Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc aspergillus có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt độ cao

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài khóa luận này, xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực tập Viện Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt năm học tập trƣờng Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài mà cịn hành trang q báu để tơi bƣớc vào đời cách vững tự tin Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Thu Hằng giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hƣớng hƣớng dẫn tơi suốt q trình hồn thành đề tài khóa luận Trong q trình thực hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học thời gian kiến thức cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến, bảo tận tình q thầy, để đề tài khóa luận tơi đƣợc hồn thiện Cuối cùng, tơi xin kính chúc thầy, giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công sống nhƣ nghiệp nghiên cứu giảng dạy Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên thực Trần Văn Khải i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Protease 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế thủy phân protease 1.1.4 Ứng dụng protease 1.2 Nấm mốc Aspergillus 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo 1.2.2 Nhu cầu dinh dƣỡng sinh trƣởng 1.2.3 Hình thức sinh sản 1.3 Các phƣơng pháp thu nhận protease từ nấm mốc Aspergillus 10 1.3.1 Nuôi cấy bề mặt 10 1.3.2 Ni cấy chìm 10 1.4 Tình hình nghiên cứu protease 11 1.4.1 Tình hình nghi n cứu Việt Nam 11 1.4.2 Tình hình nghi n cứu tr n giới 12 CHƢƠNG MỤC TI U, N I DUNG V PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU 13 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghi n cứu 13 2.3 Vật liệu, hóa chất, mơi trƣờng ni cấy 13 2.3.1 Vật liệu vi sinh vật 13 2.3.2 Hóa chất 13 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy 13 2.3.4 Trang thiết bị 15 ii 2.4 Phƣơng pháp nghi n cứu 15 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập giữ chủng 15 2.4.2 Phƣơng pháp xác định hình thái chủng nấm 16 2.4.3 Xác định hoạt tính protease phƣơng pháp đo đƣờng k nh v ng phân giải casein 16 2.4.4 Xác định hoạt độ protease phƣơng pháp Anson cải tiến 17 2.4.5 Thu nhận dịch enzyme thô từ canh trƣờng lên men xốp 19 2.4.6 Khảo sát điều kiện lên men xốp 20 2.4.7 Phƣơng pháp x lý số liệu 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc Aspergillus 23 3.2 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease hoạt độ cao 26 3.3 Kết xác định số đặc điểm sinh học chủng nấm mốc Aspergillus NA4 tuyển chọn 28 3.4 Khảo điều kiện ni cấy kích thích chủng nấm Aspergillus tuyển chọn sinh tổng hợp protease ngoại bào 30 3.4.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu 30 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 31 3.4.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 32 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1 Kết luận: 33 4.2 Kiến nghị: 33 T I LI U THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức môi trƣờng PDA 14 Bảng 2.2 Công thức môi trƣờng Crapeck 14 Bảng 2.3 Công thức mơi trƣờng định tính protease 14 Bảng 2.5 Phƣơng pháp xác định hoạt độ protease 18 Bảng 2.6 T lệ nguy n liệu môi trƣờng l n men xốp 20 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm có khả thuộc chi Aspergillus phân lập 24 Bảng 3.2 Kết định t nh khả sinh protease chủng nấm có khả thuộc chi Aspergillus phân lập 26 Bảng 3.3 Kết xác định hoạt tính chủng nấm mốc 28 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ cám gạo, trấu gelatine đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 30 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 31 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 32 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng thủy phân dƣới xúc tác protease Hình 1.2 Cơ chế xúc tác Endopeptidase Exopeptidase Hình 1.3 Mơ hình protease thủy phân phân t protein Hình 2.1 Sơ đồ trình thu nhận enzyme thô 20 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tỉ lệ ngun liệu ni cấy thích hợp 21 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ ni cấy thích hợp 21 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát thời gian lên men thích hợp 22 Hình 3.1 V ng phân giải casein tr n đ a thạch chủng phân lập đƣợc 27 Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc có khả thuộc chi Aspergillus NA4 (A Mặt trƣớc, B Mặt sau) 29 Hình 3.3 Bào t hệ sợi chủng nấm NA4 quan sát dƣới k nh hiển vi 29 v ĐẶT VẤN ĐỀ Aspergillus chi nấm sợi phân bố rộng rãi nhiều loại chất tự nhiên sản phẩm nông nghiệp, đƣợc biết đến với khả sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, có protease Việc tuyển chọn đƣợc dòng nấm mốc phù hợp với điều kiện môi trƣờng Việt Nam, giúp thúc đẩy tổng hợp enzyme mong muốn đóng vai tr quan trọng, sở bƣớc đầu cho việc xác định tính chất nghiên cứu khả ứng dụng protease vào thực tế Chính vậy, mục tiêu nghiên cứu tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus địa phù hợp cho trình sinh tổng hợp protease đạt hiệu Mặt khác, protease enzyme xúc tác thủy phân mối liên kết peptide phân t protein, đƣợc ứng dụng cách rộng rãi nhiều l nh vực khác nhƣ công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, cơng nghiệp sản xuất xà phịng chiếm khoảng 60% thị trƣờng enzyme Hiện giới, đa số chế phẩm enzyme đƣợc thu nhận từ vi sinh vật, vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme quy mơ lớn dùng cơng nghiệp, đời sống có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ chu kỳ phát triển ngắn, môi trƣờng nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển… Qua nhiều năm, việc gia tăng s dụng vi sinh vật nhƣ nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm đƣợc tạo nhiều Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng công nghiệp đƣợc sản xuất từ vi sinh vật Hiện nay, giới, chế phẩm protease đƣợc thƣơng mại hóa đƣợc đƣa vào ứng dụng cách rộng rãi Tuy vậy, thời gian gần đây, tr n giới, nhiều nhà khoa học tiếp tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định tính chất chế phẩm sản xuất từ enzyme protease Ở Việt Nam có số nghiên cứu protease vi sinh vật, nhiên dừng lại quy mơ phịng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme cịn hạn chế Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật, nhƣ mong muốn tạo chế phẩm sản xuất từ enzyme protease có hoạt tính cao tơi tiến hành đề tài khóa luận: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus có khả sinh tổng hợp protease có hoạt độ cao” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Protease 1.1.1 Giới thiệu chung Protease hay peptide hydrolase enzyme thu phân liên kết peptide (-O–NH-) phân t protein polypeptide Sản phẩm trình thu phân amino acid, peptide, polypeptide chuỗi ngắn Nhiều protease cịn xúc tác phản ứng thu phân liên kết ester, liên kết amid phản ứng chuyển vị gốc amino acid Phản ứng xảy nhƣ sau: protease Hình 1.1 Phản ứng thủy phân dƣới xúc tác protease 1.1.2 Phân loại  Dựa vào chế xúc tác [23] Theo IUBMB (The International Union of Biochemistry and Molecular Biology) peptidase đƣợc phân thành nhóm: - Nhóm 1: Exopeptidase cịn gọi peptidase hay enzyme phân cách đầu mạch, thu phân đầu tận chuỗi polypeptidase Nếu xúc tác đầu có gốc amin tự gọi enzyme aminopeptidase - Nhóm 2: Endopeptidase cịn gọi proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch, xúc tác phản ứng thu phân liên kết peptide bên chuỗi polypeptid Hình 1.2 Cơ chế xúc tác Endopeptidase Exopeptidase  Dựa vào cấu tạo trung tâm hoạt động [24] Dựa vào cấu trúc nhóm chức trung tâm hoạt động, endopeptidase đƣợc chia thành nhóm: - Serin – proteinase (EC 3.4.21): protease có nhóm (-OH) serine trung tâm hoạt động vùng kiềm có t nh đặc hiệu tƣơng đối rộng - Cystein – proteinase (EC 3.4.22): protein có nhóm thiol (-SH) acid amin cysteine trung tâm hoạt động Cysteine protease bao gồm protease thực vật nhƣ papain, bromelin, vài protease kí sinh trùng Các cyteine protease thƣờng hoạt động vùng pH trung t nh, có t nh đặc hiệu chất rộng - Aspartic protease (EC 3.4.22): hầu hết aspartic protease thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm enzyme ti u hố nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic protease có nhóm carboxyl trung tâm hoạt động thƣờng hoạt động mạnh pH trung tính - Metallo protease (EC 3.4.23): metallo protease nhóm protease cấu tạo có kim loại đƣợc tìm thấy vi khuẩn, nấm sợi, sinh vật bậc cao Các metallo protease thƣờng hoạt động vùng pH trung tính hoạt động giảm mạnh dƣới tác động EDTA  Dựa vào pH hoạt động [20] Dựa vào mức hoạt động dung dịch có trị số pH khác mà enzyme protease đƣợc chia làm loại: - Protease acid: pH khoảng 2÷5 Loại protease thƣờng đƣợc thu nhận từ loại NS đen nhƣ: A niger, A awmori, A saitoi - Protease trung tính: có pH khoảng hẹp, từ 6÷7,5, khơng bền với nhiệt độ cao Thu nhận chủ yếu từ loại NS vàng nhƣ: A oryzae, A flavus, A fumigatus, A tericola - Protease kiềm t nh: có pH khoảng 8÷11 thƣờng đƣợc tổng hợp nhiều nấm men vi khuẩn Những protease kiềm t nh nhóm đƣợc quan tâm nhiều năm gần s dụng chúng nhƣ chất phụ gia việc giặt tẩy, q trình thuộc da, x lý chất thải mơi trƣờng  Dựa vào tính đặc hiệu chúng với chất tổng hợp chuỗi β- insulin bị oxy hóa [7] Năm 1975, Morihara phân loại protease đƣợc chia thành bốn nhóm lớn, dựa vào t nh đặc hiệu chúng chất tổng hợp chuỗi β – Insulin bị oxy hóa - Nhóm I - Serin proteinase: T nh đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm –CO2 liên kết peptide gọi carbonxyendopeptidase - Nhóm II - Cystein proteinase: Giống nhƣ cách phân loại theo đặc điểm có cấu tạo trung tâm hoạt động - Nhóm III - Metallo proteinase: Có đặc hiệu gốc amino acid phía nhóm –NH– liên kết peptide, đƣợc gọi aminoendopeptidase - Nhóm IV - Aspartic proteinase: Có t nh đặc hiệu nguồn gốc amino acid hai phía liên kết peptide 1.1.3 Cơ chế thủ ph n protease H nh 1.3 h nh prote se thủy phân phân t protein Protease hay peptide hydrolase enzyme thu phân liên kết peptide (-O–NH-) phân t protein polypeptide Sản phẩm q trình thu phân amino acid, peptide, polypeptide chuỗi ngắn 1.1.4 Ứng dụng protease Ngày việc khai thác s dụng enzyme phát triển thành ngành công nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đem lại nguồn lợi không nhỏ Protease đƣợc s dụng rộng rãi nhiều ngành, chiếm 59 lƣợng enzyme đƣợc ứng dụng nhƣ công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dƣợc phẩm nông nghiệp  Công nghiệp thực phẩm [22] Trong công nghiệp sữa, protease đƣợc dùng sản xuất phomat nhờ hoạt t nh làm đông tụ sữa chúng Trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn bột, giảm độ nhớt bột nhào gluten gây ra, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp nở tốt Trong công nghiệp chế biến thịt, đồ hộp, sản xuất dịch đạm thủy phân từ phế liệu giàu protein nhƣ thịt vụn, đầu cá, da Trong chế biến thu sản, sản xuất nƣớc mắm 2.4.6.3 Xá inh th i gi n n m n thích h p Để nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian l n men đến khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng nấm mốc, tiến hành l n men khoảng thời gian khác lần lƣợt 36 giờ, 48 giờ, 72giờ, 96 Điều kiện l n men tƣơng tự nhƣ mục 2.4.6.1 Tiến hành thu dịch enzyme thơ để xác định hoạt độ enzyme Tìm khoảng thời gian l n men th ch hợp Sơ đồ th nghiệm: Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm ác đinh thời gian lên men thích hợp 2.4.7 hương ph p x số iệu Các th nghiệm đƣợc bố tr ngẫu nhi n lặp lại lần Thông số tƣơng ứng với kết khảo sát lựa chọn từ th nghiệm trƣớc đƣợc s dụng làm nhân tố cố định cho th nghiệm 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc Aspergillus Từ nguồn mẫu loại hạt ngô, lạc, đậu tƣơng bị mốc, đề tài phân lập đƣợc 11 chủng nấm có hình thái khuẩn lạc đặc trƣng nấm mốc Aspergillus Giá đ nh bào t : lúc đầu có dạng hình cầu, sau thời gian bị tách thành chuỗi bào t dài, bề mặt cuống có gai mịn, bọng dạng hình cầu, bình tầng thể bình hai tầng, thể bình tầng có dạng hình chai, thể bình hai tầng lớp dạng hình trụ, lớp dạng hình chai, bào t dạng hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích thƣớc lớn, màu vàng nâu sau thời gian ni trở nên xù xì, vách dày [26], ký hiệu là: NA1; NA2; NA3; NA4; NA5; NA6; NA7; NA8; NA9; NA10; NA11 Các chủng nấm mốc có khả thuộc chi Aspergillus phân lập đƣợc sau ngày nuôi cấy tr n môi trƣờng PDA 280C ± 20C Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc chủng nấm phân lập mô tả nhƣ Bảng 3.1 23 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm có khả thuộc chi Aspergillus phân lập Kí hiệu chủng NA1 NA2 Bào từ màu xanh đen,hệ sợi nấm phát triển mép có viền trắng, hệ sợi già có màu đen, khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy 1,6cm, mặt dƣới có màu xanh rêu NA3 Bề mặt bơng xốp, mịn, hệ sợi bào t thời gian đầu màu trắng sau chuyển dần sang màu vàng nâu, khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 1,8cm, mặt dƣới có màu trắng ST T NA4 tả đặc điểm hình thái Bào t màu vàng nhạt, hệ sợi màu trắng, không sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 1,5cm mọc tr n đều, mặt dƣới có màu vàng nhạt Hệ sợi màu trắng xốp, bào t màu vàng , khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy 2cm, mặt dƣới có màu vàng nhạt 24 H nh ảnh NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 Hệ sợi màu trắng sau chuyển dần sang màu xanh oliu, bề mặt nhung mịn, không sinh sắc tố, sau ngày nuôi cấy đƣờng kính khuẩn lạc 1,7cm, mặt dƣới có màu xanh NA6 Hệ sợi màu trắng, bào t màu vàng nâu, khơng sinh sắc tố,đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 0,8cm, mặt dƣới có màu vàng nhạt NA7 Hệ sợi màu trắng, sau bào t chuyển dần sang trắng sữa, không sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 1,4cm, mặt sau có màu trắng NA8 Hệ sợi bơng xốp có trắng xốp, bào t màu vàng, nấm khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 0,7cm mặt sau có màu nâu NA9 Hệ sợi màu trắng sau bào t chuyển dần sang màu xanh đen, không sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 1,3cm 25 NA5 NA6 NA7 NA8 NA9 10 NA10 Hệ sợi màu trắng sau bào t chuyển dần sang màu vàng nâu, khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy 1cm, mặt sau có màu trắng 11 NA11 Hệ sợi màu trắng xốp sau bào t chuyển dần sang màu xanh nâu, khơng sinh sắc tố, đƣờng kính khuẩn lạc sau ngày ni cấy 1,6cm, mặt sau có màu xanh nhạt NA10 NA11 3.2 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease ho t độ cao Để định tính khả sinh protease chủng nấm mốc có khả thuộc chi Aspergillus phân lập, tiến hành tuyển chọn chủng có hoạt tính protease theo phƣơng pháp đo v ng khuếch tán đ a thạch Sau làm chủng đƣợc nuôi cấy lỏng ngày nhiệt độ 300C lắc 180rpm Sau li tâm 10000rpm phút thu dịch enzyme thô kiểm tra hoạt tính protease chủng nấm sinh sau 36 giờ, 48 72 ni cấy Kết thu đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 ết định t nh khả sinh prote se chủng nấm có khả thuộc chi Aspergillus phân lập Thời gian Chủng NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6 NA7 NA8 NA9 NA10 NA11 36 D - d (mm) 16 ± 0,33 18 ± 0,24 ± 0,16 31 ± 0,27 ± 0,31 13 ± 0,29 10 ± 0,14 ± 0,37 ± 0,28 12 ± 0,36 10 ± 0,12 26 48 D - d (mm) 19 ± 0,19 20 ± 0,32 12 ± 0,24 33 ± 0,16 ± 0,19 16 ± 0,33 14 ± 0,27 13 ± 0,29 12 ± 0,32 15 ± 0,16 11 ± 0,23 72 D - d (mm) 15 ± 0,27 17 ± 0,18 11 ± 0,16 29 ± 0,34 ± 0,11 11 ± 0,34 13 ± 0,25 11 ± 0,17 10 ± 0,31 13 ± 0,12 ± 0,36 Hình 3.1 ng phân giải c sein tr n đ th ch củ chủng phân lập đƣợc Từ kết tr n cho thấy, 11 chủng phân lập đƣợc, nhuộm màu với dung dịch Coomassie Brillant Blue R - 250, sau nuôi cấy tr n đ a thạch casein thấy 11 chủng xuất v ng phân giải casein, điều có ngh a 11 chủng nấm phân lập có hoạt t nh protease, chiếm tỉ lệ 100 , với hoạt tính enzyme chủng khác khác (hình 3.1) Thời gian nuôi cấy khác ảnh hƣởng khác đến hoạt tính protease chủng nấm Kết Bảng 3.2 cho thấy thời gian nuôi cấy cho hoạt tính protease cao sau 48h ni cấy 27 Để đánh giá ch nh xác khả sinh protease 11 chủng phân lập đƣợc, tiến hành nuôi cấy môi trƣờng Crapek, lắc 180rpm/ phút, nhiệt độ 300C, thời gian 72h Thu dịch enzyme thô kiểm tra hoạt độ protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến (mục 2.4.4) Kết hoạt độ 11 chủng phân lập đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.3 Kết ác định ho t độ protease chủng nấm mốc Chủng VSV Ho t độ protease TB (U/ml) NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6 NA7 NA8 NA9 NA10 NA11 8,53 ± 0,12 11,43 ± 0,23 9,36 ± 0,19 13,00 ± 0,39 5,24 ± 0,03 10,26 ± 0,27 9,31 ± 0,10 9,06 ± 0,15 8,26 ± 0,08 9,48 ± 0,17 7,94 ± 0,06 Từ kết Bảng 3.3 cho thấy chủng nấm mốc NA4 cho kết hoạt độ cao (13,00 U/ml) cao hẳn so với chủng khác, n n đề tài lựa chọn chủng nấm mốc NA4 cho nghiên cứu 3.3 Kết ác định số đặc điểm sinh học chủng nấm mốc Aspergillus NA4 tuyển chọn Nuôi cấy chủng nấm mốc Aspergillus NA4 tr n môi trƣờng PDA Trên mơi trƣờng chủng Aspergillus NA4 có đặc điểm hình thái nhƣ sau: Khuẩn l c: Tốc độ mọc nhanh, sau ngày đƣờng kính - cm, dày; mặt phải màu trắng chuyển dần thành màu vàng hoa cau Khi già thành màu vàng nâu, mép khuẩn lạc có màu trắng bơng, mặt ,trái có màu vàng nhạt Không sinh sắc tố bề mặt môi trƣờng 28 Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn l c nấm mốc có khả thuộc chi Aspergillus NA4 (A Mặt trƣớc, B Mặt sau) NA4 NA4 Hình 3.3 Bào t hệ sợi chủng nấm N qu n sát dƣới nh hiển vi Quan sát nấm sợi dƣới k nh vi cho thấy: Chủng NA4 có hình sợi, khuẩn ty có vách ngăn, sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to tạo thành tế bào hình chai chuỗi đ nh bào t Tr n đầu tế bào hình chai mọc cuống sinh bào t đ nh Các bào t đ nh x e nhƣ hoa cúc Tế bào có hình trứng hình ovan Hình 3.3 Bào t hệ sợi nấm quan sát dƣới k nh hiển vi bào t chủ yếu hình cầu, hình chùy Cơ qu n sinh sản: Hình cầu hay dạng tỏa tia, k ch thƣớc 33-185 µm, có thành cột,, k ch thƣớc 125-220 x 73-90 µm Cuống mọc từ chất kích thƣớc 256-768 x 7,3 µm Bọng hình cầu hay hình chùy, k ch thƣớc 11-25 x 1833 µm Thể bình lớp hình chai, cổ thn dài, k ch thƣớc 7-11 x 3,6 µm vách dày 29 Các đặc điểm khuẩn lạc vi thể chủng NA4 giống với đặc điểm sinh học lồi thuộc chi Aspergillus mơ tả khóa phân loại Noor Atuqah Zulkifli, Latiffah Zakaria, (2017) [27] Do vậy, sơ định tên chủng NA4 thuộc chi Aspergillus Qua kết bảng 3.3 hình 3.1 tr n cho thấy qua lần th hoạt độ so với chủng nấm có khả thuộc chi Aspergillus phân lập đƣợc chủng nấm Aspergillus NA4 có đƣờng k nh v ng thủy phân lớn nhất: 33mm hoạt độ protease cao 13,00 ± 0,39 ( U/ml) qua lần tuyển chọn Vì vậy, đề tài lựa chọn chủng nấm Aspergillus NA4 để khảo điều kiện l n men xốp chất cám gạo, trấu gelatine nhằm thu đƣợc hoạt t nh protease cao cho th nghiệm 3.4 Khảo điều iện ni cấy kích thích chủng nấm Aspergillus tuyển chọn sinh tổng hợp protease ngo i bào 3.4.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu Để tìm tỉ lệ nguy n liệu th ch hợp cho chủng nấm Aspergillus NA4 tiến hành nuôi cấy chủng nấm Aspergillus NA4 tr n môi trƣờng nuôi cấy giống cấp Crapek nhiệt độ 300C ± 20C, lắc 180rpm/phút sau ngày sau cấy vào mơi trƣờng l n men rắn khối lƣợng 10g với t lệ tiếp giống 10ml/100mg chất, độ ẩm 60 , nhiệt độ 300C ± 20C đồng thời thay đổi tỉ lệ cám gạo, trấu gelatine Kết đƣợc trình bày nhƣ sau: Bảng 3.4 Ảnh hƣởng tỉ lệ cám g o, trấu gel tine đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 Công thức m i trƣờng MT1 MT2 MT3 Ho t độ protease TB (U/g) 14,04 ± 0,23 13,49 ± 0,28 15,38 ± 0,37 30 Dựa vào kết bảng 3.4 cho thấy: thay đổi thành phần lên men khác Thành phần có chứa 25% trấu giúp tăng khả hoạt động nấm mốc, tạo thuận lợi cho trình tổng hợp enzyme nhiều Việc bổ sung chất cảm ứng gelatine mơi trƣờng đủ để nấm mốc sinh protese có hoạt lực cao nhƣ thành phần môi trƣờng thích hợp cho nấm mốc phát triển tạo enzyme có hoạt độ cao là: 70% cám ; 25% trấu ; 5% gelatin Kết phù hợp với nghi n cứu L Nguyễn Đoan Duy, Huỳnh Thị Phƣơng Thảo Nguyễn Cơng Hà (2014) [14], đƣợc s dụng cho khảo sát 3.4.2 nh hưởng nhiệt độ nuôi cấ Th nghiệm nhằm mục đ ch xác định ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 Tôi tiến hành nuôi cấy chủng điều kiện nhiệt độ khác tƣơng ứng 250C, 300C, 350C, 400C với điều kiện nuôi cấy t lệ môi trƣờng 70% cám, 25% trấu gelatine, độ ẩm sau tiếp giống 50 , lƣợng giống cho vào môi trƣờng l n men xốp 10ml/100mg chất Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ nhiệt độ nu i cấy đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 C ng thức th nghiệm Ho t độ protease TB (U/g) 250C 13,93 ± 0,31 300C 15,56 ± 0,30 350C 14,26 ± 0,38 400C 14,02 ± 0,27 Dựa vào kết bảng 3.5 tr n cho thấy: nhiệt độ nuôi cấy th ch hợp chủng Aspergillus NA4 300C sinh tổng hợp protease cao 15,56 (U/g), cao nhiều so với công thức 250C 13,93 Ở điều kiện nhiệt độ khác hoạt t nh protease khác r rệt, nhiệt độ thấp cao ảnh hƣởng không tốt đến sinh trƣởng phát triển nấm mốc Theo Nguyễn 31 Đức Lƣợng (2004) [1], nhiệt độ môi trƣờng th ch hợp nuôi cấy nấm mốc thu nhận protease khoảng từ 290C - 310C Vì tơi s dụng kết cho khảo sát 3.4.4 nh hưởng thời gian nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian đến khả tổng hợp protease nấm mốc Aspergillus NA4, tiến hành nuôi cấy chủng NA4 khoảng thời gian khác tƣơng ứng 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả tổng hợp protease chủng Aspergillus NA4 Thời gian lên men (giờ) Ho t độ enzyme TB (U/g) 36 15,28 ± 0,17 48 16,05 ± 0,28 72 14,52 ± 0,38 96 13,29 ± 0,32 Dựa vào bảng 3.6 kết nhận đƣợc cho thấy: Khả sinh enzyme cao nuôi cấy thời gian 48 giờ, hoạt độ protease 16,05 (U/g) Thời gian nuôi cấy khác khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng Aspergillus NA4 khác Khi thời gian nuôi cấy tăng từ 36 đến 48 hoạt lực enzyme tăng nhƣng kéo dài thời gian nuôi cấy 72 giờ, 96 hoạt lực protease lại giảm Điều giải th ch q trình phát triển nấm mốc môi trƣờng bán rắn trải qua giai đoạn, từ 36 đến 48 nấm mốc phát triển sinh khối chủ yếu, sinh bào t t, enzyme đƣợc tổng hợp mạnh n n hoạt t nh enzyme cao, từ 48 đến 96 trình trao đổi chất yếu dần sinh nhiều bào t n n làm giảm hoạt t nh enzyme Kết phù hợp với nghi n cứu Nguyễn Thị Hiền (2006), Nguyễn Đức Lƣợng (2004) [1], thời gian sinh enzyme cao nấm sợi 30 – 48 Vậy n n chọn thời gian 48 thời gian tốt sinh tổng hợp protease 32 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận:  Đã phân lập đƣợc 11 chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp protease từ vật liệu loại hạt ngũ cốc: gạo, ngô, lạc , đậu tƣơng  Đã tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc có khả thuộc chi Aspergillus có hoạt t nh protease cao từ chọn đƣợc chủng NA4 có hoạt t nh protease cao (hoạt độ protease 13,00 ± 0,39 U/ml)  Đã xác định sơ chủng NA4 thuộc chi nấm Aspergillus  Q trình ni cấy giá thể xốp kích thích chủng NA4 sinh tổng hợp protease đạt hoạt tính cao điều kiện ni cấy gồm: - Thành phần môi trƣờng lên men bổ sung 70% cám; 25% trấu; 5% gelatine (bổ sung làm chất cảm ứng) hoạt độ protease đạt (15,38 ± 0,37 U/g) - Nhiệt độ lên men tốt 300C (hoạt độ protease 15,56 ± 0,30 U/g) - Thời gian l n men tốt 48 (hoạt độ protease 16,05± 0,28 U/g) 4.2 Kiến nghị:  Tiếp tục khảo sát điều kiện l n men xốp nấm sợi nhƣ pH, độ ẩm môi trƣờng, tỉ lệ cấy giống, độ dày mơi trƣờng, chất khống… để thu đƣợc hoạt t nh protease cao  Tiếp tục nghi n cứu th m khả sinh sản xuất enzyme ngoại bào khác từ chủng Aspergillus NA4 nhƣ cellulase, amylase  Nghiên cứu định danh chủng Aspergillus NA4 đến loài 33 I I I I H HẢ IẾNG I Nguyễn Đức Lƣơng (2004), “Công ngh enzyme”, NXB Đại học quốc gia Hà Nội Đặng Thị Thu (2004), “Công ngh enzyme”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Ch , Phạm Thị Trân Châu, (1982), “Enzyme Vi Sinh Vật, tập 1”, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đồng Thị Thanh Thu (2003), “Sinh hóa ứng d ng”, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Lê Minh Nguyệt Phan Thị Phƣơng Thảo (2012), "X y sản uất gi ng h i ộng ho sản uất h o t nấm m ng quy tr nh u or g ns ", T p chí Khoa học Phát tri n 10(5), pp 771- 778 Lƣơng Đức Phẩm (2010), “Giáo trình cơng ngh lên men”, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng, (2004), “Công ngh enzyme”, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng Nguyễn Thị Thùy Dƣơng (2003), “Công ngh sinh học tập - Công ngh sinh học x ý nước thải”, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng (2005), “ iáo tr nh vi sinh vật họ ”, NXB Giáo dục, Hà Nội 10 Nguyễn Văn Thành Trần Thị Yến Minh (2013), vật