2.3.1 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống nấm sợi [1, 6,12]
Thực hiện: Chuẩn bị môi trường PGA, cho vào các ống nghiệm, đem hấp khử trùng, lấy ra để
nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Thực hiện trong buồng cấy: cấy bào tử chủng nấm nghiên cứu lên bề mặt thạch trong ống nghiệm. Để ống vừa cấy chuyền ở nhiệt độ phòng (28 - 30°C) trong thời gian 7 ngày, sau đó đem vào tủ giữ giống 4°c. Sau 2 tháng cấy chuyền một lần.
2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng họp enzyme chitỉnase bằng cách đo đường kính vịng phân giải [1,12, 22]
Ngun tắc: khi ni cấy trong mơi trường thạch có bổ sung chitin, nấm sợi sinh enzyme
chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase.
Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng họp enzyme chitinase (MT 4), hấp khử trùng ở
121°c trong 30 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng (sấy ở 160°c trong 120 phút) có kích thước bằng
nhau, cho 20ml môi trường từ ống nghiệm vào đĩa, để nguội, sau 1-2 ngày kiểm ưa sự tạp nhiễm. Cấy chấm điểm chủng nấm sợi nghiên cứu vào đĩa, có thể chấm một điểm giữa hoặc 3 điểm ưên đĩa petri. ủ ở nhiệt độ phòng (28-30°C) ưong 2-3 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để 5 phút rồi đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc.
Nếu D - d > 25mm : hoạt tính enzyme mạnh
D - d > 20mm : hoạt tính enzyme khá mạnh
Nước lOOOml
D - d < lOmm : hoạt tính enzyme yếu
Từ đó chọn chủng có tạo hệ enzyme thủy phân chitinase từ khá ưở lên tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa.
Cách pha dung dịch Lugol
2.3.3 KI 5gPhương pháp nuôi cấy nấm sợi trên môi trường bán rắn thu enzyme chỉtỉnase
[12, 34]
Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong mơi trường để sinh trưởng, tổng
hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô từ canh trường.
Thực hiện: Cân 10 gam môi trường bán rắn nuôi cấy nấm sợi thu enzyme chitinase (MT 5) vào
các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 121°c trong 30 phút, sau đó để nguội. Dùng giống trong ống thạch nghiêng, cho lOml nước cất vô trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết bào tử tạo dạng huyền phù.Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hống cầu. Cho 2ml huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác chứa mơi trường đã chuẩn bị (mật độ bào tử là 105 đến 106 bào tử/1 gam môi trường). Nuôi ở nhiệt độ phịng. Canh trường ni cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian, điều kiện nhiệt độ, pH nhất định theo mục đích nghiên cứu cụ thể.
2.3.4 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô và thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường ni cấy [1,12,15]
Ngun tắc: Dựa trên khả năng hịa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hòa tan tạo
dịch enzyme, sau đó dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy
ở nhiệt độ dưới 40°c, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khô.
Thực hiện: Sau khi nuôi cấy trong các điều kiện mơi trường cụ thể, cho vào mỗi bình tam giác
(chứa 10 gam môi trường) 80ml nước cất. Lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vòng/ phút, lọc qua vải, thu dịch lọc. Đem dịch lọc li tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, ta được dịch enzym thô. Để thu được chế phẩm enzyme (CPE) dạng bột khô, sử dụng tác nhân tủa là Etanol 96° với tỉ lệ 1/3 - 1/4 (dung dịch Enzyme/Etanol) để kết tủa enzyme, ly tâm thu tủa enzyme, sấy nhiệt độ dưới 40°c được sản phẩm (CPE).
2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) [11,12]
Định nghĩa
Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, phương pháp này cho phép tiết kiệm thời gian cùng kết quả chính xác cao so với các phương pháp khác.
3,5-dinitrosalicylic acid 3-amino-5-nitrosalicylate
Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-P-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 535nm.
❖ Hóa chất
* Dung dịch đệm phosphat 0,2M, pH 6,5
- Dung dịch NaH2P04 0,2M: cân 3 l,2g NaH2P04.2H20 hòa tan và thêm nước cất đến lOOOml. - Dung dịch Na2HP04 0,2M: cân 71,6g Na2HP04.12H20 hòa tan và thêm nước cất đến
lOOOml.
* Thuốc thử DNS
- Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan lOg 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N.
- Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh khơng khí.
♦♦♦ Chuẩn bị dịch huyền phù chỉtin 1%
Do chitin khơng hịa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 gam chitin hòa tan trong 50ml HC1 đậm đặc. Khuấy đều trong vịng 3 phút ở 40°c. Sau đó cho nước cất lạnh 5°c từ từ tới 500ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh (2-6°C).
❖ Dựng đường chuẩn N-acetyl-P-D-Glucosamine
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamỉne
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ N-acetyl-P-D- 0 1 2 3 4 5 6 7
Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-P-D-Glucosamine chuẩn 10|Lưnol/ml: cân chính xác 0,0221g N- acetyl-P-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml.
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-P-D-Glucosamine và giá trịOD.
❖ Xác định hoạt độ enzyme chitinase
Nguyên tắc: hoạt độ enzyme chitinase được xác định dựa ưên phương pháp định lượng
glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan.
Tiến hành
° Đối với enzyme làm thỉ nghiệm
Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày.
Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: lml huyền phù chitin 1% và lml dịch enzyme chitinase. Hỗn họp này được ủ ở 50°c trong vòng 60 phút.
Ngừng phản ứng bằng lml NaOH IN và đun sôi cách thủy trong 5 phút.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi.
Cho lml dịch nổi và lml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh.
Thêm 5ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm. Glucosamine 10pmol/ml chuẩn
(pmol/ml) Thể tích dung dịch N-acetyl-P- D- Glucosamine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 DNS (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1
đều, đun sôi 5 p
0 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5
° Đối với dịch enzyme làm đổi chứng
Cho lml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ lml NaOH IN, sau đó cho thêm lml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên.
Cách tính [16]Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải
phóng 1 fjg N- acetyl-P-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (50°C).
Tổng hoạt tính (đvht) = a’n^
Hoạt tính chung (đvhƯg.CP.E ) = a'n'v
v.t.m
Trong đó
a: hàm lượng glucosamine (pg /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha lỗng n: hệ số pha lỗng
V: thể tích dịch mơi trường nuối cấy (ml) v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml)