1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có khoảng 20% số loài là đặc hữu Các nhà khoa học dự đoán Việt Nam có khoảng 15 000 loài thực vật, trong đó trên 10 0[.]
1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có hệ thực vật phong phú đa dạng, có khoảng 20% số lồi đặc hữu Các nhà khoa học dự đốn Việt Nam có khoảng 15.000 lồi thực vật, 10.000 đƣợc nhận biết Tuy nhiên, nhiều nguyên nh n nhƣ chiến tranh kéo dài, khai thác lạm dụng, du canh du cƣ, chuyển đổi mục đích sử dụng đất làm diện tích chất lƣợng rừng nƣớc ta bị suy giảm Các hệ sinh thái rừng bị suy thối nghiêm trọng Nhiều lồi thực vật rừng q bị khai thác, chặt hạ trái phép nên đứng trƣớc nguy bị đe doạ tuyệt chủng Các loài họ Dầu loài c y rừng chiếm ƣu đóng vai trị sinh thái kinh tế quan trọng Hiện nay, có 45 loài đƣợc biết đến thuộc chi Việt Nam, chủ yếu địa đặc hữu Bởi giá trị thƣơng mại nhu cầu gỗ địa phƣơng, loài họ Dầu bị khai thác mạnh Hơn nữa, nhiều năm, áp lực tăng trƣởng kinh tế dẫn đến giảm lớn khu vực rừng tăng mức độ ph n mảnh rừng cịn sống sót Những xu hƣớng có ảnh hƣởng bất lợi đến môi trƣờng sống c y họ Dầu Hiện nay, 33 loài c y họ Dầu bị đe dọa mức độ toàn cầu Loài c y Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) có th n thẳng, gỗ tốt đƣợc sử dụng nhiều sơn kỹ nghệ hay đóng tàu Ngồi ra, chúng cịn đƣợc sử dụng nhƣ ngu n tinh dầu có giá trị C y Dầu song nàng ph n bố khu rừng nhiệt đới vùng đất thấp Ở Việt Nam, giảm môi trƣờng sống khai thác mức dẫn đến loài câynày đƣợc liệt kê bị đe dọa Theo sách đỏ Việt Nam năm 2007 Dầu song nàng đƣợc xếp vào bậc VU A1c,d + 2c, d; cần nghiên cứu bảo t n phát triển lồi c y Vì đề tài nghiên cứu tập trung đánh giá trạng quần thể, mức độ đa dạng di truyền ba quần thể Dầu song nàng rừng nhiệt đới Đơng Nam Bộ kỹ thuật SSR góp phần cho nhà quản lý đƣa giải pháp bảo t n, phục h i phát triển bền vững Mục tiêu, nội dung, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Mục tiêu đề tài: Xác định đƣợc đa dạng di truyền thụ phấn chéo loài Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri) rừng nhiệt đới Đông Nam Bộ - Nội dung nghiên cứu: Ph n tích đa dạng di truyền lồi Dầu song nàng sở ph n tích cặp m i Microsatellite (SSR) Xác định thông số thụ phấn chéo loài Dầu song nàng rừng nhiệt đới Mã Đà (Đông Nam Bộ) - Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Kết nghiên cứu dẫn liệu khoa học đa dạng di truyền loài Dầu song nàng phục vụ cho công tác bảo t n phục h i loài hữu hiệu Việt Nam Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan họ Dầu (Dipterocarpaceace) Họ Dầu đƣợc gọi Họ Hai cánh có danh pháp khoa học Dipterocarpaceae g m có 17 chi khoảng 580 – 680 loài thân gỗ chủ yếu rừng mƣa nhiệt đới vùng đất thấp với hai cánh Tên gọi khoa học họ xuất phát từ chi điển hình Dipterocarpus, có ngu n gốc từ tiếng Hy Lạp (di hai, pteron cánh karpos quả, nghĩa có hai cánh) Các chi lớn Shorea (196 – 