LaFayette, Joseph Bouton, Fabio Veronesi, Wayne Parrott (2008), “Bacterial citrate synthase expression and soil aluminum tolerance in transgenic alfalfa”, Plant Cell Rep (2008) 27:893–901 DOI 10.1007/s00299-008-0517-x [36] Ross IS (1975), “Some effects of heavy metals on fungal cells”, Trans Br Mycol Soc., 64, pp 175 – 193 [37] Robert LT (2000), Soil Microbiology 2nd ed., John Wiley& Sons, Inc, pp 149-150 [38] Scott JA and Palmer S J (1988), “Cadmium bio-sorption by bacterial exopolysaccharide”, Biotechnol Lett., 10, pp 21 – 24 [39] Silver S, Nucifors G, Chu L, and Misra TK (1989), “Bacterial resistance ATPases: Primary pumps for exporting toxic cations and anions”, Trends Biochem Sci., 14, pp 76 – 80 [40] Silver S and Phung LT (1996), “Bacterial heavy metal resistance: new surprises”, Annu Rev Microbiol., 50, pp 753 – 789 [41] Shilpi Mittal Jean Marie Meyer, Reeta Goel (2003), “Isolation and Characterization of Aluminium and Copper Resistant 'P' Solubilizing Alkalophilic Bacteria”, Indian Journal of Biotechnology Vol October 2003, pp 583-586 [42] Sanjib Kumar (2009), “Aluminum stress signaling in plants”, Assam (Central) University; Department of Life Science; Dargakon, Received 2009 Apr 14; Accepted 2009 Apr 28 [43] Scan (2011), “Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the Safety of Use of Bacillus Species in Animal Nutrition, “European Commission Health & Consumer Protection Diroectorate – General., 2002 [44] Tonomura K, Maeda K, and Futai F (1968), “Studies on the action of mercuryresistant microorganisms on mercurials II The vaporization of mercurials stimulated by mercury-resistant bacterium”, J Ferment Technol., 46, pp 685 – 692 [45] Wang.X, Liao.G, Huang.S , Wu.J, Isolation, Identification and characterization of two aluminum- tolerant fungi from acidic red soil, Indian J Microbiol.56(3) (2016) 344-352 [46] Yi Li (2017), “Isolation, identification of an aluminum-tolerant strain and its tolerance characteristics”, Advances in Engineering Research, volume 120 Trang Web [47] http://hpstic.vn:96/ImageDatas/Post/file/77834-ntm.00179_voi-giup-giamdo-chua-man-cua-dat.pdf