KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẮM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLU, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẮM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLU, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNGKHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẮM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLU, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIẸN TRƯỜNG ĐẦI HOC SỪ PHAM TP Hồ CHÍ MINH ••• LÊ THỊ HUỆ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT Sổ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUs, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU TP.HCM, 2010 MỞ ĐÀU Vi sinh vật nhóm sinh vật có số lượng nhiều có khả chuyển hóa vật chất thiên nhiên mạnh Hiện người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hồn tồn theo qui mơ cơng nghiệp Nhiều enzyme khai thác từ vi sinh vật tập trung nghiên cứu có nhiều ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase Những năm sau người ta ý nhiều loại enzyme khác chitinase, enzyme thủy phân chitin Chitin polymer sinh học so sánh với polysaccharide cellulose Chitin phân bố rộng rãi dạng cấu trúc thành tế bào nấm xương ngồi tơm cua trùng Đây polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan nước, chứa đơn phân V-acetyl-glucosamine liên kết liên kết 1,4-P-glucoside Chitin có nhiều cơng dụng ương nhiều lĩnh vực y học cơng nghiệp Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa phân giải chitin nghiên cứu nhiều năm gần Chitin bị phân giải hệ enzyme có tên gọi chung chitinase Enzyme sản xuất tổ chức sống tế bào để phục vụ nhu cầu chức sinh lý chúng Sự phân giải chitin tác động enzyme phụ thuộc vào yếu tố hóa lý (tỉ lệ chất enzyme, pH, nhiệt độ ) Trong nguồn thu nhận chitinase chitinase từ vi sinh vật nguồn quan trọng Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Streptomyces, chủng nấm sợi thuộc chi Asperỉllus, Peniciỉỉium, Trichoderma, số động vật nguyên sinh Những năm gần có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase tiềm ứng dụng to lớn enzyme nhiều lĩnh vực khác thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng y học, việc kiểm sốt nấm kí sinh trồng V V Vì ứng dụng rộng rãi chitinase hên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên cứu sinh tổng họp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng họp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trìchoderma ứng dụng Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả tổng họp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Chọn chủng nấm sợi sinh tổng họp chitinase cao để nghiên cứu tiếp - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng trình sinh tổng họp chitinase chủng nấm sợi chọn tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm - Thu nhận chế phẩm chitinase - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ chất, thời gian thủy phân chất - Bước đầu thử nghiệm số ứng dụng chế phẩm chitinase từ nấm sợi Thời gian địa điểm nghiên cứu đề tài Thời gian : từ tháng 8/2009 - 7/2010 Địa điểm : Đề tài thực Phịng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.1.1 Khái quát enzyme 1.1.1.1 Cẩu trúc [1,23] Enzyme loại phân tử protein sinh vật tổng họp nên tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, cấu tạo từ L-acid amin liên kết liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi trung tâm hoạt động enzyme Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme cấu tử gồm enzyme có thành phần hóa học protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm enzyme có hai thành phần: phần protein gọi apoenzyme có vai trị xúc tác, phần thứ hai phi protein coenzyme chất hữu đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác Ngồi có số kim loại Zn, Cu, Mn, Fe đóng vai trị liên kết enzyme chất trình xúc tác phản ứng, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử 1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23] Trung tâm hoạt động enzyme (E) có cấu trúc khơng gian tương ứng với chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trình enzyme tiếp xúc với chất “chìa khóa-ổ khóa“ tạo phức họp enzyme-cơ chất Quá trình tác động enzyme vào chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với chất (S) nhờ liên kết tạo phức E-S Giai đoạn 2: Khi chất (S) tạo phức với enzyme (E), chất bị thay đổi cấu hình khơng gian mức độ bền vững liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, giải phóng nguyên vẹn Sản phẩm (P) tạo thành Sơ đồ chế tác động enzyme: E + s E-S -> E + p 1.1.13 Phăn loại enzyme [16,23] Có nhiều cách phân loại enzyme, đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác enzyme Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp Moscow đề bảng phân loại mới, enzyme chia làm lớp chính: - Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hồn nguyên sinh học) - Transferase (lớp enzyme vận chuyển) - Hydrolase (lớp enzyme thủy phân) - Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo đường thủy phân) - Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất) - Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa) 1.1.2 Enzyme chitinase [32] 1.1.2 L Cẩu trúc Chitinase [Poly- Beta- 1- - (.2-acetalmỉdo-2-deoxyj - D-glucosỉde glucanohydrola.se] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4 glucoside Ci c4 hai phân tử N- acetyl Glucosamine liên tiếp chitin Mã số enzyme chitinase EC 3.2.1.14 —*■ Hydrolase —> Glycosylase —> Glycosidase 14 —> Chitinase Chitinase cịn có tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) chitodextrinase, P-poly-Nacetyl glucosamine, ChiAl (Bacỉllus cỉrculans), Chitotriosidase (Homo sapỉens), ChiC (Streptomyces griceus) Căn vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20 > Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn với khoảng 180 chi, tìm thấy hầu hết loài thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, ngồi cịn có enzyme khác chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn a/p cuộn tròn, chúng hoạt động thơng qua chế kiểm sốt mà đoạn p polymer bị phân cắt tạo sản phẩm p anomer [32] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 tổng họp từ giống Aeromonas hydrophila, Bacillus circularỉs, Trichoderma harzianum, Aphanocladỉum album, Serratỉa marcescens Hình 1.1 Cấu trúc không gỉan chỉtinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68] > Họ Glycohydrolase 19 Họ gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu thực vệt, cịn có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae Chúng có cấu trúc hình cầu với vịng xoắn hoạt động thơng qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm chỉtinase thuộc nhóm I, n,IV Hỉnh 1.2 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69] > Họ Gỉycohydroỉase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm P-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosamỉnỉdase từ vi khuẩn, Streptomyces người Ngồi ra, dựa vào trình tự đàu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptỉde nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chỉtínase thành nhóm: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng gắn kết enzyme chất chitin khơng cần cho hoạt động xúc tác Nhóm E: đồng phân enzyme phân tử cỗ tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amỉno acid tương tự chỉtỉnase nhỏm I Chitinase nhóm n có thực vật, nấm, vi khuẩn Nhóm EI: trình tự amỉno acỉd hồn tồn khác với chỉtỉnase nhóm I n Nhóm IV: nhũng đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41-47% trình tự amỉno acid tâm xúc tác chúng tương tự chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein kích thước phân tử nhỏ đáng kể so vởi chitinase nhóm I Nhóm V: dựa liệu trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chỉtỉn (vùng giàu cysteỉn) giảm đỉ nhiều lần q trình tiến hóa thực vệt bậc cao 1.1.2.2 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase [11] Enzyme phân giải chitỉn bao gồm: endochitinase, chỉtin 1-4-p- chitobiosidase, N-acetyl-p - Dgỉucosamỉnidase (exochitinase) chỉtobiase Endochitinase enzyme phân cắt nội mạch chỉtỉn cách ngẫu nhiên tạo đoạn olygosaccharides, nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum (2 loại endochitỉnase: Mi = 36kDa, pli = 5,3 (± 0,2) M2 = 40kDa, pỈ2 = 3,9), Gỉiocỉadium vỉrens (M = 41kDa, pl = 7,8) Chỉtin 1,4-p - chỉtobỉosidase enzyme phân cắt chỉtỉn tạo thảnh sản phẩm dimer chỉtobỉose, cụ thể enzyme thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pl = 4,4 ± 0,2) N-acetyỉ - p~ D - gỉucosaminidase (exochitinase) enzyme phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm monomer N-acetyl-D-glucosamine N-aceiy1-j8^lucosĩtniíriclase endocKtias dìítobiosidase e sncilysozynie Polymer oíXI^MM-Acetyl-D-gỉucosamine units Chitobiase enzyme phân cắt chitobỉose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamỉne Hình 1.3 Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70] Hoạt tính enzym r Các sản phẩm cuối Endochitìnase phân cắt ngẫu nhiên nộỉ mạch chỉtin chỉtoolỉgomer, sản phẩm tạo thành hỗn hợp polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, chiếm đa số dỉacetylchỉtobiose (GlcNAc)2 hoạt tính endochỉtinase khơng thể phân cắt thêm nữa.-aa ( À) J= o _X cc '£ emlochinna.se (EC 3.2,1.14) oyi^H-ệ y (g) chititi 1,4-8-chitobiosídase AAAAAAA ũ-/V-acetvìhexosaminÌdase (£C 3.2,1.52) Oằ~0 ■0.'#,,a.'0v #,~6, ê ■ 0,0,0 AAAAAAAAAAAAAAA ® = GlcNAc = NAG = N-acetyl-P-D-glucosarnin * Vi sợi cbitin o = A = Vị r í thúy giải Đầu khử t Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme chitỉnase Trichoderma [11] Chitìn ỉ,4-chitobiosidase phân cắt chitin chitooligomer mức trùng hợp lớn hay [(GlcNAc)n với n > 3] từ đầu không khử phóng thích dỉãcetylchỉtobiose (GlcNAc)2 p -N- acetyl hexosaminidase phân cắt chitooligomer hay chitin cách liên tục từ đầu khơng khử phóng thích đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chỉto-olỉgosaccharỉde làm chất Các olỉgsaccharỉde thường thủy phân bên vài vị trí xác định cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả thủy phân trỉsaccharỉd, số khác thỉ khơng Có hai dạng chỉtỉnase thủy phân pentasaccharide: phân cắt bên tạo dỉsaccharỉd trisaccharid; phân cắt bên tạo monosaccharid tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất enzyme cắt ngẫu nhiên Endochỉtỉnase, chỉtobỉosỉdase (3 -N- acetyỉhexosamỉnidase hoạt động chất dịch huyền phù chỉtin, vách tế bào nấm, chitooligomer hoạt động chỉtỉn thô thu từ vỏ tôm Chitin vách tế bào nấm chứa chitin chất thích hợp cho endochỉtinase chitobiosidase P-N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 cao sợi chỉtỉn chất loại enzyme p-N-acetylhexosamỉnidase hoạt động chậm việc làm giảm độ đục huyền phù chitin (GlcNAc)2 chất tốt P-Nacetylhexosaminidase không chất endochỉtỉnase hay chỉtobiosỉdase Chính sử dụng để phân biệt hoạt tính endochitinase, chỉtobỉosidase p-N- acetylhexosaminỉdase Sản phẩm sau phân cắt N-acetyl glucosamine Chitin dạng bột Chitin huyền phù ❖ Nhân xét 0,041 11,79 11,8 0,123 35,55 35,5% Số liệu bảng 3.13 rằng, hiệu suất thủy phân chitin chitinase nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 50°c thời gian phản ứng 60 phút cho hàm luợng glucosamine đạt l,79pg/ml từ nguyên liệu chitin dạng bột 35,55 pg/ml sử dụng nguyên liệu chitin dạng huyền phù Hiệu suất thủy phân CPE thấp (trung bình 11,79% nguyên liệu chitin dạng bột 35,55% nguyên liệu chitin huyền phù) nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí thấp, đáng để nghiên cứu sử dụng.Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong q trình làm thí nghiệm chúng tơi rút số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp chitinase ba chủng nấm sợi là: Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp 35°C; thời gian thu enzyme tốt 36-40 Aspergỉllus sp.: nhiệt độ thích hợp 40°C; thời gian thu enzyme tốt 72 Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích họrp nhất: 30°C; thời gian thu enzyme tốt 60 - Chitin chất cảm ứng tốt để nuôi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase - Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu tương thích với thực nghiệm: ỷ=0.82 + o.llxi - 0.08x2+ 0.35x3 + 0.30XIX2+0.14XIX3 Từ suy điều kiện tối ưu cho trình sinh tổng hợp chitinase chủng Aspergillus awamori thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuôi 32°c, lượng chitin bổ sung thích hợp 16% - Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus awamori nhiệt độ 50°c, pH = 4,0 - Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergỉllus awamori diệt trừ sâu hại thu nhận glucosamine từ chitin 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase số chủng nấm mốc khác - Tiếp tục nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi enzyme lĩnh vực sản xuất thuốc trừ sâu sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liêu tiểne Viêt [1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần Giờ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn sổ chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại Việt Nam khả ứng dụng Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học [4] Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm vỉ nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục [6] Nguyễn Lân Dũng tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vỉ sinh vật học (tập 2, tập 3) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [8] Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam (tậpl) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] Bùi Xuân Đồng (1997), Vỉ nấm dùng công nghệ sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [10] Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus ýìmentarius) Báo cáo tổng kết nghiệm thu Đồ tài Nghiên cứu Khoa Học, Sở Khoa học Công nghệ TP HCM, Ừ153-160 [11] Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chỉtỉnase Trỉchoderma vai trị kiểm sốt sinh học Báo cáo chun đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thảnh phố Hồ Chí Minh [12] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tỉnh số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đẩt khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [13] Tơ Duy Khương (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trìchoderma spp khả đổi kháng với sổ nấm gây bệnh thực vật Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [14] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [15] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ảnh Tuyết (2006), Thỉ nghiệm công nghệ sinh học (tập 2- thỉ nghiệm vỉ sinh vật học) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [16] Nguyễn Đức Lượng tác giả (2004), công nghệ enzym NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [17] Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trỉchoderma reeseỉ Aspergỉllus nỉger môi trường lên men bán rẳn Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [18] Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vỉ sinh NXB Giáo dục [19] Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cửu thu nhận enzym chỉtỉnase khoai lang (Ipomoea batatas) Khánh Hòa Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản - số 03/2008 [20] Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hóa ứng dụng NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [21] Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995) Kết nghiên cứu bước đầu nấm Trichoderma, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210 [22] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vỉ sinh vật học NXB Giáo dục [23] Lê Ngọc Tú tác giả khác (1982), Enzym vỉ sinh vật (tập 1, tập 2) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [24] Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergỉllus awamori sinh tổng hợp Endo-ỊỈ-1,4-Glucanase đánh giả tinh chất lý hỏa Endo~P~l,4-Glucanase Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên [25] Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liêu tiếng Anh [26] A Kapat, T Panda, S.K Rakshit (1996), Parameters optỉmỉzatỉon of chitin hydrolysỉs by Trỉchoderma harzỉanum chỉtỉnase under assay conditions Bioprocess Engineering 14, p.275279 [27] A A Shubakov and p s Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Fiỉamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 [28] Azaliza Saíarida Wasli, madihah Md Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor Muhammad Mahadi (2009), Medium Optỉmỉzation for Chitinase Production from Trỉchoderma vỉrens using Central Composite Design Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol 14, No 6, p 781-787 [29] Brinda Mahadevan and Don L Crawford (1997), Properties of the chitìnase of the antỉỷugal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 Enzyme and Microbial Technology 20, p.489493 [30] Crispinus A Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purị/ìcation and characterizatỉon of a chitinase from Trỉchoderma vỉride The Joumal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61 [31] Daizo Koga (2005), Application of Chỉtinase in Agrìculture Joumal of Metals, Materials anh MineralsVol 15 No l,p.33-36 [32] Jennifer L Guthrie, Sagal Khalif, Alan J Castle (2005), An improved method for detectỉon anh quantịỷìcation of chitinase actỉvỉtỉes Canadian Joumal of Microbiology Vol 51 Iss 6, p.491495 [33] Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chỉtỉnolytic activity of bacteria and fungỉ isoỉated from shrimp exoskeletons International Joumal of Oceanography and Hydrobiology Yol XXXVI, No.3, p 101-111 [34] Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic emymes: a review Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782 [35] N.N Nawani, B.p Kapadnis (2005), Optỉmỉzatỉon of chỉtỉnase production using statỉstỉcs based experimental designs Process Biochemistry 40, p.651-660 [36] Nopakam Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultỉlỉzation of Shrimp Sheỉựìsh Waste as a Substrate for Soỉid-State Cultỉvatỉon of Aspergillus sp Sl-13: Evaluation of a Culture Based on Chitỉnase Formation Whỉch ỉs Necessary for Chỉtin-Assỉmỉlation Joumal of Bioscience and Bioengineering Vol 93, No 6, p 550-556 [37] p Arthur Felse, T Panda (1999), Self-directỉng optỉmỉzatỉon of parameters for extracellular chitinase productỉon by Trỉchoderma harzỉanum in batch mode Process Biochemistry 34, p.563566 [38] Phakapob Setthakaset, Rath Pichyangkura, Anawat Atavakom and Mongkol Sukwattanasinitt (2008), Preparation of N-acetyl-D-Glucosamine Using Ernyme from Aspergillus sp Joumal of Metals, Materials and Minerals, Vol 18, No 2, p 53-57 [39] Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an exploratỉon [40] Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi andplants theỉr ỉn morphogenesis and host parasite iníerattion FEMS microbiol rev 11, p 317-338 [41] S.M Akhir, s Abd-Aziz, M.M Salleh, R.A Rahman, R.M Ilias and M.A Hassan (2009), Medium Optimỉsation of Chitỉnase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus lichenỉformỉs TH-1 by Responnse Surface Methods Biotechnology (1), p 120-1205 [42] Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997), An Aspergỉllus awamori acetylesterase: purịỷìcation of the enzyme, and clonỉng and sequencing of the gene.Bio chem J 326, p.485-490 [43] Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus nỉger expressed ỉn A Niger Chemical and Technical Assessment Internet [44] www.coe.drexel.edu/ ■ /researchfocus html [45] http://www.yduocngaynay.com/8-8TK TrVHung cua.htm [46] http://www.moit.gov.vn/vsi portlets/UserFiles/File/Danhsachtuvenchon.doc [47] http ://www lboro ■ ac uk/departments/cg/Proị ects/2001/clarke/introduction.html [48] http://www.vnn.vn/khoahoc/suckhoe/2005/01/370883/ [49] http://www.fìstenet gov [50] http://www.nutrifood.com.vn [511 http://www.vnexpress.net [52] http://www.webtretho.com/forum/register.php [53] http://Psre.usm.edu [54] http ://www.meronbiopolymers ■ com [55] http://www.oligophar.ru [56] http://www.ozemail.com.au/zadco/trichoderma.htm [57] http://www.moi gov.vn [58] http://www.Roorthing-biochem.com/default.htlm [59] http://hoahocvietnam.com.vn [60] http ://vietnam.net [61] http://wdcm.nig.ac.ip/catalogue/ncim/docmnent/Ncim s fungi.pdf [62] http ://www ecfg 10 ■ info/images/Asperfest7Program.pdf [63] http ://www i gb fraunhofer de/www/gf/molbiotech/weissebiotech/en/Chitin en.html [64] http://www.palaeos.com/Eukarya/Units/StemMetazoa/Microsporidia.html [65] http://www.moldbacteria.com/Aspergillus niger.gif [66] http://www.pf.chỉba-u.ac.ip/gallerv/fungi/a/Aspergillus niger colony.htm [67] http://www.mold.ph/trichoderma.htm [68] http ://dello yd Ome gs ■ com/moreinfo/buffers2 html#buffer [69] http ://www spices res ■in/spicebioinfo/proi ecưchitinase/result.php [70] http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzvme-explorer/leamingcenter/carbohvdrate-analvsis/carbohvdrate-analvsis-ii.html 1.1 PHỤ LỤC http://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc/thuoc-goc945.aspx 1.2 PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẪN GLUCOSAMINE có nồng độ từ40-70jug/mỉ BảngP.l Đường 0chuẩn Glucosamỉne Glucosamine 10 0,115 0,000 20 30 0,148 0,165 0,033 0,054 40 0,216 0,101 50 0,561 0,146 60 70 0,297 0,325 0,182 0,210 0,340 0,225 1.3 1.3 1.5 Đồ THỊ P.l-ĐƯỜNG CHUẩN GLUCOSAMINE Biểu DlễN MỐI TƯƠNG QUAN GIŨA AOD VÀ HÀM LượNG GLUCOSAMINE Khối lượng vỏ tôm ban đầu 100 gam, xay nhỏ tiến hành thu nhận chitin theo bước 2.4.5 Cân khối lượng chỉtin, xác định tỉ lệ chitỉn có vỏ tơm Bảng P.2- Khối lượng chitin thu từ vỏ tôm PHỤ LỤC - THU NHẶN CHITIN TỪ VỎ TÔM Số lần thí nghiệm Khổỉ lượng chỉtin thu đưực (g/100g nguyên liệu) 2 Trung bình 18,65 19,25 18,95 18,95 Hình P.2 Chỉtỉn từ yỏ tơm ❖ Nhận xét kết Khối lượng chỉtin thu 18,95/100 g vỏ trân, tỷ lệ thấp thục tế (khoảng 30%) kỹ thuật tách chiết cồn hạn chế, có mát q trình lọc, rửa ; ngun liệu cịn lẫn tạp chất Chỉtin vơ tơm 18,95 %, khoảng 81 % thành phần cịn lại chủ yếu khoáng protdn PHỤLỤC Hình P.3 - Huyền phù chỉtỉn Hình P3 - Hiện màu thuốc thử DNS nghiệm thử thật ống thử không enzyme chitinase từ chủng 4a Dung dịch đệm acetate( pH= 3,6-5,6) a Aspergữlus mvamorỉ Dung dịch acid acetic 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến lOOOml PHỤ LỤC b Dung dịch Natriacetate 0,2 M: 16,4g CH3COONa 27,2g CH3COONa.3H20 hòa tan dẫn nước đến lOOOml nước cất Giá trị pH dung dịch đệm phụ thuộc vào sốbml (ml) dung dịch a sốpH ml dung dịch (b)adẫn (ml)đến lOOml a (ml) b (ml) pH 46,3 3,7 3,6 25,5 24,5 4,6 44 3,8 20 30 4,8 4b Dung dịch đệm Cacbonat (pH = 9,2- 10,7) a Dung dịch Natricacbonate 0,2M: 21,2 g Na2CƠ3 hòa tan dẫn nước cất đến lOOOml b Dung dịch Natrihydrocacbonat 0,2M: 16,8 g NaHC03 hòa tan dẫn nước đến 1000 ml Dung dịch đệm cacbonat có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) dẫn nước đến 200ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46 9,2 27,5 22,5 10 7,5 42,5 9,3 30 20 10,1 9,5 40,5 9,4 33 17 10,2 13 37 9,5 35,5 14,5 10,3 16 34 9,6 38,5 11,5 10,4 PHỤ LỤC - PHA DUNG DỊCH ĐỆM [67] 19,5 30,5 22 28 25 25 9,7 9,8 40,5 9,5 10,5 42,5 7,5 10,6 9,9 45 10,7 Bảng P.5 - KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE SỐ LOẠI LƯỢNG SÂÙ SÂÚTN írn\i\ SÂU 20 SÂU 10 2CON/TN NÒNG Độ CPE to/_\ 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 2 TRÊN SÂU THỜI GIAN TN1 (PHÚ SL 30 60 90 120 150 30 60 12 90 16 120 17 150 18 30 10 60 14 90 18 120 20 150 20 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 % 10 15 15 25 40,0 60,0 80,0 85,0 90,0 50,0 70,0 90,0 100 100 0 10 20 40 30,0 60,0 70,0 70,0 90,0 60,0 70,0 TỈ LỆ TN2 SL 2 4 12 15 16 16 12 14 17 20 20 0 4 6 10 SÂU CHÉT TN3 % SL % 0 10 10 15 20 20 20 20 35,0 35 60,0 11 55 75,0 16 80 80,0 16 80 80,0 17 85 55 60,0 11 70,0 85,0 100 100 0 30 40 40,0 60,0 60,0 80,0 100 70,0 80,0 14 16 19 70 80 95 20 0 1 8 9 100 0 10 10 30 40 70 80 80 90 70 90 TB SL 0,0 1,7 2,7 3,7 4,3 7,3 11, 15, 16, 170 11 14, 17, 197 20, 0,0 00 0,7 2,0 3,7 3,7 6,3 7,0 7,7 9,3 6,7 8,0 % 8,3 13, 183 21, 367 58, 78, 81, 85, 55, 70, 85, 983 100 0 6,7 20 36, 367 633 70, 76, 933 667 80, PHỤ LỤC 2 90 120 150 10 10 90,0 100 100 10 10 10 100 100 100 10 10 90 100 100 9,3 10, 100 93, 100 100 ... chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng họp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trìchoderma ứng dụng Mục... VÀ THẢO LUẬN 3.1 3: KHẢO SÁT Sơ Bộ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SO® Chúng tơi tiến hành khảo sát sơ (phương pháp định tính) khả nâng tổng hợp chitinase số chủng nấm sợi. .. chọn chủng nấm sợi có khả tổng họp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng