Sàng lọc các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzyme protease từ rừng ngập mặn Cần Giờ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Với mục đích thu được nhanh các chủng có khả năng sinh protease như mong muốn, chúng tôi chuẩn bị sẵn MT có chất cảm ứng sinh protease ( ghi ở mục 2.1.3) trong bình tam giác đặt ở nhiều vị trí khác nhau như : ở mặt đất, thân cây, cành cây tại RNM Cần Giờ. Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzym của NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt quanh KL. Mỗi loài NS thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính protease khác nhau.

Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35,50C, pH 7.6). - Bước 1 ( biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao thường khoảng 950C, trong vòng 30 giây đến 1 phút.

Cấy chấm điểm NS nghiên cứu lên bề mặt các MT tương ứng để tủ ấm trong 3 ngày, đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của chủng nghiên cứu. Thanh trùng MT rồi cấy chấm điểm NS, nuôi đạt đến độ trưởng thành và đo đường kính KL d (mm) theo qui ước để đánh giá mức độ sinh trưởng của chủng ứng với từng pH khác nhau. Nhằm chọn MT thích hợp nuôi NS sinh protease, chúng tôi chọn các MT ký hiệu M1, M2, M3, M4, M5 để khảo sát quá trình nuôi cấy chủng NS.

Chủng NS được nuôi đạt đến độ trưởng thành, tiến hành xác định hoạt độ protease thu được từ dịch nuôi cấy ứng với từng loại MT trên bằng phương pháp Anson. Để xác định thời gian thích hợp cho quá trình tổng hợp protease, tiến hành nuôi chủng NS trên MT đã chọn trong các khoảng thời gian khác nhau: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60giờ, 72 giờ. Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt lực của enzym protease.

Tiến hành tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh. Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường..) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzym). Độ bền enzym được tính bằng số % hoạt độ còn lại trong các dịch đã xử lý nhiệt độ, đối chứng là hoạt độ của dịch enzym không xử lý nhiệt độ và giữ ở nhiệt độ 4oC.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của 6 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease của 6 chủng theo phương pháp Anson. Hoạt độ protease (UI/ml). Phân tích số liệu từ bảng 3.3 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym này của 06 chủng là thống nhất nhau. mol/ml ), có khả năng sinh trưởng tốt nhất và có nguồn gốc từ MT có chất cảm ứng. Nhằm mục đích xác định nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3.

Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy chủng A.oryzae có thể đồng hóa được các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau, trong đó NS ở mẫu có bột đậu nành sinh trưởng mạnh hơn mẫu đối chứng khoảng 17,2%. Kết quả này phù hợp với nghiên cưú của Lê Thị Cẩm Tú ( 2003) là A.oryzae sinh trưởng tốt nhất trên nguồn nitơ là bột đậu nành. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) khi khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của A.

Điều này phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trưởng của chủng A.oryzae của các tác giả Nguyễn Lân Dũng ( 2000), Đồn Văn Thược (2005), Lương Đức Phẩm (2006) là chủng A.oryzae sinh trưởng nhanh trong 3 ngày đầu nuôi cấy. Nguyên nhân do bột đậu nành là chất cảm ứng được chúng tôi đưa vào ngay từ lúc lấy mẫu nhằm nhanh chóng chọn được chủng có khả năng sinh protease cao, và A.oryzae là chủng thu được từ MT có chất cảm ứng có hoạt độ protease cao nhất trong số các chủng thu được từ RNM Cần Giờ. Để xác định thời gian thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của chủng A.oryzae, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp 2.2.2.4.

Mặt khác kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng A.oryzae thì ở khoảng nhiệt độ này thích hợp cho chủng A.oryzae sinh trưởng mạnh. Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Tiến hành nuôi cấy chủng A.oryzae ở những điều kiện thích hợp đã khảo sát ở trên và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp protease với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt độ của enzym tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h.

Nhiệt độ của mẫu nuôi cấy cũng tăng theo thời gian, nhiệt độ tăng nhanh khoảng 24 -36 giờ đầu lúc này A.oryze sinh trưởng mạnh và bắt đầu tổng hợp enzym, sau 40 giờ nuôi cấy thì nhiệt độ giảm dần do A.oryze sinh trưởng chậm lại. Như vậy qua đồ thị động thái quá trình sinh tổng hợp proteae của chủng nghiên cứu cho thấy có sự tương quan thuận giữa hoạt độ protease với nhiệt độ và pH của MT. Tiến hành theo phương pháp ở mục 2.2.1.5 để kiểm tra xem A.oryzae ngoài sinh protease ra còn có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào khác nữa hay không.

Sau khi nuôi chuûng A.oryzae trên MT ở các điều kiện thích hợp để sinh protease cao nhất , tiến hành thu enzym theo phương pháp ở mục 2.2.3 với các tác nhân tủa khác nhau. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson.