1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công ng[.]
1 Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong q trình tồn phát triển, ngƣời khơng ngừng khai thác, tàn phá tài nguyên thiên nhiên môi trƣờng Ngày nay, mở rộng phát triển khu cơng nghiệp tạo lƣợng khí thải vơ lớn, gây nhiễm khơng khí góp phần tàn phá sống trái đất Những hoạt động dần làm cân hệ sinh thái, phá hủy nguồn tài nguyên quý giá nhất, khơng thể thay giới, đa dạng sinh học - sở sống còn, thịnh vƣợng phát triển bền vững [41] Từ thực tế trên, khu dự trữ sinh đƣợc đời, nhằm thực nhiệm vụ trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh - hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo cân bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển trì giá trị văn hóa truyền thống Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ khu dự trữ sinh Việt Nam đƣợc UNESCO công nhận [22] Với cảnh quan thiên nhiên tƣơi đẹp, thành phần loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn Cần Giờ khơng rừng phịng hộ mà cịn điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mơ hình học tập nghiên cứu lý tƣởng [22], [43] Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ nguồn tài ngun vơ giá, có vai trị vị trí đặc biệt quan trọng đời sống cộng đồng dân địa phƣơng vùng phụ cận Quần thể Đƣng (R mucronata) quần thể thực vật khác góp phần điều hịa khí hậu [30], chắn gió, chống xói lở, giảm bớt xáo trộn đất đai ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng, cung cấp thức ăn cho loài động vật hoang dã hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế cho ngƣ dân [21] Nhằm đem lại hiệu kinh tế môi trƣờng cao hơn, cần lập kế hoạch phát triển lâu dài bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene mức độ đa dạng di truyền quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, có quần thể Đƣng, nhằm tìm đƣợc thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc nhanh giống Đƣng, góp phần đảm bảo cơng tác trồng phát triển rừng đạt hiệu cao Phƣơng pháp tốt đáp ứng yêu cầu sử dụng marker phân tử Đƣợc phân công Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp HCM, dƣới hƣớng dẫn Thầy TS Bùi Minh Trí chúng tơi tiến hành thực đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” 1.2 Mục đích Hồn thiện quy trình ly trích DNA Đƣng Xây dựng quy trình RAPD bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đƣng để lai tạo xây dựng tiền đề cho nghiên cứu chuyên sâu đa dạng di truyền, nhận diện thị phân tử 1.3 Yêu cầu Thu thập mẫu từ Đƣng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân to, mọc tốt, mọc yếu ớt, bị bệnh, mọc tự nhiên hay đƣợc trồng Ly trích DNA có chất lƣợng tốt làm ngun liệu cho kỹ thuật RAPD Thực kỹ thuật RAPD phân tích kết phần mềm NTSYS 2.1 1.4 Giới hạn đề tài Đề tài tiến hành nghiên cứu quần thể Đƣng số tiểu khu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh Thời gian thực ngắn Chƣa đủ điều kiện để thực nhiều thí nghiệm tối ƣu, chƣa khảo sát nhiều primer kỹ thuật RAPD nhằm đạt đƣợc kết xác Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh 2.1.1 Khái niệm chức khu dự trữ sinh Sinh lớp vỏ trái đất có sinh vật sống đó, kể đại dƣơng, ao hồ, sơng suối, đất phần dƣới khí Sinh với khí quyển, địa thủy tác động qua lại với “Hệ thống trái đất” [45] Sinh hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm hệ sinh thái nhỏ bề mặt trái đất Việc bảo tồn nguyên vẹn tất hệ sinh thái điều không thể, nên ngƣời ta lựa chọn số đại diện hệ sinh thái để bảo tồn với ý nghĩa khu dự trữ vốn gene, loài hệ sinh thái cho toàn sinh [45] Khu dự trữ sinh vùng có hệ sinh thái cạn ven biển đƣợc quốc tế cơng nhận phạm vi chƣơng trình Con ngƣời Sinh (Man and Biosphere – MAB) UNESCO, nhằm thúc đẩy trình diễn mối quan hệ ngƣời với thiên nhiên Các khu dự trữ sinh mơ hình mẫu hệ sinh thái trái đất, phịng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu giám sát hệ sinh thái đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng mà không gây hại đến môi trƣờng [45] Mỗi khu dự trữ sinh có chức [45]: Chức bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh thái cảnh quan Chức phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững sinh thái nhƣ giá trị văn hóa truyền thống Chức hỗ trợ: tạo điều kiện cho hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo dục trao đổi thông tin địa phƣơng, quốc gia, quốc tế bảo tồn phát triển bền vững 2.1.2 Tổng quan khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2.1 Điều kiện tự nhiên Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc hình thành hạ lƣu sơng Đồng Nai – Sài Gịn đổ biển Đơng cửa Xồi Rạp, Đồng Tranh vịnh Gành Rái, đồng thời nằm cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 300 km [8], [29], [44] Tọa độ địa lý [29] Vĩ độ Bắc: 10o 22’ 14” – 10o 37’ 39” Kinh độ Đông: 106o 46’ 12” – 107o 00’ 59” Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng – 11, gió hƣớng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – năm sau, gió hƣớng Đơng Nam Nhiệt độ trung bình 25,8 0C Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200 mm / năm [27] Dân số khoảng 63.000 ngƣời (2003), sống chủ yếu nghề đánh bắt nuôi trồng thủy sản Dân cƣ phân bố không địa bàn xã, phần đơng tập trung xã Bình Khánh, Long Hịa, Cần Thạnh An Thới Đơng [17] Tổng diện tích khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 75.740 (2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp Theo định hƣớng qui hoạch phát triển huyện Cần Giờ đến năm 2010, cấu đất đai giữ vai trò nồng cốt rừng phòng hộ, rừng sinh diện tích khoảng 38.000 (1993 1999) [29], mở mang thêm diện tích ni trồng thủy sản (6.990 [23]) với nguyên tắc gắn bó chặt chẽ với hệ sinh thái rừng ngập mặn Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.2.2 Chức vùng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh a Vùng lõi (4.721 ha) Vùng lõi bao gồm tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 13 Vùng đặc trƣng cho hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo kênh rạch bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao thành phần loài động vật, thực vật, vi sinh vật cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng hấp dẫn [28], [45] Các chức bao gồm: Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng rừng tự nhiên Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với môi trƣờng sống động vật hoang dã, đặc biệt chim nƣớc Bảo tồn hệ thống thủy vực, bãi bồi dọc bờ sông ven biển, nơi kiếm ăn sinh đẻ loài động vật vùng triều Tiến hành số cơng trình nghiên cứu khoa học sức bền hệ sinh thái du lịch sinh thái có giới hạn b Vùng đệm (41.139 ha) Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, tiến hành hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục giải trí nhƣng khơng ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn vùng lõi Vùng đệm bao gồm tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 23 