360 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) Vatica (60 – 65 loài) Nhiều loài chiếm ƣu hệ sinh thái rừng, thơng thƣờng cao tới 40–70 m, đơi 80 m (Dryobalanops, Hopea Shorea) Họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m phân họ Monotoideae g m có chi 30 loài phân bố Châu Phi, đảo Madagascar vùng Amazon thuộc Colombia Pakaraimoideae g m có lồi Pakaraimaea roraimae, ph n bố vùng cao nguyên Guiana (Nam Mỹ) Dipterocarpoideae ph n họ lớn g m có 13 chi 470 - 650 loài Khu vực ph n bố bao g m Seychelles, Sri Lanka, Ấn Độ, Đông Nam Á, New Guinea, nhƣng chủ yếu miền t y Malesia, đ y chúng tạo thành quần thể thống lĩnh cánh rừng vùng đất thấp [1,2,18] Ở Việt Nam theo danh lục loài thực vật Việt Nam, họ Dầu (Dipterocarpaceae) g m chi, 42 lồi phân lồi, đó: chi Vên vên (Anisoptera) có lồi; chi Dầu (Dipterocarpus) có 11 lồi phân lồi; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 lồi; chi Chị (Parashorea) có lồi; chi Sến mủ (Shorea) có lồi; chi Táu (Vatica) có loài phân loài Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), Việt Nam có 42 lồi phân lồi thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), đó: chi Vên vên (Anisoptera) có loài Hai loài Vên vên danh lục thực vật Việt Nam gộp lại thành loài Vên vên (A costata); chi Dầu (Dipterocarpus) có 12 lồi, bổ sung loài Dầu cát (D condorensis) so với Danh lục thực vật Việt Nam; chi Kiền kiền (Hopea) có 11 lồi khơng nhắc đến lồi Sao xanh (H helferi) nhƣ Danh lục thực vật Việt Nam bổ sung thêm lồi chƣa định danh xác Sao đá (Hopea sp.); chi Chò (Parashorea) có lồi; chi Sến mủ (Shorea) có lồi chi Táu (Vatica) có lồi với phân loài Theo tác giả, loài Sao đá (Hopea sp.), Dầu cát (D condorensis) đƣợc ghi nhận thực t n Việt Nam loài khác Sao xanh (H helferi), Kiền kiền nhẵn (A scaphula) không chắn t n Việt Nam [1,2] Về thực trạng họ Dầu, có 23 lồi đƣợc ghi nhận mức bị đe dọa theo IUCN (2001), lồi nguy cấp (CR) có lồi nguy cấp (EN) 18 loài bị đe dọa (VU) Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), có 11 lồi đƣợc xếp hạng đe dọa, có lồi nguy cấp (CR), loài nguy cấp (EN) loài bị đe dọa (VU) [1,2,3] Về phân bố, theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005), loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố sinh cảnh rừng khô họ Dầu, rừng mƣa mùa thƣờng xanh nửa rụng lá, rừng kín mƣa mùa thƣờng xanh ẩm [6] Các loài họ Dầu (Diptercarpaceae) loài gỗ có giá trị kinh tế cao thân thẳng, gỗ tốt chiếm lĩnh sinh cảnh tốt Khoảng năm 80 kỷ trƣớc, chúng chiếm đến 25% thị phần thƣơng mại gỗ cứng giới, 80% Shorea Bên cạnh đó, nhựa hợp chất câu họ Dầu có giá trị cao nhƣ resin, oleoresin, lac chiết xuất chất béo có bơ từ [14] Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), năm 1959 diện tích loại rừng có họ Dầu Đơng Nam Bộ 1146 275 (chiếm 49% diện tích tồn vùng) Đến năm 1968 giảm xuống 834 050 (chiếm 36% diện tích khu vực), năm 1982 giảm cịn 416 900 (bằng 18% diện tích) năm 1992 183 081 (8%) Rõ ràng việc bảo t n loài họ Dầu nƣớc ta trở nên cấp thiết hết, góp phần vào việc bảo t n ngu n gen rừng có nguy tuyệt chủng nƣớc ta 1.2 Cây Dầu song nàng Dầu song nàng (Dipterocarpus dyeri Pierre) thuộc họ Dầu có kích thƣớc lớn nhất, phân bố tỉnh phía Nam Gỗ cứng, nặng (tỷ trọng 0.8) có giác lõi phân biệt; lõi màu đỏ n u, đƣợc dùng để đóng tài chế tạo đ gỗ C y cho loại nhựa nhƣ Dầu rái, dùng kỹ nghệ sơn hay đóng tàu Hiện nay, nơi cƣ trú c y bị tàn phá thu hẹp, bị khai thác mạnh, có xu hƣớng bị tiêu diệt vùng lớn, đƣợc phân loại vào nhóm VU A1c,d + 2c,d Vì vậy, việc nghiên cứu bảo t n ngu n gen loài cần thiết [2] Trong tự nhiên, hạt Dầu song nàng nảy mầm đất đủ ẩm nhờ có mƣa lớn Nếu không gặp mƣa, chúng sức nảy mầm nhanh chóng sau – tuần kể từ rụng xuống đất Hạt Dầu song nàng nảy mầm bóng râm, khơng nảy mầm đất trống có nhiều ánh sáng khơ hạn Ngồi ra, Dầu song nàng có khả sinh sản mạnh ch i gốc, nhƣng bắt gặp gốc chặt có D0 < 20 cm, sinh sản tốt gốc chặt có đƣờng kính từ – cm chiều cao dƣới 20 cm Gốc chặt có khả sinh ch i nhiều lần Điều kiện đất ẩm mát dƣới tán rừng có độ tàn che 0,5 – 0,6 môi trƣờng lỗ trống tối ƣu cho tái sinh ch i dầu song nàng Cây ch i thƣờng hình thành dƣới tán rừng sau khai thác dƣới tán mẹ bị đổ gẫy gió hay chết tự nhiên Ngồi ra, theo Lê Văn Long (2016) nghiên cứu đặc điểm sinh học nhƣ ƣu hợp Dầu song nàng tiêu chuẩn, số lồi gỗ bắt gặp ƣu hợp Dầu song nàng đất xám (43 loài) thấp so với ƣu hợp Dầu song nàng đất n u đỏ (49 loài) Những loài gỗ ƣu đ ng ƣu ƣu hợp Dầu song nàng đất xám đất n u đỏ biến động động từ – loài Mật độ ƣu hợp Dầu song nàng đất n u đỏ (660 cây/ha) đất xám (616 cây/ha) Những ƣu hợp Dầu song nàng có khả tái sinh tự nhiên tốt dƣới tán rừng, trình tái sinh diễn liên tục theo thời gian, phần lớn tái sinh có ngu n gốc hạt có chất lƣợng tốt Cây tái sinh Dầu song nàng phân bố mặt đất theo dạng phân bố cụm [16] 1.3 Đánh giá đa dạng di truyền sinh học phân tử 1.3.1 Quần thể tính đa dạng di truyền quần thể Quần thể tập hợp nhóm cá thể lồi, sống khơng gian định, có khả sinh sản để tạo thể hữu thụ Quần thể đơn vị tiến hóa lồi tự nhiên Các quần thể khác loài đƣợc đặc trƣng mật độ cá thể, kiểu ph n bố đặc biệt kích thƣớc quần thể Kích thƣớc quần thể số lƣợng cá thể quần thể Trong đó, kích thƣớc tối thiểu số lƣợng cá thể mà quần thể cần có để trì phát triển, kích thƣớc tối đa giới hạn cuối mà quần thể đạt đƣợc để phù hợp với khả cung cấp ngu n sống mơi trƣờng Kích thƣớc quần thể phụ thuộc vào mức sinh sản, mức tử vong phát tán cá thể quần thể Trong tự nhiên, quần thể lồi ln có xu hƣớng tự điều chỉnh số lƣợng cá thể để trì trạng thái ổn định phù hợp với môi trƣờng Tác động ngƣời đến môi trƣờng sống thƣờng dẫn đến phá vỡ cấu trúc quần thể thiết lập quần thể có kích thƣớc nhỏ, lập Nếu trạng thái t n khoảng thời gian dài ảnh hửng đến sinh trƣởng sinh sản quần thể, cuối làm suy giảm khả thích nghi quần thể với mơi trƣờng sống chúng Đa dạng sinh học thuật ngữ thể tính đa dạng thể sống, lồi quần thể, tính biến động di truyền chúng tất tập hợp phức tạp chúng thành quần xã hệ sinh thái Đa dạng sinh học kết trình tiến hoá tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao g m mức độ hệ sinh thái, loài di truyền Đa dạng di truyền thể đa dạng ngu n gen genotype loài Đa dạng di truyền cho phép cá thể lồi thích nghi đƣợc với biến đổi bất lợi môi trƣờng sống có khả tự phục h i môi trƣờng sống chúng Nhƣ vậy, đa dạng di truyền đƣợc đề cập đến nhƣ mức độ đa hình di truyền cá thể suốt thời gian sống nó, đƣợc phản ánh số alen quần thể địa điểm thời gian cụ thể số allele loài phạm vi ph n bố địa lý lịch sử t n Nơi sống lồi đƣợc thiết lập q trình hình thành loài Ph n cắt xảy nơi sống bị chia nhỏ bị cô lập với ma trận cảnh quan khác không giống ban đầu khơng phù hợp cho t n lồi Nhƣ vậy, ph n cắt tạo nên phá vỡ nơi sống Tác nh n g y ph n cắt bao g m mở rộng đất nông nghiệp, khai thác không hợp lý tài nguyên sinh vật, x y dựng khu d n cƣ khai thác khoáng sản Ph n cắt đe doạ đến tính thống sinh thái đƣợc hình thành lịch sử phát triển loài nguyên nh n g y tuyệt chủng Suy giảm diện tích nơi sống ảnh hƣởng đến kích thƣớc quần thể ph n bố lại mảnh nơi sống lại ảnh hƣởng đến phát tán loài Hậu trình ph n cắt thƣờng làm suy giảm chức hệ sinh thái cuối nơi sống Các quần thể nhỏ bị cô lập mảnh nơi sống lại dễ bị tổn thƣơng có khả thích nghi điều kiện môi trƣờng sống chúng bị thay đổi Tất nhiên, hậu dẫn đến tính đa dạng di truyền mức độ quần thể loài cuối nhiều loài bị đe dọa tuyệt chủng Một hậu quần thể nhỏ cô lập xuất mối quan hệ cận noãn cá thể quần thể Ảnh hƣởng làm tính đa dạng di truyền tần số cƣờng độ quan hệ cận noãn cao cuối giảm khả thích nghi quần thể điều kiện môi trƣờng biến đổi tăng khả nhạy cảm dịch bệnh 1.3.2 Một số kỹ thuật nghiên cứu đa dạng di truyền tiến hóa phân tử Bảo t n quản lý lồi địi hỏi thơng tin đặc điểm sinh thái đa dạng di truyền quần thể Để có đƣợc thơng tin đó, đặc biệt hiểu biết tốt trình di truyền, kỹ thuật sinh học đƣợc u cầu Tiềm tiến hóa lồi phụ thuộc vào mức độ khác di truyền Hiểu biết đa dạng di truyền cung cấp thơng tin hữu ích để xây dựng chiến lƣợc bảo t n sử dụng loài cách bền vững Đối với loài thực vật, thụ phấn chéo trì tiềm lớn cho trình trao đổi di truyền trì mức độ cao đa dạng di truyền quần thể loài [28],[29] Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật sinh học phân tử có phát triển mạnh mẽ, tạo công cụ hữu hiệu cho ngƣời nghiên cứu sống cấp độ phân tử, kỹ thuật sinh học phân tử nhanh chóng đƣợc ứng dụng nghiên cứu bảo t n đa dạng sinh học, tạo lĩnh vực khoa học nhƣ tiến hóa phân tử, di truyền bảo t n Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể loài thực vật, ngồi kỹ thuật isozym, cịn có kỹ thuật ADN với phƣơng pháp nhƣ RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP, Kỹ thuật RAPD RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình đoạn ADN đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) William phát minh năm 1990, Welsh cộng hoàn thiện năm 1991 (Watson Barker, 2004) Phƣơng pháp sử dụng số m i ngẫu nhiên (m i ngẫu nhiên đoạn oligo nucleotide g m khoảng đến 20 Nucleotide) để thực phản ứng PCR nhằm nh n đoạn ADN đặc trƣng mẫu nghiên cứu Nếu mẫu nghiên cứu có gen giống hồn tồn, sản phẩm PCR thu đƣợc g m đoạn ADN hoàn toàn giống kích thƣớc cấu trúc Khi gen mẫu nghiên cứu có khác biệt nhau, kết PCR nh n đƣợc đoạn khác biệt [5,18,28] *Ưu điểm kỹ thuật RAPD Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực dễ thành cơng khơng cần biết trƣớc trình tự gen đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lƣợng ADN khuôn không cần độ tinh cao, thời gian thực nhanh, khả nh n cao Về mặt kinh tế, chi phí thực cho kỹ thuật thấp Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị ph n tử có độ tin cậy cao [4] * Những hạn chế kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ xác khơng cao, khơng ổn định (thể mức độ lặp lại giống thấp) Khả nh n phản ứng PCR cao nhƣng khả xuất đa hình thấp độ tin cậy không cao Kỹ thuật RFLP RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài đoạn ADN cắt enzyme giới hạn) Kỹ thuật dựa đặc điểm enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên đoạn cắt ADN khác phân biệt đƣợc điện di đ , đoạn cắt đƣợc gọi “dấu vân 10 tay” đặc trƣng cho phân tử ADN Bản đ di truyền kết RFLP có tính xác cao, thƣờng đƣợc sử dụng nghiên cứu khác biệt cấu trúc gene cá thể, loài sinh vật, nhằm so sánh khác biệt mẫu nghiên cứu, xác định ngu n gốc mức độ tiến hóa loài sinh vật [5,18] Kỹ thuật đƣợc dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến Kỹ thuật RFLP đƣợc sử dụng để kiểm tra phân ly di truyền số tính trạng theo qui luật Mendel, ứng dụng chọn giống động vật, chọn giống thực vật so sánh khác cá thể, loài sinh vật Kỹ thuật RFLP đƣợc thực nguyên lý cắt enzyme giới hạn DNA mẫu nghiên cứu sau đƣợc tách chiết tinh đƣợc cắt với số loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn nhận biết cắt đặc hiệu DNA vị trí xác định, gen có cấu trúc khác cho số lƣợng kích thƣớc đoạn cắt ADN khác nhau, gen giống cho số lƣợng, kích thƣớc đoạn cắt giống nhau, kích thƣớc vá số lƣợng đoạn cắt quan sát đƣợc điện di đ Kỹ thuật SSR Chỉ thị SSR (simple sequence repeat) hay gọi vi vệ tinh (Microsatellite), đoạn trình tự DNA đơn giản lặp lại nối tiếp g m – 6bp Hiện tƣợng SSR thể sinh vật nh n chuẩn phổ biến động vật thực vật Tuy nhiên, tùy loài mà số lƣợng nucleotide đơn vị lặp lại thay đổi từ đến hàng chục số lƣợng đơn vị lặp lại biến động từ hai đến hàng chục lần nhiều Thơng thƣờng có kiểu lặp lại: - Lặp lại hoàn toàn: đơn vị lặp lại xếp nối tiếp - Lặp lại khơng hồn tồn: xen kẽ vào đơn vị lặp lại nucleotide khác