Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA A[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS BÙI MINH TRÍ VÕ CƠNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM TẠ Khơng ngơn từ nói hết tình yêu dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy sinh tất Cảm ơn anh em, ngƣời tạo động lực cho tiến lên Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt bốn năm học Ban chủ nhiệm Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học động viên, giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Thầy Bùi Minh Trí tận tình dẫn em suốt q trình thực khóa luận Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa anh chị Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng động viên, giúp đỡ em q trình thực khóa luận Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thu thập mẫu Anh Bình, anh Kiệt anh phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ tận tình giúp đỡ em trình thu thập mẫu Xin cảm ơn bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt bốn năm đại học Chân thành cảm ơn! Võ Công Danh iii TĨM TẮT VÕ CƠNG DANH, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 “HỒN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có giá trị kinh tế môi trƣờng Việc nghiên cứu đa dạng di truyền đƣớc đôi cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý phát triển khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học Những kết đạt đƣợc Thu thập đƣợc 40 mẫu đƣớc với đặc điểm hình thái khác Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu đƣớc Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ đƣớc Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho đƣớc Kết thực phản ứng RAPD với primer OPAC10 10 mẫu kết thu đƣợc band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7% Phân tích kết RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết nhƣ sau: mẫu đƣớc trồng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00 Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên khoảng 0,50 – 0,83 Các mẫu đƣớc nguồn gốc chỗ đƣợc trồng năm 1991 trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền 0,50 Những đƣớc đôi nguồn giống chỗ nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền thấp từ 0,33 đến 0,67 iv SUMMARY VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007 “DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR” Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp forest eco-conservation area has a high economic and environmental value Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way Obtained results were: Collected 40 samples of Rhizophora apiculata Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got polymorphic bands (100 – 600kb) and monomorphic band (170 kb) which made up 83,3 percents and 16,7 percents of bands Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results: Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00 Compare R apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83 The similarity of local R apiculata and the one planted in 1991 or in 1996 is 0,50 While the local R apiculata and the one from Camau plants had long distance from 0,33 to 0,67 v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ xi Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu, giới hạn đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2 Cấu trúc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Vai trò khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2 Đặc điểm sinh vật học hình thái học đƣớc đôi 2.2.1 Hình thái học 2.2.2 Phân bố 2.2.3 Vai trò rừng đƣớc 2.3 Quy trình ly trích DNA thực vật 2.3.1 Đánh giá chất lƣợng DNA 11 vi 2.4 PCR (Polymerase chain reaction) 12 2.4.1 Khái niệm 12 2.4.2 Nguyên tắc 13 2.4.3 Ứng dụng 13 2.4.4 Ƣu nhƣợc điểm 13 2.5 Đa dạng di truyền 14 2.5.1 Khái niệm 14 2.5.2 Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14 2.6 Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15 2.6.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16 2.6.2 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17 2.6.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18 2.6.4 Một số nghiên cứu thị phân tử đƣớc 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.1.1 Thời gian thực 22 3.1.2 Địa điểm thực 22 3.2 Vật liệu thí nghiệm 22 3.1.2 Mẫu đƣớc đôi 22 3.2.2 Hố chất thí nghiệm 23 3.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm 24 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 25 3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA 25 3.3.3 Kiểm tra kết ly trích 28 3.3.4 Kỹ thuật RAPD 30 vii 3.3.5 Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền phần mềm NTSYS 34 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết thu thập mẫu đƣớc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 36 4.2 Bảo quản mẫu .36 4.3 Hồn thiện quy trình ly trích DNA .37 4.4 Kết phản ứng RAPD – PCR 44 4.4.1 Thí nghiệm 44 4.4.2 Thí nghiệm 45 4.4.3 Thí nghiệm .45 4.4.4 Thí nghiệm 46 4.4.5 Thí nghiệm 47 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận .51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIÊU THAM KHẢO 53 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 54 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine bp: Base pair CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide dNTP: Deoxynucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EB: Extraction Buffer EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid ng: Nanogram OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA TE: Tris EDTA Tm: Melting temperature UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UBND: Ủy ban Nhân dân UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 2.2 Nguyên tắc kỹ thuật RAPD 19 Hình 3.1 Lá, hoa, trái đƣớc đôi 23 Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu đồ Cần Giờ 36 Hình 4.2 DNA tổng số mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình ) 40 Hình 4.3 DNA tổng số mẫu đƣớc (Lá già non) thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3) 40 Hình 4.4 DNA tổng số 17 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.5 DNA tổng số pha lỗng 17 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ thí nghiệm 45 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 thí nghiệm 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm primer OPAC10 VÀ OPA10 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR 10 mẫu đƣớc thí nghiệm 47 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền 10 mẫu đƣớc thu thập khu dự trữ sinh ngập mặn Cần Giờ 48 x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Phân tách đoạn DNA gel theo kích thƣớc 12 Bảng 2.2 Các loại thị phân tử sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 15 Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD 30 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng phản ứng RAPD 31 Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 32 Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nồng độ primer đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 33 Bảng 3.5 Thực phản ứng RAPD với primer OPA10 OPAC10 33 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng phản ứng RAPD 33 Bảng 4.1 Bảng giá trị OD mẫu đƣớc (Lá non già) thu thập khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực phản ứng PCR với thị phân tử RAPD 42 Bảng 4.2 Bảng giá trị OD 10 mẫu đƣớc dùng để thực phản ứng PCR với thị phân tử RAPD 43 Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ đƣớc đơi theo quy trình 39 xi 50 Từ kết thu đƣợc gel điện di chúng tơi mã hóa thành dạng nhị phân để phân tích mối tƣơng quan di truyền mẫu nghiên cứu phần mềm NTSYS phiên 2.1 cho kết nhƣ sau: Mƣời mẫu đƣớc đƣợc chia thành nhóm Nhóm I chủ yếu mẫu đƣớc có nguồn giống từ Cà Mau (Trừ B12) bao gồm mẫu: A1, A4, A8,A12,B1, B4, B16, B12 Nhóm II có mẫu đƣớc có nguồn giống chỗ B8 Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 (A1, A4, B4, A8), có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00 Các mẫu A1, A4, B4 có độ tƣơng đồng di truyền nhƣ Mẫu A8 có khác biệt di truyền so với mẫu A1, A4, B4 Các mẫu đƣớc trồng năm 1980 (A12, A16, B1, B16) có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – đến 1,00 Mẫu B16 có khác biệt di truyền so với A12, A16, B1 nhƣng mức độ tƣơng đồng di truyền cao Điều hợp lý nguồn để tái tạo rừng ngập mặn Cần Giờ từ năm 1978 đến 1983 lấy từ rừng ngập mặn Cà Mau Những đƣớc đôi trồng năm 1978 năm 1980 có mức độ di truyền biến thiên khoảng 0,50 – 0,83 Sự khác biệt di truyền vị trí, lai tạo thụ phấn chéo đƣớc đôi Cà Mau Các mẫu đƣớc nguồn gốc chỗ đƣợc trồng năm 1991 (B12) trồng năm 1996 (B8) có hệ số đồng dạng di truyền 0,50 Những đƣớc đôi trồng từ nguồn giống chỗ (B12, B8) trồng từ nguồn giống từ Năm Căn (Cà Mau) có hệ số đồng dạng di truyền thấp từ 0,33 đến 0,67 Đây kết trình lai tạo thụ phấn chéo đƣớc đôi Càng sau hệ số đồng dạng di truyền đƣớc đơi giảm Qua phân nhóm di truyền sử dụng đƣớc đơi nhóm I lai tạo với đƣớc đơi nhóm II tạo quần thể đa dạng nguồn gen đƣớc có khoảng cách di truyền xa khả tạo lai có nhiều tính trạng cao 51 Hầu hết quần thể đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc trồng từ năm 1978 đến năm 1983 nguồn giống trồng rừng trái đƣớc đƣợc thu mua Cà Mau (Hệ số đồng dạng di truyền từ 0,5 đến 1,00) Cần gia tăng tính đa dạng di truyền quần thể đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ cách: trồng xen có bố mẹ đƣợc trồng năm 1996 đƣớc đƣợc lai tạo từ nhóm I nhóm II vào khu rừng đƣớc có nguồn gốc từ Cà Mau Bên cạnh đó, tạo đƣớc lai loài đƣớc (Rhizophora apiculata, Rhizophora mucronata, Rhizophora stylosa) để nâng cao tính đa dạng di truyền quần thể đƣớc Song song việc gia tăng tính đa dạng di truyền cần có chiến lƣợc bảo tồn phát triển nguồn gen quần thể đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng ta phải ln chăm sóc rừng đƣớc phù hợp với cấp tuổi, cấp đất giải pháp kỹ thuật lâm sinh quản lý thích hợp, cụ thể cho tiểu khu Mặt khác bƣớc tiến hành trồng xen đƣớc lai vào khu rừng đƣớc trồng để sau 10 đến 15 năm tới tạo đƣợc đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững 52 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, rút số kết luận nhƣ sau: Mẫu đƣớc bảo quản lâu điều kiện -200C Tuy nhiên để ly trích cho kết tốt sau cân mẫu phải nhanh chóng cho vào nitơ lỏng Sử dụng đƣớc non để ly trích thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt Quy trình ly trích DNA đƣớc ổn định Tỷ lệ mẫu tinh đạt đến 65% tổng số mẫu ly trích Primer OPAC10 có tính đa hình quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Với việc phân tích RAPD sử dụng primer OPAC10 quần thể đƣớc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền phát sinh chủng loại dao động khoảng 0,33 – 1,00 5.2 Đề nghị Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 để đánh giá tính đa dạng di truyền với lƣợng mẫu lớn quần thể đƣớc Khảo sát thêm primer khác nhằm có đƣợc kết đa dạng di truyền xác Tách riêng band 170 bp thực phản ứng RAPD với primer OPAC10 để giải trình tự nhằm phục vụ cho việc phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với loài khác thuộc họ Rhizophorceae rừng ngập mặn Phải có sách làm giàu nguồn tài ngun di truyền, nâng cao tính đa dạng bảo đảm phát triển bền vững khu dự trữ sinh rừng 53 ngập mặn Cần Giờ nói chung quần thể đƣớc đơi (Rhizophora apiculata Blume) nói riêng Nghiên cứu thêm đƣớc đơi có hình thái khác lạ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Tại khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ cịn có lồi có tên địa phƣơng đƣớc râu với đặc điểm hình thái khác so với giống đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) Do vị trí phân bố đƣớc râu xa (Thuộc tiểu khu 14) nên chúng tơi chƣa có điều kiện lấy mẫu nghiên cứu Hiện chƣa xác định đƣợc tên khoa học xác lồi Vì đề nghị nghiên cứu đƣớc râu để có khả phát đƣợc lồi Việt Nam Do nên trồng xen có nguồn giống chỗ vào khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ tạo đƣợc đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Việt Nam Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Trang 24-30; 122-124 Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất giáo dục TP Hồ Chí Minh 612 trang Lê Văn Khôi ctv, 2006 Khôi phục phá triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành Phố Hồ Chí Minh Nhà xuất nơng nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất nông nghiệp Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất nơng nghiệp Lê Đình Lƣơng, 2001 Ngun lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất khoa học kỹ thuật Lâm Vỹ Nguyên, 2006 Nghiên cứu đa dạng di truyền đƣớc đôi Rhizophora apiculata Blume Khu Dự trữ Sinh rừng ngập mặn Cần Giờ kỹ thuật RAPD Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Việt Nam 10 Lê Duy Thành, 2001 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội 159 trang 55 11 Nguyễn Đức Thành, 2004 Một số kỹ thuật thị phân tử Nhà xuất Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 12 Akira Komiyama, 1998 Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R mucronata) seedlings in the field condition Forest Ecology and Management, 112 (1998) p 227 – 231 13 Bo Christensen, 1978 Biomass and primary production of Rhizophora apiculata Bl In a mangrove in Southern Thailand Aquatic Botany, (1978) p 43 – 52 14 Madasamy Parani, 1997 Molecular Phylogeny of mangroves III Parentage analysis of a Rhizophora hybrid using Random Amplified Polymorphic DNA and Restriction Fragment Length Polymorphism markers Aquatic Botany 58 (1997) p 165-172 15 Mukkamala Lakshmi, 2002 Molecular phylogeny of mangroves IX Molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae Aquatic Botany, 74 (2002) p 201 – 217 16 F James rohlf, 2000 NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Department of Ecology and Evolution State University of New york Website: 17.http://.avery.rutgers.edu/wssp/studentscholars/project/archives/onions/rapd.html 18.http://www.nea.gov.vn/html/ddsh/dulieu1/khainiem/khai_niem_da_dang_ditruyen htm PHỤ LỤC Phụ lục Cơng dụng cách pha hóa chất ly trích DNA HĨA CHẤT CƠNG DỤNG CÁCH PHA CTAB Phá vỡ màng tế bào, Hòa tan nƣớc cất lần (C19H42NBr, màng nhân 65oC Tủa DNA nồng độ Dung dịch gốc M=364,5 g/mol) Ethanol 100% muối Sodium acetate cao nhiệt độ thấp Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ thể tích ethanol 100% thể tích nƣớc cất lần hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA nhiệt độ Dung dịch gốc thấp, không cần muối Sodium Acetate Chloroform Biến tính protein Dung dịch gốc sắc tố có mẫu Tách lớp sau ly tâm Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt Dung dịch gốc trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Hỗn hợp Biến tính protein Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform:Isoamyl sắc tố mẫu Tách Chloroform thể tích Isoamyl Alcohol (24:1) lớp sau ly tâm, DNA Alcohol đƣợc phóng thích nằm pha nƣớc lớp EDTA 0,5M Gắn nối ion hóa trị II ++ ++ Pha 100ml: (C10H14N2Na2O3, (Mg , Ca …) có - 18,622 g bột EDTA + 80ml M=372,54 g/mol) dịch ly trích, ngăn chặn nƣớc cất lần Khuấy tan hoạt động - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc enzyme phân hủy DNA cất lần cho đủ 100ml Các enzyme hoạt động mạnh có có mặt ion hóa trị II ion Mg++ Tris-HCl 1M Dung dịch đệm, đảm bảo (C4H12ClNO3, M=157,6 mơi trƣờng ly trích ổn g/mol) định pH8 Ở độ pH DNA ổn định Pha 100ml: - 15,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất lần Khuấy tan - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất lần cho đủ 100ml NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất lần Khuấy tan TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất lần TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất lần + 2g CTAB (lắc nhẹ bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt) - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol - Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Sodium Acetate 3M Dung dịch đệm, làm tăng Pha 100ml: (CH3COONa, M=82 lực ion dịch trích, g/mol) tạo điều kiện thuận lợi 100ml nƣớc cất lần cho DNA kết tủa với Khuấy tan - 24,6g bột Sodium Acetate + ethanol 100% điều kiện -20oC RNase (Ribonuclease) Enzyme thủy phân RNA (10%, w/v) có dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất lần - Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc Phụ lục Kết ly trích DNA từ đƣớc đơi theo quy trình A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30 Phụ lục Bảng mã hóa số liệu kết phản ứng RAPD thí nghiệm A1 A4 A8 A12 A16 B1 B4 B8 B12 B16 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 Phụ lục Ma trận hệ số di truyền 10 mẫu đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ A1 A4 A8 A12 A16 B1 B4 B8 B12 A1 1,00 A4 1,00 1,00 A8 0,83 0,83 1,00 A12 0,83 0,83 0,67 1,00 A16 0,83 0,83 0,67 1,00 1,00 B1 0,83 0,83 0,67 1,00 1,00 1,00 B4 1,00 1,00 0,83 0,83 0,83 0,83 1,00 B8 0,33 0,33 0,50 0,50 0,50 0,50 0,33 1,00 B12 0,50 0,50 0,33 067 0,67 0,67 0,50 0,50 1,00 B16 0,67 0,67 0,50 0,83 0,83 0,83 0,67 0,67 0,83 B16 1,00 Phụ lục Bảng lý lịch 40 mẫu đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Tọa độ Tên Tiểu Năm mẫu khu trồng 48p UTM A1 21 1978 0708583 1150288 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A2 17 1980 0707998 1150623 Cây cao, mọc khỏe, dày A3 17 1978 0707448 1152105 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A4 21 1978 0706752 1154072 Cây cao, ốm yếu, A5 17 1980 0706898 1156443 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A6 21 1996 0706380 1157741 Cây nhỏ, mọc tốt A7 11 1990 0705765 1158774 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A8 11 1978 0705441 1159250 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A9 11 1979 0705161 1159715 Cây cao, ốm yếu, A10 11 1991 0704781 1160407 Cây nhỏ, ốm yếu, bị mối A11 11 1978 0704086 1161940 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn A12 11 1980 0703881 1162362 Cây cao to, tƣơi tốt, dài, dày A13 10 1996 0703258 1163077 Cây nhỏ, mọc tốt A14 10 1978 0702913 1163559 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A15 10 1978 0702489 1164263 Cây cao, ốm yếu, A16 10 1980 0701380 1165102 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn A17 10 1990 0700542 1165786 Cây nhỏ, mọc tốt A18 10 1980 0700167 1167848 Cây cao, ốm yếu, A19 5B 1978 0699834 1168976 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt Đặc điểm mẫu A20 5B 1990 0700092 1171091 Cây trung bình, mọc yếu B1 10B 1980 0704654 1161886 Cây cao, ốm yếu, dây leo quấn quanh B2 10B 1978 0704353 1162004 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B3 10A 1978 0704558 1162782 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B4 10A 1978 0705498 1163894 Cây cao to, tƣơi tốt, có trái xanh, trái đỏ B5 6B 1980 0705498 1163893 Cây cao, ốm yếu, B6 6B 1996 0705911 1163727 Cây nhỏ, mọc khỏe B7 6B 1980 0706852 1163693 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn B8 6B 1996 0707424 1163700 Cây nhỏ, nhiều nhánh, tƣơi tốt B9 6B 1978 0707851 1163576 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B10 6B 1978 0708594 1163382 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B11 6B 1991 0709080 1163798 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn B12 13 1991 0709814 1164396 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn B13 1980 0710845 1165053 Cây cao, ốm yếu bị kiến, mối ăn B14 1980 0711177 1165656 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B15 1980 0711348 1166061 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B16 1980 0711394 1166150 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B17 1996 0712199 1167244 Cây nhỏ, tƣơi tốt B18 2B 1991 0713389 1168187 Cây trung bình, tƣơi tốt B19 2B 1991 0714899 1168188 Cây trung bình, mọc yếu, bị mối B20 2B 1991 0715316 1168346 Cây trung bình, tƣơi tốt Phụ lục Bảng giá trị OD 40 mẫu đƣớc đôi khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) A1 1,8254 8,2763.10-2 4,5340.10-2 360 A2 1,7382 6,6635.10-2 3,8336.10-2 160 A3 2.2164 5,6665.10-2 2,5566.10-2 260 A4 1,8169 4,2361.10-2 2,3315.10-2 180 A5 1,6352 5,6522.10-2 3,4566.10-2 230 A6 1,9506 8,6454.10-2 4,4322.10-2 380 A7 2,0552 5,6654.10-2 2,7566.10-2 260 A8 1,9412 6,2356.10-2 3,2123.10-2 280 A9 2,3884 5,6464.10-2 2,3641.10-2 270 A10 1,6005 8,5556.10-2 5,3456.10-2 350 A11 1,9624 3,6549.10-2 1,8625.10-2 160 A12 2,3116 7,9646.10-2 3,4455.10-2 380 A13 2,1261 5,6432.10-2 2,6542.10-2 260 A14 1,9046 7,3621.10-2 3,8654.10-2 320 A15 1,7051 1,9871.10-2 1,1654.10-2 80 A16 1,8646 2,6544.10-2 1,4236.10-2 120 A17 1,6287 4,6125.10-2 2,8321.10-2 190 A18 1,7719 6,4695.10-2 3,6512.10-2 280 A19 1,8514 3,2516.10-2 1,7563.10-2 140 A20 2,0082 5,3216.10-2 2,6499.10-2 240 OD260 OD280 Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) B1 2,1263 5,6423 2,6536 240 B2 1,7581 2,9856 1,6982 260 B3 1,7992 6,3251 3,5156 130 B4 1,8232 5,5654 3,0525 270 B5 2,4233 7,3216 3,0213 240 B6 1,8573 3,4589 1,8623 350 B7 2,3836 7,6542 3,2112 150 B8 1,8182 2,6665 1,4666 370 B9 1,6393 6,2314 3,8012 120 B10 1,5954 5,1245 3,2121 260 B11 1,9138 3,2316 1,6886 210 B12 1,9632 4,6525 2,3699 140 B13 1,9273 7,2316 3,7522 210 B14 1,6467 3,8123 2,3151 320 B15 2,0833 5,3215 2,5543 160 B16 1,7949 8,6554 4,8222 240 B17 1,6527 8,6321 5,2231 370 B18 2,4006 3,6521 1,5213 360 B19 2,1176 5,3621 2,5321 180 B20 1,8210 6,2137 3,4123 250 ... THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata. .. quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2 Cấu trúc khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.3 Vai trò khu dự trữ sinh rừng. .. đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” 1.2 Mục đích,