n ym prot s ải tiến hất ng nướ tương ng ng vi sinh n m n truy n th ng", T p chí Khoa họ Trư ng Đ i học Cần Thơ 26, pp 205-212 11 Trần Thanh Thủy (1999), “ ướng dẫn th c hành sinh hóa vi sinh vật”, NXB Giáo dục, 45–102 12 Trần Thanh Trúc Nguyễn Văn Mƣơi (2015), Tuy n chọn dòng nấm m c Aspergillus niger sinh t ng h p protease ho t tính cao", T p chí Khoa học Trư ng Đ i học Cần Thơ 41, pp 12-20 13 Võ Thị Bích Vân (2010), “Nghiên cứu khả sinh n ym prot s c a s ch ng nấm s i phân lập t i r ng ngập mặn Cần Gi ”, Luận văn Thạc s Sinh học, Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh 14 Lê Nguyễn Đoan Duy, Huỳnh Thị Phƣơng Thảo Nguyễn Công Hà (2014), “Khảo sát trình sinh t ng h p protease t Aspergillus oryzase m i trư ng bán rắn” T p chí Khoa họ Trư ng Đ i học Cần Thơ 33, pp.104109 15 Võ Thị Bích Viên( 2009) „Khảo sát ặ i m sinh học s ch ng nấm s i thuộc chi Aspergillus Penicillium t R ng ngập mặn Cần Gi , Thành ph Hồ Chí Minh” Luận văn Thạc s Sinh học, Trƣờng ĐHSP Tp Hồ Chí Minh I I IẾNG NH 16 Akcan, Nurullah and Uyar, Fikret (2011), "Production of extracellular alkaline protease from Bacillus subtilis RSKK96 with solid state fermentation", Eurasia J Biosci 5, pp 64-72 17 Han, Bei-Zhong, Rombouts, Frans M, and Nout, MJ Robert (2001), "A Chinese fermented soybean food", International journal of food microbiology 65(1), pp 1-10 18 Hong, K J., Lee, C H.,and Kim, S W, (2004), "Aspergillus oryzae GB-107 Fermentation Improves Nutritional Quality of Food Soybeans and Feed Soybean Meals", Journal of Medical Food , pp 430-435 19 Hong, Kee-Jong, Lee, Chan-Ho, and Kim, Sung Woo (2004), "Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals", Journal of medicinal food 7(4), pp 430435 20 Illanes, Andrés (2008), "Enzyme production", Enzyme Biocatalysis, Springer, pp 57-106 21 Negi, S and Benerjee, R (2006), "Optimization of amylase and protease production from Aspergillus awamori in single bioreactor through EVOP factorial design technique", Food Technology and Biotechnology 44(2), pp 257-261 22 Nehra, KS, (2002), "Production of alkaline protease by Aspergillus sp under submerged and solid substrate fermentation", Indian journal of microbiology 42(1), pp 43-47 23 Ogawa, A, (1995), "Production of neutral protease by membranesurface liquid culture of Aspergillus oryzae IAM 2704", J Ferment Bioeng 80(1), pp 35-40 24 Peter Golbitz (2009), "Tradition Soyfoods: Processing and Products", Soyatech, Inc., Bar Harbor, ME 04609 25 Shivakumar, Srividya (2012), "Production and characterization of an acid protease from a local Aspergillus sp by solid substrate fermentation", Arch Appl Sci Res 4(1), pp 188-199 26 Sun, Chang-yan, (2007), "The proteases formation and proteolysis during the incubation of naturally fermented soybean Koji [J]", Food Science and Technology 8, p 059 27 Noor Atuqah Zulkifli, Latiffah Zakaria, (2017), “Morphological and Molecular Diversity of Aspergillus From Corn Grain Used as Liv sto F ”, HAYATI Journal of Biosciences, Volume 24, Issue 1, January 2017, Pages 2634 28 Samson RA , Visagie CM , Houbraken J , Hong SB , Hubka V , Klaassen CH , Perrone G , Seifert KA , Susca A , Tanney JB , Varga J , Kocsubé S , Szigeti G , Yaguchi T , Frisvad JC , (2014), “Phylogeny, i ntifi tion n nom n tur of th g nus Asp rgi us”, Stud Mycol 2014 Jun;78:141-73 29 Ying, Guo Ji-Ping Ma (2007), "Breeding Aspergillus oryzae Strain with High Protease Activity by Ultraviolet Induced Mutation [J]", Microbiology 2, p 011