Luận văn tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 15T 15T LỜI CÁM ƠN 15T T MỤC LỤC 15T T DANH MỤC VIẾT TẮT 15T 15T MỞ ĐẦU 15T T Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15T 15T 1.1 NS hệ sinh thái RNM 15T 15T 1.1.1 Giới thiệu RNM T 15T 1.1.2 Đặc điểm sinh học NS RNM T T 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái T 15T 1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản T 15T 1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa T T 1.1.2.4 Đặc điểm phân loại nấm sợi T T 1.1.2.5 Vai trò NS hệ sinh thái RNM T 1.2 T Chitin chitinase 10 15T 15T 1.2.1 Nguồn chitin: 10 T 15T 1.2.2 Chitinase 13 T 15T 1.2.2.1 Nguồn chitinase: 13 T 15T 1.2.2.2 Cơ chế hoạt động: 13 T 15T 1.2.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase: 14 T T 1.2.2.4 Tính chất sinh hóa chitinase 14 T T 1.2.2.5 Phân loại chitinase 15 T 15T 1.2.2.6 Ứng dụng chitinase 16 T 15T 1.2.3 NS với khả sinh enzyme chitinase 19 T T 1.2.3.1 Một số chủng NS có HT chitinase cao 19 T T 1.2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp chitinase NS 20 T T 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitinase nước 21 15T T 1.3.1 Ngoài nước 21 T 15T 1.3.2 Trong nước 24 T 15T Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 15T T 2.1 Vật liệu 25 15T T 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 T 15T 2.1.2 Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ 25 T T 2.1.3 Môi trường 26 T 15T 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 15T 15T 2.2.1 Phương pháp kích hoạt giống 27 T T 2.2.2 Phương pháp bảo quản nấm sợi 27 T T 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại NS 28 T T 2.2.4 Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5] 28 T T 2.2.5 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng KL 29 T T 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS MT bán rắn thu enzyme chitinase 29 T T 2.2.7 Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy 29 T T 2.2.8 Phương pháp xác định sơ khả tổng hợp enzyme chitinase cách đo đường T kính vịng phân giải 30 15T 2.2.9 Phương pháp xác định HT enzyme chitinase phương pháp so màu 30 T T 2.2.10 Phương pháp định lượng protein [8] 33 T T 2.2.11 Khảo sát MT điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase chủng T NS [4], [10], [23], [32], [33] 35 15T 2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon MT nuôi cấy 35 T T 2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy 35 T T 2.2.11.3 Khảo sát pH MT 35 T 15T 2.2.11.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 36 T T 2.2.11.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl 36 T T 2.2.11.6 Khảo sát hàm lượng chất chitin 36 T T 2.2.12 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P citrinum qui hoạch thực nghiệm [10], [17] 36 T T 2.2.13 Nghiên cứu đặc điểm CP chitinase thô từ chủng P citrinum [4], [43], [44] 39 T T 2.2.13.1 Thu nhận tủa protein 39 T 15T 2.2.13.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên HT CPE chitinase thô [9] 39 T T 2.2.13.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên HT chitinase 39 T T 2.2.14 Phương pháp khảo sát khả kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani T chế phẩm enzyme chitinase [4], [20] 40 T 2.2.15 Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm T [4], [46] 41 T Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 15T T 3.1 Khảo sát khả sinh enzyme chitinase số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ 15T 42 3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân loại chủng thu 43 15T T 3.2.1 Chủng nấm số 16 43 T 15T 3.2.2 Chủng nấm số 10 45 T 15T 3.3 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase 15T chủng NS P citrinum A protuberus 47 T 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn C MT nuôi cấy 47 T T 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 48 T T 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ MT nuôi cấy 51 T T 3.3.6 Ảnh hưởng HL chitin MT nuôi cấy 53 T T T 3.3.7 Kết qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện ni cấy ảnh hưởng đến khả T sinh tổng hợp chitinase chủng P citrinum 55 T 3.4 Nghiên cứu đặc điểm CP chitinase thô từ chủng P citrinum 58 15T T 3.4.1 Thu nhận CP chitinase thô muối (NH ) SO 58 T R R R R R R1 T 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên HT CP chitinase 58 T T 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên HT CPE chitinase thô 60 T T 3.5 Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thơ để phịng trừ nấm hại trồng 62 15T T 3.5.1 Ứng dụng CPE chitinase thơ vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani 62 T T 3.5.2 Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm 64 T T Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 15T T 4.1 Kết luận 66 15T T 4.2 Kiến nghị 67 15T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 15T 15T PHỤ LỤC 74 15T T PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE 74 15T T PHỤ LỤC – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD 75 15T T PHỤ LỤC CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM 76 15T T PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH 77 15T 15T PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG NS NGHIÊN CỨU 79 15T T DANH MỤC VIẾT TẮT BT: bào tử BSA: Bovine serum albumin CPE: chế phẩm enzyme DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit HT: hoạt tính HTC: hoạt tính chung HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lượng KL: khuẩn lạc MT: môi trường NC: nuôi cấy OD: mật độ quang ∆OD: hiệu số mật độ quang mẫu đối chứng mẫu thật PTHQ: phương trình hồi qui RNM: rừng ngập mặn U: đơn vị hoạt độ enzyme TTN: thuốc trừ nấm MỞ ĐẦU RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, điều kiện khí hậu khắc nghiệt làm cho sinh vật, NS có tính thích nghi cao tạo sản phẩm trao đổi chất đặc biệt so với điều kiện khác Hệ vi sinh vật đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… chất kháng sinh để phân hủy chất có hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm Một nguồn rác thải dồi RNM loại vỏ động vật chân khớp biển như: tơm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu chitin Chitin chất khó phân hủy Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác để phân hủy chitin chi phí cao Hiện người ta nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm… có enzyme chitinase vi sinh vật tổng hợp đặc biệt nấm tổng hợp có HT cao, ổn định với nhiệt độ pH Ngoài enzyme chitinase cịn có nhiều ứng dụng nơng nghiệp, cơng nghiệp y học Khả khử chitin làm cho chitinase có giá trị phịng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT Chitinase khai thác sử dụng tác nhân phịng trừ sinh học Chúng có vai trị quan trọng hình thành thể ngun sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất chitooligosaccharid hoạt hóa Trong vitro thí nghiệm thử HT kháng nấm cách sử dụng Trichderma harzianum làm phân hủy thành tế bào nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides Vì lý thực đề tài: “Tuyển chọn số chủng NS từ RNM Cần Giờ có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase cao” Mục tiêu đề tài: Góp phần tìm hiểu đặc điểm vai trò enzyme chitinase từ chủng NS có nguồn gốc từ RNM Cần Giờ làm sở cho việc ứng dụng thực tiễn Nhiệm vụ đề tài Khảo sát khả sinh enzyme chitinase chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM Chọn chủng có khả sinh enzyme chitinase cao Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại đến loài chủng thu Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase chủng NS chọn Chọn chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm Thu nhận nghiên cứu số đặc điểm CPE chitinase thô Bước đầu thử nghiệm tác dụng chế phẩm chitinase thô phòng trừ nấm bệnh hại trồng Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu nội dung PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM Nghiên cứu nội dung Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp HCM Nghiên cứu nội dung 3,4,5 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Đề tài tiến hành thời gian từ tháng năm 2011 đến tháng năm 2011 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NS hệ sinh thái RNM 1.1.1 Giới thiệu RNM * Giới thiệu chung RNM Diện tích RNM giới khoảng 15.429.000 Khu vực châu Á có diện tích RNM lớn Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu Nước có diện tích RNM lớn châu Á Bangladet với 600.000 Việt Nam có 252.500 RNM phân bố miền: bắc, trung, nam RNM hình thành nhờ phù sa sơng với trầm tích biển thủy triều mang vào tạo thành bãi lầy RNM chịu tác động biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật đa dạng phong phú tác động làm cho sinh vật có chế tồn đặc biệt RNM có vai trò quan trọng: Hạn chế tác hại song thần bão lớn, bảo vệ đê biển, làm chậm dòng chảy phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao sóng triều cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối MT, hạn chế xâm nhập mặn bảo vệ nước ngầm, làm MT nước có lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu lợi ích người * Giới thiệu RNM Cần Giờ - Tp HCM RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sơng Đồng Nai – Sài Gịn, nằm cửa ngõ đơng nam thành phố Hồ Chí Minh Thuộc xã Long Hịa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh RNM có khí hậu nóng ẩm, lượng mưa thấp Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ dao động nhiệt P P ngày 5-70C, thời điểm có nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %, P P tùy theo khu vực lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều biển đông lưu lượng nước sông Đồng Nai, sông Sài Gòn Độ mặn lớn triều cường, nhỏ triều Hệ sinh vật: thực vật 150 lồi, động vật thủy sinh khơng xương sống 700 lồi, cá 137 lồi, động vật có xương sống cạn có lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi động vật có vú, chim có khoảng 130 loài Vi sinh vật gồm nấm men, NS, vi khuẩn, xạ khuẩn… vi sinh vật có vai trị quan trọng hệ sinh thái RNM Vi sinh vật phân bố rộng rãi có mặt chất RNM Nhiều vi sinh vật có đặc tính sinh học đáng q cần khai thác nhằm phục vụ nhu cầu lợi ích người Tuy nhiên nghiên cứu vi sinh vật RNM ít, chưa tương xứng với qui mô tiềm hệ vi sinh vật RNM 1.1.2 Đặc điểm sinh học NS RNM 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái NS nhóm có cấu tạo tế bào nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngồi vào gồm: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh nhân phân hóa Tế bào nấm khơng có diệp lục tố, vài lồi nấm có rải rác tế bào loại sắc tố đặc trưng gọi neocercosporin Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh hình thành nên quan sinh sản, cuống sinh BT Từ cuống sinh BT hình thành BT tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Mỗi lồi nấm có hình dạng BT màu sắc BT có khác Chính màu sắc BT tạo nên màu sắc KL màu sắc đặc trưng chi loài nấm Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, đơi lớn tới 25µm có nhỏ 1-2µm Chiều dài sợi nấm đạt vài chục centimet Sợi nấm có vách ngăn tạo thành dạng đa bào, nhiên khả di chuyển nhân mà tế bào có một, hai nhiều nhân hay chẳng có nhân Sợi nấm khơng có vách ngăn, bên sợi nấm chứa nhiều nhân gọi tế bào đa nhân, gặp lớp Trichomycetes, Oomycetes Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh hình thành nên quan sinh sản cuống sinh BT Từ cuống sinh BT hình thành nên BT BT tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Khi BT phân tán từ thể mẹ đến nguồn chất thích hợp nảy mầm, phát triển theo chiều tạo thành hệ sợi nấm Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên nhiều tạo thành đám, ta quan sát mắt thường Hệ sợi nấm phát triển đến giai gọi KL Tùy theo loài mà KL có hình dạng khác thường có hình cầu Sau thời gian, sợi nấm khí sinh hình thành BT có hình dạng màu sắc khác đặc trưng cho loài 1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản NS có nhiều hình thức sinh sản, chủ yếu hình thức sinh sản BT Sau số hình thức sinh sản NS: Sinh sản vơ tính: Sinh sản vơ tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vơ tính BT áo, sinh sản vơ tính BT kín, sinh sản vơ tính BT đính Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính BT đảm (Basidiospore), sinh sản hữu tính BT nỗn (Oospore), sinh sản hữu tính BT tiếp hợp (Zigospore) 1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa - Sinh lí: Các lồi sinh vật nói chung NS nói riêng có sinh trưởng, phát triển đặc điểm phân bố phụ thuộc lớn vào yếu tố MT RNM hệ sinh thái chịu nhiều tác động gió bão, chịu ảnh hưởng chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp) lẫn chất thải từ MT biển…Vấn đề ô nhiễm điều tránh khỏi ô nhiễm VSV gây bệnh Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả thích nghi NS RNM Nhiệt độ: NS thuộc nhóm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 200C – 500C, cá P P P P biệt có số lồi sống sót 00C 600C P P P P pH: yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống NS, NS phát triển tốt MT axit (pH = – 6) Tuy nhiên có số loài phát triển pH < hay pH < (Ingold, 1967) pH làm thay đổi tính chất màng tế bào làm ảnh hưởng đến phân ly cấu tử thức ăn MT Do đó, hấp thu loại thức ăn vào tế bào bị thay đổi MT có pH cao hay thấp làm cho sinh trưởng NS yếu Ánh sáng: ánh sáng khơng cần cho q trình sinh trưởng hầu hết loài NS, ánh sáng lại ảnh hưởng đến hình thành BT số lồi nấm Khí oxi: nồng độ oxi cần cho hoạt động sống NS chúng nhóm hiếu khí bắt buộc Nguồn C: thể nấm khơng có diệp lục nên khơng có khả tự dưỡng phải sống kí sinh, hoại sinh hay cộng sinh Chúng VSV dị dưỡng hóa hữu NS có khả đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau, ngồi đường đơn dễ hấp thụ glucose chúng sử dụng trực tiếp đường mantose, saccarose… Nguồn N: N đóng vai trị quan trọng việc tham gia thành phần cấu tạo protein đặc biệt enzyme NS có khả đồng hóa nguồn N hữu lẫn vô cơ, chủng NS khác có nhu cầu khác nguồn thức ăn N Độ mặn: Đa số NS RNM có khả chịu mặn cao Chúng sinh trưởng nồng độ muối từ 2% - 20% Thậm chí số NS RNM cịn sinh trưởng nồng độ muối 30% Đây đặc điểm có ý nghĩa sinh thái RNM - Sinh hóa [1] Trong q trình sinh trưởng phát triển NS tiết MT nhiều sản phẩm sắc tố, chất hữu kết tinh bề mặt sợi nấm, nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng người hệ sinh thái các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng sinh… MT sống khắc nghiệt RNM làm cho kiểu trao đổi chất chúng khác biệt so với nấm đất liền Do đó, sản phẩm trao đổi chất chúng, đặc biệt hệ enzyme mang tính chất khác lạ HT enzyme thủy phân ngoại bào NS nhóm VSV có tiềm lớn sinh enzyme thủy phân ngoại bào Đa phần enzyme dùng cơng nghiệp có nguồn gốc từ NS Cellulase: enzyme ngoại bào có khả cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid phân tử cellulose để tạo thành đơn phân glucose Cellulose thành phần chủ yếu xác thực vật enzyme có vai trị quan trọng việc phân giải hợp chất hữu tồn đọng MT Enzyme ứng dụng nhiều lĩnh vực thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm nhờ khả phân giải cellulose Những NS có khả phân giải cellulose nấm thuộc chi 11 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.27108 12 Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 1, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.200-250 13 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 14 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục 15 Phan Thị Bích Trâm (2005), Bài giảng Sinh hóa, Khoa Nơng nghiệp, Đại học Cần Thơ, tr.10-19 16 Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ, NXB Nông Nghiệp, Tp HCM, tr.9-30 17 Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr.84100 Tiếng Anh: 18 Abdel-Naby, M A., El-Shayeb, N M A., & Sherief, A A (1992) Purification and some properties of chitinase fromAspergillus carneus Applied biochemistry and biotechnology, 37(2), 141-154 19 Abeles, F B., Bosshart, R P., Forrence, L E., & Habig, W H (1971) Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves Plant Physiology, 47(1), 129 20 Baustista, V V., & Dalmacio, I F (2003) Optimization of chitinase production by Serratia marcescens LPM42 (BIOTECH 1749) and its control of Rhizoctonia solani Kuhn under laboratory conditions Philippine Agricultural Scientist (Philippines) 21 Bhushan, B (2000) Production and characterization of a thermostable chitinase from a new alkalophilic Bacillus sp BG 11 Journal of applied microbiology, 88(5), 800-808 22 Bingxin, Z Z Z M Y (1992) Studies on Chitinase Production by Marine Streptomyces Journal of Xiamen University (Natural Science), 23 Binod, P., Pusztahelyi, T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I., et al (2005) Production and purification of extracellular chitinases from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solidstate fermentation Enzyme and microbial technology, 36(7), 880-887 24 Chae, D H., De Jin, R., Hwangbo, H., Kim, Y W., Kim, Y C., Park, R D., et al (2006) Control of late blight (Phytophthora capsici) in pepper plant with a compost containing multitude of chitinase-producing bacteria BioControl, 51(3), 339-351 25 Cruz, J., Hidalgo Gallego, A., Lora, J M., Benitez, T., Pintor Toro, J A., & Llobell, A (1992) Isolation and characterization of three chitinases from Trichoderma harzianum European Journal of Biochemistry, 206(3), 859-867 26 Dahiya, N., Tewari, R., & Hoondal, G S (2006) Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied microbiology and biotechnology, 71(6), 773-782 27 Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R P., & Hoondal, G S (2005) Production of an antifungal chitinase from Enterobacter sp NRG4 and its application in protoplast production World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(8), 1611-1616 28 El-Katatny, M H., Gudelj, M., Robra, K H., Elnaghy, M A., & Gübitz, G M (2001) Characterization of a chitinase and an endo-ß-1, 3-glucanase from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii Applied microbiology and biotechnology, 56(1), 137-143 29 Escott, G M., Hearn, V M., & Adams, D J (1998) Inducible chitinolytic system of Aspergillus fumigatus Microbiology, 144(6), 1575 30 Felse, P A., & Panda, T (2000) Submerged culture production of chitinase by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors-the influence of agitator speed Biochemical engineering journal, 4(2), 115-120 31 Fenice, M., Di Giambattista, R., Raetz, E., Leuba, J L., & Federici, F (1998) Repeated-batch and continuous production of chitinolytic enzymes by Penicillium janthinellum immobilised on chemically-modified macroporous cellulose Journal of biotechnology, 62(2), 119-131 32 Ghanem, K M., Al-Fassi, F A., & Farsi, R M (2011) Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from shrimp shellfish waste by Alternaria alternata African Journal of Microbiology Research, 5(13), 1649-1659 33 Ghanem, K M., Al-Garni, S M., & Al-Makishah, N H (2010) Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus African Journal of Biotechnology, 9(32), 5135-5146 34 Gkargkas, K., Mamma, D., Nedev, G., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., et al (2004) Studies on a N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidase produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid-state fermentation Process Biochemistry, 39(11), 1599-1605 35 Gooday, G W (1995) The dynamics of hyphal growth Mycological Research, 99(4), 385-394 36 Gupta, R., Saxena, R K., Chaturvedi, P., & Virdi, J S (1995) Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis Journal of Applied Microbiology, 78(4), 378-383 37 Hou, W C., Chen, Y C., & Lin, Y H (1998) Chitinase activity of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam var Tainong 57) Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39 38 Kapat, A., Rakshit, S K., & Panda, T (1996) Optimization of carbon and nitrogen sources in the medium and environmental factors for enhanced production of chitinase by Trichoderma harzianum Bioprocess and Biosystems Engineering, 15(1), 13-20 39 Kawachi, I., Fujieda, T., Ujita, M., Ishii, Y., Yamagishi, K., Sato, H., et al (2001) Purification and properties of extracellular chitinases from the parasitic fungus Isaria japonica Journal of bioscience and bioengineering, 92(6), 544-549 40 Koga, D (2004) Application of chitinase to agriculture Bioscience, 62(8), 529-530 41 Kovacs, K., Szakacs, G., Pusztahelyi, T., & Pandey, A (2004) Production of chitinolytic enzymes with Trichoderma longibrachiatum IMI 92027 in solid substrate fermentation Applied biochemistry and biotechnology, 118(1), 189-204 42 Kumari, J A., & Panda, T (1994) Intergeneric hybridization of Trichoderma reesei QM9414 and Saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion Enzyme and microbial technology, 16(10), 870-882 43 Lee, Y G., Chung, K C., Wi, S G., Lee, J C., & Bae, H J (2009) Purification and properties of a chitinase from Penicillium sp LYG 0704 Protein expression and purification, 65(2), 244-250 44 Lee, Y S., Park, I H., Yoo, J S., Chung, S Y., Lee, Y C., Cho, Y S., et al (2007) Cloning, purification, and characterization of chitinase from Bacillus sp DAU101 Bioresource technology, 98(14), 2734-2741 45 Liu, C L., Shen, C R., Hsu, F F., Chen, J K., Wu, P T., Guo, S H., et al (2009) Isolation and identification of two novel SDS resistant secreted chitinases from Aeromonas schubertii Biotechnology progress, 25(1), 124-131 46 Lorito, M., Peterbauer, C., Hayes, C K., & Harman, G E (1994) Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination Microbiology, 140(3), 623 47 Marco, J L D., Valadares-Inglis, M C., & Felix, C R (2003) Production of hydrolytic enzymes by Trichoderma isolates with antagonistic activity against Crinipellis perniciosa, the causal agent of witches' broom of cocoa Brazilian Journal of Microbiology, 34(1), 33-38 48 Maria, G L., Sridhar, K R., & Raviraja, N S (2005) Antimicrobial and enzyme activity of mangrove endophytic fungi of southwest coast of India Journal of Agricultural Technology, 1, 6780 49 Mauch, F., Mauch-Mani, B., & Boller, T (1988) Antifungal hydrolases in pea tissue: II Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and -1, 3-glucanase Plant Physiology, 88(3), 936 50 McCormack, J., Hackett, T J., Tuohy, M G., & Coughlan, M P (1991) Chitinase production byTalaromyces emersonii Biotechnology letters, 13(9), 677-682 51 Mtui, G., & Masalu, R (2008) Extracellular enzymes from Brown-rot fungus Laetioporus sulphureus isolated from mangrove forests of Coastal Tanzania Sci Res Essay, 3, 154-161 52 Murao, S., Kawada, T., Itoh, H., Oyama, H., & Shin, T (1992) Purification and characterization of a novel type of chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22 Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 56(2), 368-369 53 Nampoothiri, K M., Baiju, T V., Sandhya, C., Sabu, A., Szakacs, G., & Pandey, A (2004) Process optimization for antifungal chitinase production by Trichoderma harzianum Process Biochemistry, 39(11), 1583-1590 54 Nawani, N N., & Kapadnis, B P (2005) Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs Process Biochemistry, 40(2), 651-660 55 Ordentlich, A., Elad, Y., & Chet, I (1988) The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii Phytopathology (USA) 56 Owhashi, M., Arita, H., & Hayai, N (2000) Identification of a novel eosinophil chemotactic cytokine (ECF-L) as a chitinase family protein Journal of Biological Chemistry, 275(2), 1279 57 Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T., & Patil, S (2005) Optimisation of process parameters for chitinase production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation Process Biochemistry, 40(9), 2962-2967 58 Pedraza-Reyes, M., & Lopez-Romero, E (1989) Purification and some properties of two forms of chitinase from mycelial cells of Mucor rouxii Journal of general microbiology, 135(1), 211 59 Rattanakit, N., Plikomol, A., Yano, S., Wakayama, M., & Tachiki, T (2002) Utilization of shrimp shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a culture based on chitinase formation which is necessary for chitin-assimilation Journal of bioscience and bioengineering, 93(6), 550-556 60 Rattanakit, N., Yano, S., Plikomol, A., Wakayama, M., & Tachiki, T (2007) Purification of Aspergillus sp S1-13 chitinases and their role in saccharification of chitin in mash of solid-state culture with shellfish waste Journal of bioscience and bioengineering, 103(6), 535-541 61 Rodriguez, J., Copa Patiño, J L., & Pérez Leblic, M I (1995) Purification and properties of a chitinase from Penicillium oxalicum autolysates Letters in applied microbiology, 20(1), 46-49 62 Samson, R A., Hoekstra, E S., & Frisvad, J C (2004) Introduction to food-and airborne fungi: Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) 63 Stoyachenko, I A., Varlamov, V P., & Davankov, V A (1994) Chitinases of Streptomyces kurssanovii: purification and some properties Carbohydrate polymers, 24(1), 47-54 64 Swiontek-Brzezinska, M., Lalke-Porczyk, E., & Donderski, W (2007) Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons Oceanological and Hydrobiological Studies, 36(3), 101-111 65 Takahashi, M., Tsukiyama, T., & Suzuki, T (1993) Purification and some properties of chitinase produced by Vibrio sp Journal of fermentation and bioengineering, 75(6), 457-459 66 Tao, Y., Long, Z., Xie, J., Jin, H., Ran, H., Tao, K., et al (2005) Identification of a chitinase producing bacterium C4 and histopathologic study on locusts Pest management science, 61(2), 159-165 67 Vyas, P., & Deshpande, M (1991) Enzymatic hydrolysis of chitin by Myrothecium verrucaria chitinase complex and its utilization to produce SCP Journal of General and Applied Microbiology, 37(3), 267-275 68 Wang, S L., & Hwang, J R (2001) Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of chitinases Enzyme and microbial technology, 28(4-5), 376-382 PHỤ LỤC PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1 Đường chuẩn Glucosamine có nồng độ từ – µmol/ml ống số Nồng độ 0.5 1,0 1.5 2,5 3,0 3,5 4,0 OD 535nm 0,121 0,198 0,342 0,477 0,610 0,767 0,956 1.094 1,174 ∆OD 0,077 0,221 0,356 0,489 0,646 0,835 0,973 1.053 Gucosamin (µmol/ml) R y 1.2 Linear (y) y = 0.2806x-0,0447 R2 = 0.997 ∆OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 hàm lượng Glucosamine (µmol/ml) Đồ thị P.1 Đưởng chuẩn biểu diễn mối tương quan ∆OD HL Glucosamine PHỤ LỤC – LẬP ĐƯỜNG CHUẨN BRADFORD Bảng P.2 Đường chuẩn BSA thể mối tương quan tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thu (OD) bước sóng 595nm Ống nghiệm 10 20 30 40 50 0,0705 0,187 0,354 0,5095 0,654 0,7575 Hóa chất Nồng (µg/ml) ∆OD độ BSA 0.9 y = 0.0026x + 0.0174 R = 0.9921 0.8 OD 595 nm 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (ug/ml) Đồ thị P.2 Đường chuẩn BSA thể mối tương quan tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với độ hấp thu (OD) bước sóng 595nm PHỤ LỤC CÁCH PHA DUNG DỊCH ĐỆM Thể tích (ml) pH đệm Citric 0.1M Na2HPO4 NaH2PO4 0.2M 0.2M Glycin 0.2M V đệm NaOH 0,2M 0,1M H20 39.4 10.2 50.4 100 3.5 33.9 16.1 50 100 30.7 19.3 50 100 4.5 26.7 23.3 50 100 24.3 25.7 50 100 5.5 21 30.3 50 100 12.3 87.7 100 200 6.5 31.5 68.5 100 200 61 39 100 200 7.5 84 16 100 200 94.7 5.3 100 200 8.5 50 146 200 50 12 138 200 9.5 50 22.4 127.6 200 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH Hình P.4.1 Dịch huyền phù bào tử NS P citrinum Hình P.4.2 Dịch enzyme thô trước ly tâm P citrinum nuôi MT khác Hình P.4.3 Hiện màu thuốc thử DNS ống thử không 11 ống thử thật TN tối ưu hóa MTNC NS P citrinum (từ trái sang phải) Hình P.4.4 Hiện màu thuốc thử Bradford ống đối chứng ống mẫu TN khảo sát nhiệt độ MTNC nấm A protuberus (từ trái sang phải) PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG NS NGHIÊN CỨU ... sát khả sinh enzyme chitinase chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM Chọn chủng có khả sinh enzyme chitinase cao Nghiên cứu đặc điểm sinh. .. khuẩn, nấm? ?? có enzyme chitinase vi sinh vật tổng hợp đặc biệt nấm tổng hợp có HT cao, ổn định với nhiệt độ pH Ngoài enzyme chitinase cịn có nhiều ứng dụng nơng nghiệp, công nghiệp y học Khả khử... (2003) khảo sát số yếu tố tác động trình sinh tổng hợp hệ enzym chitinase chủng nấm mốc Trichoderma spp Tô Duy Khương (2004) khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm