Phân lập và tuyển chọn chủng lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp axit phenyllactic

LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin chân thành cảm ơn giảng viên hƣớng dẫn TS Vũ Kim Dung, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Nhân tơi xin cảm ơn cô, cán nhân viên mơn cơng nghệ vi sinh – hóa sinh viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp trƣờng đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện tốt cho hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy giáo nhiệt tình giảng dạy suốt thời gian học tập trƣờng Đại hoạc Lâm Nghiệp Trong trình học tập trƣờng nhờ giảng dạy, bảo, hƣớng dẫn nhiệt tình thầy cô mà tiếp thu đƣợc nhiều kiến thức bổ ích chun mơn, nâng cao kỹ sống vốn hiểu biết thân Xây dựng tảng kiến thức vững cho việc hoàn thành khóa luận nhƣ cơng việc sống sau Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời thân giúp đỡ nhiều vật chất lẫn tinh thần để có điều kiện tốt tinh thần vật chất để hồn thành tốt khóa luận Mặc dù cố gắng hồn thành tốt khóa luận song thời gian có hạn, kinh nghiệm thân hạn chế, kỹ yếu với yếu tố khách quan chƣa đáp ứng tốt ƣu cho thí nghiệm Vì khóa luận khơng thể khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc nhật xét, đánh giá đóng góp ý kiến thầy giáo để khóa luận đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn ! Ngày 13 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Lê Sỹ Dũng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI ĐẶT VẤN ĐỀ CHUƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung axit phenyllactic 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu tạo 1.1.3 Cơ chế tổng hợp PLA 1.1.4 Hoạt tính sinh học PLA 1.1.5 Ứng dụng PLA 1.2 Giới thiệu chung vi sinh vật sinh PLA 1.2.1 Giới thiệu nhóm sinh vật sản xuất PLA 1.2.2 Tổng quan Lactobacillus 1.2.3.Tình hình nghiên cứu PLA Việt Nam giới 12 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU13 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Vật liệu 13 2.3.1 Hóa chất 13 2.3.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 13 2.3.3 Nguyên liệu phân lập 14 2.3.4 Môi trường nuôi cấy 14 2.4 Thời gian địa điểm thực đề tài 15 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.5.1 Phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus sp 16 2.5.2 Các phương pháp quan sát hình thái xác định gram vi khuẩn 17 2.6 Phƣơng pháp sàng lọc vi khuẩn Lactobacillus sp sinh axit lactic 19 ii 2.6.1.Định lượng axit lactic 19 2.6.2 Kiểm tra hoạt tính catalase 20 2.6.3 Kiểm tra khả di động chủng sinh axit lactic cao 20 2.6.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng tuyển chọn 21 2.7 Tuyển chọn chủng có khả sinh acid phenyllactic cao 21 2.8 Thu hồi PLA từ dịch lên men 22 2.8.1 Nguyên lý 22 2.8.2 Tiến hành 22 2.9 Kiểm tra hoạt tính ức chế PLA dịch lên men chủng tuyển chọn 23 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus 24 3.2 Tuyển chọn chủng sinh axit lactic cao 28 3.2.1 Kết sàng lọc chủng sinh axit lactic cao 28 3.2.2 Kết khả phân giải CaCO3 dịch lên men chủng tuyển chọn 30 3.2.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng 31 3.2.4 Kết tuyển chọn chủng sinh axit phenyllactic cao 34 3.3 Khả ức chế vi khuẩn dịch nuôi lỏng chủng tuyển chọn sản phẩm PLA 39 3.3.1 Khả ức chế E.coli dịch nuôi lỏng sản phẩm PLA thu 40 3.3.2 Khả ức chế vi khuẩn Samonela dịch nuôi lỏng PLA 41 3.3.3 Khả ức chế vi khuẩn Shigela dịch nuôi lỏng PLA 42 3.3.4 Khả kháng nấm PLA 43 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii KÝ HIỆU VIẾT TẮT PLA : Phenyllactic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information MRS : Man Rogosa-Sharpe PDA : Potato dextrose agar LB : Luria-Bertani OD : Optical density STT : Số tứ tự HT : Hoạt tính TBS – YE : Môi trƣờng dịch chiết đậu tƣơng dịch chiết nấm men iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số lồi vi sinh vật có khả sinh tổng hợp axit phenyllactic [25] Bảng 1.2 Phân loại chi Lactobacillus Bảng 2.1 Kết chuẩn độ axit lactic 19 Bảng 2.2 Kết thí nghiệm hoạt tính catalase củng tuyên chọn 20 Bảng 2.3 Khả di động chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 20 Bảng 2.4 Xác định OD600nm chủng tuyển chọn 21 Bảng 2.5 Thí nghiệm xác định chủng sinh PLA mạnh 22 Bảng 2.6 Vòng ức chế vi khuẩn PLA dịch lên men 23 Bảng 3.1 Hình thái đặc điểm sinh lý chủng phân lập đƣợc 24 Bảng 3.2 Kết hàm lƣợng axit lactic dịch lên men chủng phân lập 28 Bảng 3.3 Kết vòng phân giải CaCO3 dịch lên men 30 Bảng 3.4 Kết đo OD thời điểm lên men khác 10 chủng 32 Bảng 3.5 Bảng đáng giá kết tinh muối canxi phenyllactac thu đƣợc chủng 36 Bảng 3.6 Kích thƣớc vịng kháng khuẩn dịch nuôi lỏng vi sinh vật PLA thu đƣợc 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo axit phenyllactic Hình 1.2 D-Phenyllactic acid Hình 1.3 L-Phenyllactic acid Hình 2.1 Các mẫu đƣợc dùng phân lập 14 Hình 3.1 Hình ảnh phƣơng pháp định danh sơ 24 Hình 3.2 Xác định hàm lƣợng axit lactic phƣơng pháp Therner 28 Hình 3.3 Khả phân giải CaCO3 31 Hình 3.4 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng tuyển chọn 32 Hình 3.5 Hình ảnh dịch lên men 48 72 sau kết tinh 33 Hình 3.6 Các bƣớc tiến hành thu axit phenyllactic 34 Hình 3.7 Hình ảnh kết tinh muối chủng thu đƣợc 36 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng MX2.5, HC4, MX3.2 37 Hình 3.9 khả ức chế E.coli dịch nuôi lỏng PLA 39 Hình 3.10.Khả ức chế vi khuẩn Samonelacủa dịch nuôi lỏng PLA 40 Hình 3.11.Khả ức chế vi khuẩn Shigela dịch ni lỏng PLA 41 Hình 3.12 Khả kháng nấm PLA 42 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, kinh tế ngày phát triển ngƣời sống vội vàng hàng hóa đƣợc chế biến sẵn ngày phát triển đa dạng chủng loại số lƣợng Tuy nhiên việc lạm dụng chất bảo quản có nguồn gốc hóa học ảnh hƣởng lớn tới sức khỏe niềm tin ngƣời tiêu dùng Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm sử dụng chất bảo quản thực phẩm không quy cách, sử dụng chất cấm bảo quản thực phẩm gây nên nhiều trƣờng hợp tử vong hậu nghiêm trọng Cùng với số lƣợng bệnh nhân ung thƣ tăng đột biến năm gần với nguyên nhân hàng đầu đƣợc cho ăn phải thực phẩm bẩn Hiện ngƣời dân lo lắng cho bữa ăn thân gia đình, vụ việc phát công ty sử dụng chất cấm bảo quản hay dƣ lƣợng chất bảo quản làm niềm tin ngƣời tiêu dùng vào sản phẩm ảnh hƣởng lớn đến uy tín cơng ty sản xuất xuất hàng hóa thực phẩm làm ăn chân Do việc sử dụng chất hóa học bảo quản thực phẩm nhƣ rau tƣơi, đồ hộp, thực phẩm chế biến sẵn ngày đƣợc hạn chế thay chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên an toàn Từ lâu, vi khuẩn lactic đƣợc xếp vào nhóm vi sinh vật đƣợc coi an tồn việc ứng dụng thành cơng nhóm vi khuẩn hay hợp chất kháng vi sinh vật mà chúng sản sinh bảo quản thực phẩm đƣợc đề cập nhiều Gần đây, hợp chất sinh học có tiềm ứng dụng nhƣ chất bảo quản thực phẩm đƣợc sinh tổng hợp nhóm vi khuẩn lactic cụ thể thuộc chi Lactobacillus đƣợc nhà khoa học giới phát có tên axit phenyllactic So với nhiều loại bacterioxin sản sinh vi khuẩn lactic nhƣ nisin axit phenyllactic có khối lƣợng phân tử thấp, phổ kháng vi sinh vật rộng tính bền nhƣ độ hịa tan cao [35] Nhiều nghiên cứu chứng minh axit phenyllactic hợp chất an tồn, có khả ức chế vi khuẩn gram âm lẫn gram dƣơng nấm men, nấm mốc, đặc biệt nhiều loài nấm sinh độc tố [27, 15, 34] Tiềm việc ứng dụng axit phenyllactic vào bảo quản thực phẩm nông sản chế biến sẵn loại thực phẩm khác lớn Vì việc nghiên cứu, chọn lọc chủng vi sinh vật có khả sinh axit phenyllactic cần thiết để tiến hành bƣớc nghiên cứu sản xuất CHUƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung axit phenyllactic 1.1.1 Định nghĩa Axit phenyllactic (PLA) có cơng thức phân tử C6H5CH2CH(OH)COOH , dẫn xuất axit lactic Trong phân tử có chứa vòng thơm gốc phân tử axit lactic PLA dễ dàng hòa tan nƣớc tạo thành dạng dung dịch trong, nhiệt độ nóng chảy 121-125ºC, khối lƣợng phân tử 166,2 đvC [18] 1.1.2 Cấu tạo Hình 1.1 Cấu tạo axit phenyllactic Axit phenyllactic dẫn xuất axit lactic Axit phenyllactic có vịng thơm nối với gốc axit lactic Có hai loại axit phenyllactic hai đồng phân axit phenyllactic D-Phenyllactic acid (hình 1.2) L-Phenyllactic acid (hình 1.3) [14] Hình 1.2 D-Phenyllactic acid Hình 1.3 L-Phenyllactic acid 1.1.3 Cơ chế tổng hợp PLA PLA đƣợc tạo hai phƣơng pháp phƣơng pháp hóa học phƣơng pháp sinh học a PLA tổng hợp đƣờng hoá học PLA đƣợc tổng hợp đƣờng hố học thơng qua q trình khử kẽm axit hydrochloric azlactone, q trình hydro hố dƣới xúc tác Raney-N hợp kim Pd-C Bằng phƣơng pháp sinh dạng đồng phân dạng D dạng L Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phƣơng pháp nhiều hạn chế nhƣ điều kiện tiến hành phản ứng phải tuân thủ cách nghiêm ngặt gây ảnh hƣởng tới môi trƣờng sống [11] Do vậy, tổng hợp PLA đƣờng hóa học có ý nghĩa thực tiễn không cao nên không đƣợc ý nhiều b PLA tổng hợp đƣờng sinh học Quá trình tổng hợp PLA đƣờng sinh học có nhiều ƣu điểm Sản xuất PLA theo phƣơng pháp chủ yếu sinh đồng phân dạng D dạng có mặt thể sống Do PLA sản xuất theo phƣơng pháp tổng hợp sinh học dễ dàng đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận [22] Sử dụng vi sinh vật để tổng hợp PLA chi phí rẻ hơn, tác động tới mơi trƣờng, điều kiện tối ƣu cho trình lên men dễ dàng đƣợc điều chỉnh tối ƣu hóa Q trình lên men dễ dàng áp dụng máy móc tự động nhiều công đoạn giúp giảm nhân công tăng suất giúp hạ giá thành sản phẩm nâng cao thu nhập nhƣ ứng dụng PLA sản xuất bảo quản Vi sinh vật có khả tổng hợp chuyển hóa chất có môi trƣờng lên men tạo thành sản phẩm cần thiết với tốc độ trao đổi chất lớn Ở trình này, PLA đƣợc sản sinh số lồi vi sinh vật thơng qua q trình lên men PLA sản phẩm cuối trình biến đổi phenylalanine, số 20 acid amin thiết yếu đƣợc mã hóa DNA Trong q trình biến đổi đó, điều kiện định, phenylalanine chuyển hóa thành axit phenylpyruvic Tiếp đến, hoạt hóa enzym D-phenyllactiacid dehydrogenase, axit phenylpyruvic tiếp tục chuyển hóa thành axit phenyllactic [9] Do đó, sản lƣợng PLA đƣợc tạo phụ thuộc nhiều chủng vi sinh vật sinh PLA thành phần, điều kiện môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật [31] Tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả sinh axit lactic cao bƣớc đầu cho nghiên cứu 1.1.4 Hoạt tính sinh học PLA PLA đƣợc chứng minh có khả ức chế sinh trƣởng phát triển số loài vi khuẩn gram âm, gram dƣơng, nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hại thực phẩm [26, 27, 29] Lavermicocca cộng nghiên cứu PLA đƣợc sinh từ chủng Lactobacillus plantarum có khả ức chế sinh trƣởng phát triển 23 chủng nấm mốc thuộc 14 loài chi Aspergillus, Penicillium Fusarium, đặc biệt có lồi sinh độc tố nhƣ Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum Penicillium citrium phân lập từ sản phẩm nhƣ bánh, bột, ngũ cốc Với liều lƣợng thấp 7,5 mg/ml PLA có khả ức chế phần lớn phát triển chủng [27,28] Ngoài ra, PLA đƣợc chứng minh có khả ức chế Listeria monocytogenes liều lƣợng 13 mg/ml nồng độ 20 mg/ml ức chế số vi khuẩn gây bệnh ngƣời Escherichia coli Aeromonas hydrophila [7, 9] Một nghiên cứu khác nồng độ 7mg/ml, PLA tiêu diệt đƣợc Listeria monocytogenes môi trƣờng dịch chiết đậu tƣơng dịch chiết nấm men (TSB – YE) Mật độ Listeria monocytogenes giảm 100 lần so với ban đầu sau ngày nuôi cấy 25ºC mơi trƣờng TSB – YE có PLA Mật độ vi khuẩn giảm 1.000 lần có mặt PLA giai đoạn vi khuẩn tăng trƣởng PLA có tác dụng ức chế vi khuẩn sữa, lƣợng vi khuẩn giảm 4,5 lần so với lƣợng vi khuẩn ban đầu kiểm tra sữa [29] PLA đƣợc chứng minh có khả tiêu diệt, khả ức chế sinh trƣởng phát triển số loài vi khuẩn gram âm, gram dƣơng, nhiều loài nấm men, nấm mốc gây hƣ hỏng thực phẩm [26, 27, 29] PLA gây 3.2.4 Kết tuyển chọn chủng sinh axit phenyllactic cao Tiến hành khảo sát khả sinh PLA 10 chủng sinh axit lactic cao thông qua khả tạo kết tủa muối canxi phenyllactac phƣơng pháp hóa học mục 2.7 hình 3.6 Đối chứng đƣợc thực điều kiện để so sánh môi trƣờng nuôi cấy đƣợc tiến hành đƣa pH 10-11 tiến hành lọc thu dịch lọc giống nhƣ dịch lên men Kết thu đƣợc thể bảng 3.6 A Dịch lên men B Dịch lên men sau chủng tuyển chọn Bổ sung Ca(OH)2 D Dịch sau lọc C Dịch lên men lọc bỏ cặn thu dịch lọc E Dịch lọc đƣa kết tinh 34 F Tinh thể canxi phenyllactac thu đƣợc G Tinh thể muối sấy khô H Tinh thể muối đƣợc bảo I Axit phenyllactic dịch quản ống effendot phía Hình 3.6 Các bƣớc tiến hành thu axit phenyllactic Vì số lƣợng kết tinh nhỏ so với bình ni tinh thể muối bám chặt vào đáy bình gây khó khăn cho việc lấy tinh thể khỏi bình cân xác định khối lƣợng Do đó, tiến hành đánh giá lƣợng kết tinh chủng tạo thơng qua cảm quan bên ngồi cách đánh giá mật độ tinh thể, kích thƣớc tinh thể biểu diễn kết bảng 3.5 35 Bảng 3.5 Bảng đáng giá kết tinh muối canxi phenyllactac thu đƣợc chủng STT Tên chủng MX 2.5 Kết lƣợng muối thu đƣợc Có xuất tinh thể muối canxi phenyllactic Số lƣợng tinh thể tạo nhiều MX 2.6 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic MX 3.2 Có xuất tinh thể muối canxi phenyllactic Số lƣợng tinh thể tạo nhiều số chủng đƣợc chọn OT1 Có xuất tinh thể muối canxi phenyllactic Số lƣợng tinh thể tạo nhiều Su 2.1 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic Su 2.2 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic HC4 Có xuất tinh thể muối canxi phenyllactic, số lƣợng tinh thể tạo nhiều HC5 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic OS2 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic 10 OS7 Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic 11 Đối chứng Không xuất tinh thể muối canxi phenyllactic Dịch đối chứng môi trƣờng đƣợc bổ sung Ca(OH)2 cho vào điều kiện kết tinh nhƣng không xuất kết tinh từ có để khẳng định kết tinh sản phẩm trình lên men vi sinh vật gây Các kết sau thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn thấy chất sau hồn ngun có khả kháng khuẩn mạnh ƣu việt hoạt tính dịch ni lỏng Bên cạnh đó, sản phẩm q trình lên men lại tạo phản ứng đặc hiệu với thị nhận biết axit phenyllactic phƣơng pháp hóa học Do đó, khẳng định sản phẩm sau hoàn nguyên axit phenyllactic 36 Từ bảng số liệu rút kết luận khả tạo axit phenyllactic 10 chủng tuyển chọn Chủng sinh nhiều kết tinh muối chủng có khả sinh axit phenyllactic mạnh Trong số 10 chủng có khả sinh axit lactic cao nhất, có chủng thấy xuất kết tinh 50C Đó chủng sau: MX2.5, HC4, OT1, MX3.2 Trong chủng MX3.2 có nguồn gốc từ măng muối chua chủng có khả tạo nhiều kết tinh nhất, tinh thể to, rõ ràng Các chủng lại có lƣợng tinh thể kết tinh tƣơng đƣơng nhau, chủng HC4 có nhỉnh chút mật độ tinh thể Trong điều kiện chủng lại MX2.6, SU2.1, SU2.2, HC5, OS2, OS7 đối chứng môi trƣờng lên men cho thấy không xuất kết tinh điều kiện (hình 3.7) A MX2.5 B MX3.2 D Đối chứng C HC4 E OT1 Hình 3.7 Hình ảnh kết tinh muối chủng thu đƣợc 37 Hình ảnh tế bào khuẩn lạc chủng sinh axit phenyllactic mạnh đƣợc thể hình 3.8 A MX2.5 D MX2.5 B HC4 E HC4 C MX3.2 F MX3.2 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào chủng MX2.5, HC4, MX3.2 Sau tiến hành thí nghiệm có kết đáng ý nhƣ sau: + Về hình dạng tinh thể muối thu đƣợc xuất hai dạng chính: - Dạng dạng tinh thể kết tinh lớn, quan sát dễ dàng mắt thƣờng Sau sấy khơ có màu vàng xám, kích thƣớc dài khoảng 2mm, đƣờng kính nhỏ khoảng 0,3mm, hai đầu thuôn nhọn, tinh thể thuôn dài, tinh thể thƣờng đứng độc lập không kết dính với Ngồi ra, tinh thể bám 38 vào đáy bình nên việc thu nhận gặp khó khăn Có thể tiến hành điều kiện phịng thí nghiệm trực liếp loại bỏ dịch, sấy khơ hồn ngun lại acid bình Sau đó, hút dịch li tâm loại bỏ cặn CaSO4 Hoặc lấy tinh thể khỏi đáy bình nhiên phƣơng pháp không thu triệt để lƣợng tinh thể - Dạng thứ hai dạng cặn, chúng có hình dạng tinh thể nhỏ, thƣờng trơi lơ lửng dịch sau lên men Có thể không đủ nồng độ kết tinh thành tinh thể dạng to mà chúng kết tinh thành dạng bơng Đối với tinh thể dạng tiến hành lắng thu phần dịch chứa cặn phía dƣới sau sử dụng máy li tâm cỡ lớn để thu cặn Dạng khó đánh giá không đủ điều kiện thiết bị chúng không đủ kết tinh dạng to số lƣợng nồng độ thấp nên với điều kiện trang thiết bị không đánh giá khả sinh axit phenyllactic thông qua dạng + Khối lƣợng tinh thể thu đƣợc so với lƣợng mơi trƣờng lên men Do vậy, lọc kết tinh qua giấy lọc khó để tách cặn khỏi giấy lọc lƣợng nên dễ sai số cân Theo ƣớc đốn để thu đƣợc 1g tinh thể muối canxiphenyllactac cần phải ni từ 1-2 lít mơi trƣờng trở lên (đối với chủng chọn lọc) Do điều kiện phịng thí nghiệm khơng đủ điều kiện vật tƣ việc định lƣợng axit phenyllactic phải thông qua cảm quan mắt đánh giá mật độ kết tinh tinh thể nhƣ kích thƣớc tinh thể thu đƣợc đáy bình, để lựa chọn chủng có khả sinh axit phenyllactic nhiều 3.3 Khả ức chế vi khuẩn dịch lên men chủng tuyển chọn sản phẩm PLA Sau tiến hành thử khả kháng khuẩn chủng sinh PLA cao sản phẩm PLA thu đƣợc ta có kết nhƣ bảng 3.6 Kết cho thấy khả kháng khuẩn PLA cao dịch nuôi lỏng nhiều lần (kích thƣớc vịng kháng khuẩn lớn hơn) 39 Bảng 3.6 Kích thƣớc vịng kháng khuẩn dịch ni lỏng vi sinh vật PLA thu đƣợc D-d (mm) STT Tên chủng MX 2.5 MX 3.2 HC4 PLA ĐC Shigela Samonela 0 42 0 0 48 E.coli 17 10 15 50 3.3.1 Khả ức chế E.coli dịch nuôi lỏng sản phẩm PLA thu MX3.2 MX2.5 ĐC PLA HC4 Hình 3.9 khả ức chế E.coli dịch ni lỏng PLA Có thể thấy tất dịch ni lỏng có khả kháng lại vi khuẩn E.coli Tuy nhiên, khả kháng khác nhau, kích thƣớc vịng kháng khuẩn khác Đối với dịch lên men vịng kháng khuẩn MX2.5 lớn với kích thƣớc 17mm khơng có tƣợng vi khuẩn mọc lại vịng kháng khuẩn, HC4 với kích thƣớc 15mm, nhỏ chủng MX3.2 với kích thƣớc 10 mm ( hình 3.9) Đối với lỗ thạch chứa PLA vịng kháng khuẩn tạo lớn rõ ràng, khơng có tƣợng vi khuẩn mọc lại khu vực vịng kháng khuẩn, kích thƣớc vịng kháng khuẩn lên tới 50mm (hình 3.9) Đối với lỗ thạch nƣớc cất cho thấy khơng thấy có khả kháng lại E.coli So sánh 40 với báo cáo [5] cho thấy kích thƣớc kháng khuẩn dịch nuôi lỏng chủng thu đƣợc nhỏ kích thƣớc báo cáo cơng bố Trong dịch PLA có kích thƣớc gấp đơi kích thƣớc vịng kháng khuẩn báo cáo khoa học [5] công bố cho thấy khả kháng khuẩn PLA tốt 3.3.2 Khả ức chế vi khuẩn Samonela dịch nuôi lỏng PLA Hình 3.10.Khả ức chế vi khuẩn Samonelacủa dịch ni lỏng PLA Từ hình ảnh cho thấy dịch ni lỏng thu đƣợc khơng có khả ức chế Samonela Các vị trí dịch ni lỏng có vi khuẩn Samonela mọc giống vị trí lỗ thạch đối chứng nƣớc cất Trong vịng kháng khuẩn lên rõ ràng lớn lỗ thạch chứa PLA Nhƣ hình 3.10 vịng kháng khuẩn lớn, rõ ràng, khơng có vi khuẩn mọc lại vịng kháng khuẩn PLA, kích thƣớc vòng kháng khuẩn lên tới 48mm So sánh với báo cáo khoa học [5] cho thấy dịch PLA có kích thƣớc gấp đơi kích thƣớc vịng kháng khuẩn báo cáo khoa học công bố 41 3.3.3 Khả ức chế vi khuẩn Shigela dịch nuôi lỏng PLA Hình 3.11.Khả ức chế vi khuẩn Shigela dịch ni lỏng PLA Hình ảnh cho thấy dịch ni lỏng hầu nhƣ khơng có khả kháng lại vi khuẩn gây bệnh Shigela Ở lỗ thạch có bổ sung dịch ni lỏng có vi khuẩn mọc giống với vị trí đối chứng lỗ thạch có bổ sung nƣớc cất Trong sản phẩm PLA có khả kháng lại vi khuẩn Shigela mạnh, đƣợc thể rõ ràng vòng kháng khuẩn lớn Đối với PLA (hình 3.11) vịng kháng khuẩn lên tới 42mm lớn, rõ ràng không thấy có tƣợng vi khuẩn mọc lại So sánh với báo cáo khoa học [5] dịch PLA có kích thƣớc gấp đơi kích thƣớc vịng kháng khuẩn báo cáo khoa học [5] công bố Điều cho thấy khả kháng khuẩn PLA cao 42 3.3.4 Khả kháng nấm PLA B Ức chế nấm Aspergillus oryzae A Ức chế nấm Aspergillus Hình 3.12 Khả kháng nấm PLA Từ hình ảnh 3.12 ta thấy rõ khả kháng nấm sản phẩm tốt đối chứng khơng xuất vòng kháng khuẩn Nấm mốc nguyên nhân gấy thối hỏng thực phẩm cao sau vi khuẩn Kết PLA có kích thƣớc vịng kháng nấm 52mm sau ngày Kết cho thấy PLA khơng có tác dụng lên vi khuẩn mà cịn có khả ức chế phát triển nấm Do đó, thấy đƣợc tiềm ứng dụng PLA vào bảo quản khả quan 43 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thực đề tài thu đƣợc kết sau: - Đã phân lập đƣợc 31 chủng vi khuẩn có khả vi khuẩn lactic từ mẫu nƣớc dƣa, nƣớc hành muối, cà muối, sung muối… từ cửa hàng thị trấn Xuân Mai Hà Đông- Hà Nội - Đã sàng lọc đƣợc 10 chủng có khả sinh axit lactic mạnh tuyển chọn đƣợc chủng sinh axit phenyllactic mạnh MX3.2, HC4, MX2.5 - Đã xác định đƣợc khả đối kháng cao với vi khuẩn E coli, Samolena, Shigela nấm mốc PLA từ chủng tuyển chọn 4.2 Kiến nghị Phân lập tuyển chọn đƣợc chủng Lactobacillus có khả sinh axit phenyllactic kết bƣớc đầu có ý nghĩa nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn Lactobacillus nghiên cứu sau có liên quan tới khả sinh tổng hợp acid phenyllactic Do thời gian thực có hạn nên đề tài chƣa thể tiến hành nghiên cứu định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus tuyển chọn đƣợc Vì để thu đƣợc chủng Lactobacillus có khả tốt nhƣ định danh rõ ràng chủng thu đƣợc, điều kiện thời gian cho phép tiến hành thực số nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa tế bào nhƣ định danh chủng - Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy nhƣ: môi trƣờng, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc, pH đến khả sinh trƣởng, phát triển khả sinh acid phenyllactic chủng chọn lọc, từ chọn điều kiện ni cấy tối ƣu cho chủng - Nghiên cứu phƣơng pháp tối ƣu cho thu nhận axit phenyllactic 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh, Ngơ Tự Thành, Cơ sở hóa sinh vi sinh vật học công nghiệp NXB Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội Nguyên Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (2007), Vi sinh vật học Vũ Thị Đào 2004 Nghiên cứu sản xuất axit lactic từ rỉ đƣờng mía Báo cáo tổng kết đề tài KC-07-14 Vũ Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Minh Hằng Tạp chí khoa học công nghệ Lâm Nghiệp số (kỳ 1)- 2013, pp.4-9 Nguyễn Thị Minh Phƣơng Bảo quản chế biến hoa tƣơi (2015) II Tài liệu nƣớc Akerberg C., Zacchi G (2000) An economic evaluation of the fermentative production of lacticacid from wheat flour, Bioresour Technol, pp.75119-126 Bellis P.D., Lonigro S.L., Visconti A., Lavermicocca P 2008 Use of Lactobacillus plantarum fermentation products in bread making to prevent 140 Dailey Jr O.D., Dowd M.K., Mayorga J.C (2000) Influence of lacticacid on the solubilization of protein during corn steeping, J.Agric Food Chtôi 48, pp.1352-1357 10.Gerez C.L., Torino M.I., Rollan G., Valdez G.F (2009) Prevention of bread mould spoilage by using lacticacid bacteria with antifungal properties Food control, Volume 20, Issue 2, pp 144-148 11.Gil M.I., Selma M.V., Lopez-Galvez F., Allende A (2009) Fresh-cut prod sanitation and wash water disinfection: Probltôis and solutions International Journal of Food Microbiology, pp 37-45 12.Hofvendahl K., Hahn-Hagerdal B (2000) Factors affecting the fermentative lacticacid production from renewable resources, Enzyme Microb Technol, pp 2687-107 13.Kotzanmanidis C., Roukas T., Skaracis (2002) Optomization of lacticacid production from beet molasses Lactobacillus delbruekii NCIMB 8130, Worl J Microbiol Biotechnol.18, pp.442-448 14.Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A., lazzaroni S., Corsetti A., Gobbetti M 2000 Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B Appl Environ Microbiol 66, pp.4084-4090 15.Lavermicocca P., Valerio F., Visconti A (2002) Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products Institute of Sciences of food production, National research council, 70125 Bari, Italy 16.Li X., Jiang B, Pan B, (2007) Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllacticacid by growing and resting cells of a Lactobacillus sp Biotechnol Lett.29, pp.593-597 17.Li X.P., Jiang B., Pan B.L., Mu W.M., Zhang T (2008), Purification an partial characterization of Lactobacillus species SK007 lactate dehydrogenase (LDH) catalyzing phenylpyruvic acid (PPA) conversion into phenyllacticacid (PLA), pp.2392-2399 18.Magnusson J., Schnurer J (2001) Lactobacillus coryniformis subsp coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Appl Environ Microbiol., 67, pp.1-5 19.Magnusson J., Strom K., Roos S., Sjogren J., Schnurer J (2003) Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lacticacid bacteria Fem Microbiology Letters, 219, pp.129-135 20.Makras L., Triantafyllou V., Fayol-Messaoidi D., Adriany T., Zoumpopoulou G., Tsakalidou E., Servin A., De Vuyst L 2006 Kinetic analysis of the antibacterial activity of probiotic lactobacillitowards Salmonella anterica serovar Typhimurium reveals a role for lacticacid and other inhibitory compounds Res Microbiol 157, pp.241-247 21.Mu W., Chen C., Li X., Zhang T, Jiang B (2008) Optimization of culture medium for the production of phenyllacticacid by Lactobacillus sp SK007.Bioresource Technology 100, pp.1366-1370 22.Mu W., Chen C., Li X., Zhang T, Jiang B (2009) 3-phenyllacticacid production by substrate feeding and pH-control in fed-batch acid by Lactobacillus sp SK007.Bioresource Technology, 100: pp.5226-5229 23.Oh H., Wee Y.J., Yun J.S., Ryu H.W (2003) Lacticacid production through cell-recycle repeated-batch bioreactor, Appl Biochtôi Biotechnol 107, pp.603 613 24.Schnurer J and Magnusson J (2005) Antifungal lacticacid bacteria as biopreservatives Trends in Food Science & Technology 16, pp.70-78 25.Sjogren J., Magnusson J., Broberg A., Schnurer J &Kenne L., (2003) Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Applied and Environmental Microbiology, 69, 7554-7557 26.Strom K., Sjogren J., Broberg A., Schnurer J (2002) Lactobacillus plantarum MiLAB393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo (LPhe-L-Pro) and cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3-phenyllacticacid Appl Environ Microbiol 68, 4322 27.Valerio F., Lavermicocca P., Pascale M., Visconti A.(2004) Production of phenyllactic acid by lacticacid bacteria an approach to the selection of strains contributing to food Quality and preservation FEM,IS Microbiol Lett 233, 289-295 28.Valerio F., Lavermicocca P., Pascale M., Visconti A.(2004) Production of phenyllacticacid by lacticacid bacteria an approach to the selection of strains contributing to food Quality and preservation FEMS Microbiol Lett 233, pp.289-295 29.Vermeulen N., Ganzle M.G., Vogel R.F (2006) Influence of peptide supply andcosubstrates on phenylalanine metabolism of Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451 and Lactobacillus plantarum TMW1468 J Agric Food Chtoi.54: pp.3832-3839 30.Xiaodong W., Xuan G., Rakshit S.K (2004) Direct fermentative production of lacticacid on cassava and other starch substrates, Biotechnol Lett 26, pp.1613-1616 31.đez R., Moldes A.B., Alonso J.L., Parajó J.C (2003) Production of D (-) lacticacid from cellulose by simultaneous saccharification and fermentation using Lactobacillus coryniformissubsp, torQuens, Biotechnol Lett 25, pp.1161 1164 32.Yun J.S., Wee Y.J., Ryu H.W 2003 Production of optically pure L(+) lacticacid from various carbohydrates by batch fermentation of Enterococcu faecalis RKY1, Enzyme Microb Technol Pp.33416-423 33.Yun J.S., Wee Y.J., Ryu H.W 2003 Production of optically pure L(+) – lactic acid from various carbohydrates by batch fermentation of Enterococcus faecalis RKY1, Enzyme Microb Technol Pp.33416-423 34 Zhang X., Zhang S., Shi Y., Shen F and Wang H (2014) A new high phenyllacticacid yielding Lactobacillus plantarum IMAU10124 and a comparative analysis of lactate dehydrogenase gene FBMS Microbiol Lett 356 (2014) 89-96 35.Zhang Z.H., Wu S.X., Yin J.Z (2011) A high phenyllacticacid producing Lactobacillus plantarum strain isolated from ‘Douchi’ – a traditional fermented soybean food Yunnan Province of China Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE) International Conference on IEEE: 1-5, Wuhan, China