24 Với chức phục hồi hệ sinh thái, dựa quần xã chiếm ƣu [28], [45], bao gồm: Góp phần bảo vệ chung vùng lõi khu dự trữ sinh Tạo khơng gian lớn cho thú hoang dã ngồi vùng lõi Khi khu vực trở nên ổn định, bổ sung vào vùng lõi cần thiết Tạo cảnh quan tự nhiên văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái Các mơ hình lâm ngƣ kết hợp với mơi trƣờng đƣợc ứng dụng vùng cho cƣ dân địa phƣơng c Vùng chuyển tiếp (29.880 ha) Vùng chuyển tiếp bao gồm khu vực lại huyện Cần Giờ, khu lúa nƣớc vƣờn ăn trái thảm cỏ dọc theo bờ biển Cần Thạnh, Long Thành, Lý Nhơn [28], [45] Chức vùng này: Đệm xã hội: hoạt động sản xuất vùng chuyển tiếp cung cấp loại sản phẩm dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng Việc sử dụng đất tài nguyên thiên nhiên khu vực không đƣợc mâu thuẫn với mục tiêu khu dự trữ sinh UNESCO qui định Mối quan hệ ngƣời thiên nhiên phải đƣợc hài hòa Đệm mở rộng: việc quản lý phát triển vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng khơng gian có sẵn nhƣ mơi trƣờng sống cho lồi thú hoang dã từ vùng đệm 2.1.2.3 Hệ sinh vật rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính đa dạng sinh học cao Hệ thực vật, có 158 lồi thực vật thuộc 76 họ, loài chủ yếu nhƣ Đƣớc, Bần trắng, Mắm trắng, quần hợp Đƣớc đôi - Bần trắng Xu ổi, Trang, Đƣng (Đâng hay Đƣớc xanh) loài nƣớc lợ nhƣ Bần chua, quần hợp Mái dầm – Ơ rơ, Dừa lá, Ráng Thảm cỏ biển với loài ƣu Halophyla sp., Halodule sp., Thalassia sp., đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, loại đậu, dừa, vƣờn ăn trái Thảm thực vật môi trƣờng sống cho nhiều loài động vật [29], [40], [44], theo thống kê năm 1999 nhƣ sau: Khu hệ động vật thủy sinh khơng xƣơng sống có 700 lồi thuộc 44 họ, 19 bộ, lớp, ngành Điển hình: Tơm sú (Penaeus monodon), Cua biển (Scylla serrata) Khu hệ cá có 137 lồi thuộc 39 họ, 13 Điển hình: cá Dứa (Pangasius polyurandon), cá Thịi lịi (Periophthalmus schosseri) Khu hệ động vật có xƣơng sống cạn có lồi lƣỡng thê, 31 lồi bị sát, lồi hữu nhũ Trong có 11 lồi bị sát có tên sách đỏ Việt Nam nhƣ: Tắc kè (Gekko gekko), Kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn Đất (Python molurus), trăn Gấm (Python reticulatus), rắn Cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn Hổ mang (Naja naja), rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), Vích (Chelonia mydas), cá Sấu hoa cà (Crocodylus porosus) Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 Trong có 51 lồi chim nƣớc 79 lồi khơng phải chim nƣớc sống nhiều sinh cảnh khác Điển hình nhƣ: Cị lạo Ấn Độ (Mycteria leucocephala), Choắt lớn mỏ vàng (Tringa stagnatilis) Ngày 21 / 01 / 2000, khu rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc MAB / UNESCO công nhận khu dự trữ sinh Việt Nam nằm mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh thuộc 97 quốc gia giới tính đến 10 / 2004, đồng thời khu rừng trồng giới đƣợc công nhận khu dự trữ sinh [49], [52] 2.1.3 Thực trạng rừng ngập mặn Cần Giờ Sau 29 năm tái tạo (1978 - 2007) năm khu dự trữ sinh (2000 2007), chất lƣợng rừng rừng ngập mặn Cần Giờ có chiều hƣớng giảm Sâu bệnh phát triển mạnh Đặc biệt mật độ dày, tán bao kín nhƣ công sâu bệnh thuận lợi Sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân làm cho sinh trƣởng chậm chết hàng loạt Hiện rừng Cần Giờ, khỏe bệnh sống chen [50] Ngồi ra, bịt kín bờ đê, không cho nƣớc vào tự nhiên nhƣ trƣớc nên gây tƣợng khu vực nƣớc bị tù đọng, sẫm màu, rễ ngày phát triển nên lắng tụ nhiều làm cho vùng đất gò cao Bên cạnh đó, việc xây dựng tuyến đƣờng xuyên Bắc – Nam rộng lớn nhƣ phân rừng thành khu rõ rệt tạo cách ly địa lý, nên hệ sinh thái có khác biệt Một số loài động vật (chuột, ếch, nhái) hạn chế qua lại Tuyến đƣờng làm nhiễm khơng khí, mà cịn ngăn cản dịng chảy số nơi, làm hạn chế nƣớc triều ngập vào rừng gây tình trạng ứ nƣớc, làm chết, chủ yếu đƣớc Rừng ngập mặn Cần Giờ khơng rừng phịng hộ mà cịn khu dự trữ sinh quyển, khu bảo tồn thiên nhiên Cho nên thiết phải có chủ trƣơng quản lý tác động lâm sinh, nhƣ chế sách phù hợp cho khu rừng [39] 2.2 Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.) 2.2.1 Phân loại [35], [46], [47] Tên La tinh: Rhizophora mucronata Ngành: Thực vật có hoa Ngành phụ: Thực vật hạt kín Lớp: Hai mầm Lớp phụ: Có nhiều cánh tràng Bộ: Sim Myrtales Nhóm: Cây ngập mặn Họ: Đƣớc Rhizophoraceae Chi: Rhizophora Lồi: mucronata Lamk Tên thơng dụng số quốc gia Đông Nam Á [47] Brunei: Lengayong Campuchia: Doeum prasak Indonesia: Bakau bakau hitam Malaysia: Bakau jangkar Mianma: Pyoo Philipine: Bakßuan Singapore: Belukap Thái Lan: Phangka Việt Nam: Đƣng, Đâng, Đƣớc xanh 10 2.2.2 Hình thái học Cây gỗ cao khoảng 20 m, đƣờng kính 60 – 70 cm Vỏ có màu xám đen hay đỏ sẫm, có đƣờng nứt ngang đặn Hệ rễ phát triển, gốc có nhiều rễ chống hình nơm, rễ Trên rễ có nhiều lỗ bì Rễ dài khoảng m, đƣờng kính rễ dao động từ 2,5 – 8,0 cm Mạng lƣới rễ đan vào chằng chịt nhƣ đăng khổng lồ giữ phù sa [31], [34], [46], [47] Lá đơn, mọc đối, dài – 16 cm, rộng – cm, dày, cứng, dai Lá màu xanh đậm bóng có hình trái xoan hay thn nhọn giáo Gân lớn, màu lục, gân bên không rõ Cuống thô, dẹt, màu lục Lá kèm hình tam giác thƣờng rụng sớm C B A C A B D Hình 2.2 Các thành phần cấu tạo hình thái Đƣng [18], [37], [28] (A) lá, (B) hoa, (C) trái, (D) hệ thống rễ Đài hoa khơng rụng thành trái [12] Có đài hoa, nhiều đài, đài hình ovan, nhọn, có nhiều thịt, dày, màu xanh lá, khơng có lơng tơ Đài hoa dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,7 cm, chiều dài đài hoa Cánh hoa màu trắng, có cánh nhiều hơn, nhọn, cánh hoa đều, mọc thẳng, khơng theo quy luật, có lơng tơ, mép nguyên cong, dày, đầy thịt Các cánh hoa mọc so le với đài hoa Mặt lƣng cánh hoa có lơng thƣa, uốn cong vào ơm lấy nhị Nhị chiếc, nhị ngắn, bao phấn khía, bầu trung bầu dƣới hình nón ơ, ô 62 5.2 Đề nghị Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 với việc thử nghiệm thêm primer mới, để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng với số lƣợng mẫu lớn rải rộng khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ Thu thập Đƣng có đặc điểm hình thái đặc biệt (về hình dạng lá, hoa, màu sắc hoa, trái) nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng xác Đặc biệt nên thu thập mẫu Đƣng nằm sâu rừng để đạt đƣợc kết thật tổng quát quần thể Đƣng có rừng ngập mặn Cần Giờ Tách band 300 bp, 400 bp để giải trình tự phục vụ cho việc phân biệt loài Đƣng (Rhizophora mucranta Lamk.) với loài khác thuộc họ đƣớc (Rhizophoraceae) Đặc biệt band 300 bp, hầu hết sản phẩm RAPD Đƣng tạo band Phải có biện pháp thúc đẩy nghiên cứu làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng, phong phú nguồn gene đảm bảo cho phát triển bền vững khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ vùng phụ cận Hiện nay, quần thể đƣớc đến giai đoạn già, sâu bệnh gây hại mức báo động Để khắc phục khả đƣớc khu vực có mối quan hệ di truyền gần, tạo điều kiện cho mầm bệnh dễ lây lan thiếu đa dạng sinh thái khu vực đó, tiến hành kỹ thuật lâm sinh trồng xen Đƣng với đƣớc nhằm đạt đƣợc đa dạng cao, mang lại hiệu tốt việc ngăn chặn sâu bệnh hình thành hệ sinh thái ổn định 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Quỳnh Anh, 2005 Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Anacardium occidental L.) tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu kỹ thuật RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Đỗ Nguyên Ban, 2000 Nghề Lâm Sinh Nhà xuất Giáo dục Phạm Văn Bình, 2005 Đánh giá sơ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều (Acanardium occidentale L.) trồng tỉnh Ninh Thuận kỹ thuật RAPD AFLP Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Phạm Thành Hổ, 1998 Di truyền học Nhà xuất Giáo dục TP Hồ Chí Minh Phạm Thành Hổ, 2006 Bài giảng Một số thị phân tử ứng dụng công tác giống trồng Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuấn, 2006 Khôi phục phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000) Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh 11 Lê Đình Lƣơng, 2001 Nguyên lý kỹ thuật di truyền Nhà xuất khoa học kỹ thuật 12 Trần Đình Nghĩa (chủ biên), 2005 Sổ tay thực tập thiên nhiên Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 64 13 Phạm Bình Quyền, 2002 Đa dạng sinh học Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội TIẾNG ANH 14 Desmond S.T Nicholl, 1994 An introduction to genetic engineering University of Paisley 15 Gene Namkoong and Dr Mathew P Koshy, 2001 Application of Genetic Markers to Forest tree species 16 Ulrich G Mueller and L LaReesa Wolfenbarger, 1999 AFLP genotyping and fingerpringting TRANG WEB 17 http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn/default.aspx?param=201AaWQ9MzE wNzYmZ3JvdXBpZD0ma2luZD1leGFjdCZrZXl3b3JkPUMlZTElYmElYTZO K0dJJWUxJWJiJTlj&page=1 18 http://homepages.vub.ac.be/~dagillik/mangrove/c_tagal.htm 19 http://images.google.com.vn/imgres?imgurl=http://avery.rutgers.edu/WSSP/ StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif 20 http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif 21 http://vietnamnet.vn/khoahoc/moitruong/2004/07/176924/ 22 http://vietnamnet.vn/khoahoc/moitruong/2005/12/523907/ 23 http://www.agriviet.com/news_detail791-c46-s0-p0Mo_hinh_san_xuat_giong_va_nuoi_ca_bong_tuong_cong_nghiep.html 24 http://www.appliedbiosystems.com 25 http://www.bioteach.ubc.ca/quarterly/ 26 http://www.dbag.unifi.it/mangroves/human/uses1.htm#2 27 http://www.diendandulich.net/dulich/diendan/index.php?showtopic=1243&st=40 65 28 http://www.diendandulich.net/dulich/diendan/index.php?showtopic=1243&st=2 0&p=5154&#entry5154 29 http://www.hcmussh.edu.vn/USSH/ImportFile/Magazine/Journal141006114054 doc 30 http://www.hochiminhcity.gov.vn/home/left/gioi_thieu/gioi_thieu_chung/tong_qu an/xa_hoi/dia_ly_thu_muc/ba_he_sinh_thai_rung?left_menu=1 31 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronat.html# Description 32 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronat.html# Energy 33 http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Rhizophora_mucronata.html #Chemistry 34 http://www.indian-cean.org/bioinformatics/mangrove/mangcd/Rhizo5.htm 35 http://www.indian-ocean.org/mangcd.systam/sys.htm 36 http://www.iowalivingroadway.com/ResearchProjects/images/409b.gif 37 http://www.mangrovecentre.or.id/Gallery/flora_flora_14.jpg&usg 38 http://www.mangrovecrabs.com 39 http://www.sggp.org.vn/moitruongdothi/nam2004/thang7/8510/ 40 http://www.tchdkh.org.vn/tchitiet.asp?code=1924 41 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/HTML/ChuongIV-5.html 42 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/HTML/ChuongIV-6.html 43 http://www.vacne.org.vn/CD_ROM/root/data/tomtatvn_RUNG.html 44 http://www.vacne.org.vn/Gioi%20thieu/gioithieu.htm 45 http://www.vacne.org.vn/Thongtin_Hoatdong/TinHoiQ4_06.htm#Sinh%20Quyen 66 46 http://www.vncreatures.net/tracuu.php?loai=2 47 http://www.worldagroforestrycentre.org/sea/products/afdbases/asp/ 48 http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/ 49 www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/hd_so10_05.htm 50 www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/sg_4_4_05.htm 51 www.saigon-tourist.com/vn/khudulich/vamsat.htm 52 www.vnn.vn/khoahoc/moitruong/2005/03/394535/ -1- PHỤ LỤC 1: Đặc điểm Đƣng đƣợc thu thập rừng ngập mặn Cần Giờ STT TÊN MẪU 11.1 11.2 TIỂU TỌA ĐỘ ĐỊA LÝ KHU 48P UTM 11 Tự nhiên 11 h= m, d = cm 0705980 1160966 Cây xanh tốt, có nhánh lớn, trái dài Tự nhiên 11.3 11 11.4 11 11.5 GHI CHÚ h = m, d = - cm Cây có nhiều nhánh 0706116 1160712 nhỏ, có nhiều hoa, trái nhỏ ĐẶC ĐIỂM h = m, d = cm 0706034 1161073 Cây xanh tốt, có nụ hoa, trái h = m, d = cm 0706623 1161423 Cây có hoa, trái, có nhiều sâu Tự nhiên Tự nhiên 11 h= m, d = cm Cây có nhiều vàng, 0706795 1161474 sâu, già, không hoa, không trái Tự nhiên Tự nhiên 11.6 11 h = m, d = cm Cây có nhánh, 0706252 1161267 già, khơng hoa, không trái 11.7 11 0704683 1160909 12.8 12 h = m, d = cm Cây xanh tốt, to h = m, d = cm 0706176 1161331 Cây tốt, không hoa, không trái 7.9 Cây ngập triều, 0711211 1165828 nhỏ tuổi, không hoa, không trái 10 7.10 Cây ngập triều, cịn 0711348 1166061 nhỏ tuổi, khơng hoa, khơng trái Tái sinh Tự nhiên Trồng Trồng -2- 7.11 h = 2,5 m, d = cm 0711394 1166150 Cây có nhánh, xanh tốt, trái nhỏ, hoa 12 7.12 h = 2,5 m, d = cm 0711395 1166151 Cây xanh tốt, không hoa, không trái 13 7.13 0711427 1166225 14 2B.14 2B 0714899 1168188 15 2B.15 2B 0713958 1169946 16 2B.16 2B 0713738 1170168 17 2B.17 2B 0712242 1170840 18 2B.18 2B 0712082 1170712 19 2B.19 2B 0711195 1170519 20 1.20 0711030 1170481 21 2B.21 2B 0710388 1170284 22 2B.22 2B 0710667 1170125 23 1B.23 1B 0710061 1170096 24 1.24 0709658 1170361 25 2B.25 2B 0710202 1169668 h = 1,5 m, d = cm Lá xanh đậm, già Tự nhiên 26 2B.26 2B 0710689 1168900 h = m, d = cm Cây non, xanh Tự nhiên 11 Cây ngập triều, xanh tốt Cây ngập triều, xanh tốt, non h = 1,5 m, d = cm Cây xanh tốt h= m, d = 1,5 cm Cây có nhiều vàng h = m, d = 1,5 cm Cây có nhiều vàng h = m, d = 1,5 cm Cây có nhiều già h < 1m, d = cm Cây có vàng h = m, d = cm Cây nhỏ, nhánh nhỏ, già h = 3m, d= cm Cây to có nhiều h = m, d = 1,5 cm Cây tốt, già h = m, d = cm Cây xanh tốt h = 2,5 m, d = cm Cây xanh tốt Tự nhiên Tự nhiên Trồng Trồng Trồng Trồng Trồng Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên Tự nhiên -3- h = m, d = 8-10 cm Cây xanh tốt, có nhiều hoa, nhiều trái, trái dài 20 cm h = m, d = 11 cm Cây có hoa, trái dài 20 -25 cm 27 27 10 N 10° 30' 05.1" E °106 52' 05.0" 28 28 10 N 10°/ 30'/ 04.6'' E 106° 52' 04.6" 10 N 10° 30' 07.1" E 106° 52' 59.5" h = 1m, d = 1,5 cm Cây có nhiều sâu, to Tái sinh Trồng 29 30 31 29 Tự nhiên Trồng 30 10 N 10° 30' 07.3" E 106° 52' 03.3" h = m, d =15 cm Cây xanh tốt, to, có nhiều hoa, trái dài 30 cm 31 10 N 10° 30' 06.2" E 106° 52' 10.0" h = 6m, d = 10 cm Cây có nhiều hoa, nhiều trái Tự nhiên h = 0,8 m, d = cm Cây ngập triều có nhiều sâu Tái sinh 32 32 10 N 10° 30' 07.2" E 106° 52' 59.8" 33 33 10 N 10° 30' 05.2" E106° 52' 04.5" h = m, d = cm Cây có nhiều sâu Trồng 34 34 10 N 10° 30' 05.5" E 106° 52' 04.1" Cây ngập triều, nhỏ Tự nhiên 35 35 10 N 10° 30' 05.3" E 106° 52' 04.0" Cây ngập triều, nhỏ Tự nhiên 36 36 10 N 10° 30' 04.9" E 106° 52' 04.8" h = 5m, d = cm Cây xanh tốt, to Trồng -4- PHỤ LỤC 2: Công dụng cách pha hóa chất ly trích HĨA CHẤT CƠNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M = 364,46 g / mol) Phá vỡ màng tế bào, Hòa tan nƣớc cất lần màng nhân 65oC Ethanol 100% Tủa DNA nồng độ Dung dịch gốc muối Sodium acetate cao nhiệt độ thấp Rửa DNA Pha với tỷ lệ thể tích ethanol 100% thể tích nƣớc cất lần hấp tiệt trùng Tủa DNA nhiệt độ Dung dịch gốc thấp, không cần muối Sodium Acetate Biến tính protein Dung dịch gốc sắc tố có mẫu Tách lớp sau ly tâm Ethanol 70% Iso Propanol Chloroform Iso Amylalcohol (C5 H10O, M = 88,75 g / mol) Tránh tạo bọt Dung dịch gốc trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein Pha với tỷ lệ 24 thể tích sắc tố mẫu Tách Chloroform thể tích lớp sau ly tâm, DNA Isoamyl Alcohol đƣợc phóng thích nằm pha nƣớc lớp EDTA 0,5M Gắn nối ion hóa trị II (C10H14N2Na2O8.2H2O, M (Mg++, Ca++…) có = 372,54 g / mol) dịch ly trích, ngăn chặn hoạt động enzyme phân hủy DNA Các enzyme hoạt động mạnh có mặt ion hóa trị II ion Mg++ Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M = 157,56 g / mol) Pha 100ml - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất lần Khuấy tan - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất lần cho đủ 100ml - Hấp 121oC/20phút trƣớc dùng Dung dịch đệm, đảm bảo Pha 100ml mơi trƣờng ly trích ổn - 15,7 g bột Tris-HCl + định pH8 Ở độ pH 80ml nƣớc cất lần DNA ổn định Khuấy tan -5- Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất lần cho đủ 100ml Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng Môi trƣờng đệm thuận Pha 100ml lợi cho việc kết tủa - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc DNA cất lần Khuấy tan - Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng - NaCl 5M (M = 58,44 g / mol) TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất lần - Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng TE 1X Hịa tan DNA EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M = 82,03 g / mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% điều kiện -20oC Pha 100ml 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất lần Pha 100ml - 57ml nƣớc cất lần + 2g CTAB (lắc nhẹ bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt) - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml β - mercaptro Ethanol thêm vào trƣớc sử dụng Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Pha 100ml - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất lần Khuấy tan Hấp 121oC/20 phút trƣớc dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA Pha 1ml có dịch trích - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất lần Bọc giấy bạc, trữ 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp Bảo vệ DNA Dung dịch gốc Mercaptro Ethanol -6- PHỤ LỤC 3: Quy trình ly trích DNA từ mẫu Đƣng, sử dụng nitơ lỏng Bƣớc Vortex 800 Lấy 0,2 g non rửa lau vịng / phút khơ Nghiền nitơ lỏng Thêm 1,2 ml dịch trích EB có Ủ 650C / h PVP Bƣớc Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ Ly tâm 11.000 vòng 15 phút 4oC Thu 500 l dịch Bƣớc Lặp lại bƣớc Thu 300 l dịch Bƣớc Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh Bƣớc Thêm 20 l muối Sodium acetate M, 640 l Ethanol 100% Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút 4oC Thu 700 l dịch Tủa -200C Qua đêm Ủ 370 C Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút 4oC Đổ bỏ dịch Thu kết tủa trắng Bƣớc Cho vào 300 l TE 1X 1h Trộn Ủ – 200 C / h Bƣớc Ly tâm 11.000 vòng 25 phút 40C Đổ bỏ dịch Buớc 12 Bảo quản mẫu -20oC Bƣớc 10 Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% cách ly tâm 12.000 vòng phút 40C Đổ bỏ dịch Bƣớc 11 Lặp lại bƣớc 10 Để khơ cặn 370C, hịa tan cặn 50 l TE 1X Ủ 370 C / h -7- PHỤ LỤC 4: Kết OD (Optical Density) 25 mẫu DNA có kết điện di tốt STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD Abs 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 30 31 33 36 1.24 11.1 11.3 11.4 11.5 11.6 12.8 1B.23 2B.14 2B.15 2B.19 2B.25 2B.26 7.10 7.11 7.12 7.13 7.9 2.03300 2.01150 1.71620 1.80010 1.74413 1.47940 2.01140 1.98640 2.01530 1.79630 2.00030 1.65810 1.54730 2.11180 1.65810 1.79390 2.43260 2.01920 1.52800 1.61700 1.74460 1.65590 2.01140 1.97540 2.03300 0.11357 0.18893 6.2866 E - 0.13046 0.13435 0.32869 5.8861 E - 0.19329 6.0973 E - 0.26305 0.19039 0.34877 0.23938 9.1696 E - 0.34877 0.26242 6.7916 E - 0.18792 0.26414 0.15273 0.13399 0.14475 5.8861 E - 0.19388 0.18783 Abs 4.8260 E - 9.39250E - 3.6631 E - 7.2470 E - 7.7158 E - 0.22218 2.9263 E - 9.7306 E - 3.0255 E - 0.14644 9.5182 E - 0.21035 0.15471 1.9364 E - 0.21035 0.16290 2.7919 E - 9.3068 E - 0.17287 9.4405 E - 7.6805 E - 8.7415 E - 2.9263 E - 9.8145 E - 9.2391 E - HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 540.61930 850.23970 263.55554 559.70140 567.29270 1267.61210 264.88889 865.49250 274.60217 1127.40050 854.89790 1436.50330 948.74420 507.05744 1436.50330 1064.18180 326.68324 846.97200 1039.10860 620.81370 566.29910 595.78350 264.88889 866.18320 848.84310 -8- PHỤ LỤC 5: Kết OD (Optical Density) 11 mẫu DNA có kết điện di khơng tốt STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD 10 11 11.2 11.7 2B.16 2B.17 2B.18 1.20 2B.21 2B.22 32 34 35 1.75350 1.09540 1.26960 1.21280 1.46260 1.14390 1.36770 1.52920 1.36130 1.51950 1.21140 Abs Abs 6.5513 E - 1.9694 E - 1.4285 E - 1.2716 E - 0.32831 1.5054 E - 8.5273 E - 0.27609 0.33904 0.28539 1.3666 E - 3.7360 E - 1.7979 E - 1.1251 E - 1.0485 E - 0.22448 1.3161 E - 6.2346 E - 0.18054 0.24906 0.18782 1.11281E - HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 277.58077 59.15086 49.34905 42.23764 1256.94190 47.31006 311.92157 1086.66210 1235.94560 1118.95110 45.89834 PHỤ LỤC 6: Bảng mã hóa số liệu điện di mẫu Đƣng -9- PHỤ LỤC 7: Bảng mã hóa số liệu điện di kích thƣớc band 14 mẫu Đƣng PHỤ LỤC 8: Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS mẫu - 10 - PHỤ LỤC 9: Kết đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS 14 mẫu ... truyền nhƣ đƣợc gọi đa dạng di truyền 2.8 Ý nghĩa việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học cần thiết cho tồn loài, quần xã tự nhiên đồng thời quan trọng ngƣời Sự đa dạng di truyền cần thiết... vật, động vật vi sinh vật, gene chứa đựng lồi hệ sinh thái vơ phức tạp tồn môi trƣờng” Đa dạng sinh học đƣợc xem xét ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng loài đa dạng di truyền [13] Tính đa dạng. .. “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” 1.2 Mục đích Hồn thiện