Luận văn đánh giá khả năng tái sinh in vitro của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qua agrobacterium tumefaciens

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------      ---------- NGUYỄN VĂN CỬU ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA CÁC GIỐNG LÚA INDICA VÀ BIẾN NẠP GEN cryIAc VÀO LÚA THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số : 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. ðỖ NĂNG VỊNH HÀ NỘI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Văn Cửu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. ðỗ Năng Vịnh, Giám ñốc Phòng Thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp ñã tận tình chỉ dẫn và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn này, ñồng thời cũng là người nhiệt tình cổ vũ, giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và công tác tại Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền giống ñã tận tình dạy dỗ và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện ðào tạo sau ñại học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, ñồng nghiệp trong Phòng Thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong thời gian thực hiện ñề tài. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, bạn bè ñã nhiệt tình ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Sự tin tưởng và khích lệ từ gia ñình ñã giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc. Kết quả ñạt ñược ngày hôm nay, con xin trân trọng kính tặng bố mẹ. Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn ñến tất cả mọi người ! Hà Nội, ngày 9 tháng 9 năm 2010 Tác giả Nguyễn Văn Cửu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt và thuật ngữ vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3 1.3 Nội dung nghiên cứu 3 1.4 ðịa ñiểm nghiên cứu 3 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Cơ sở khoa học của xây dựng, ñánh giá khả năng tái sinh 4 2.1.1 Cơ sở khoa học của xây dựng và ñánh giá khả năng tái sinh 4 2.1.2 Cơ sở di truyền của công nghệ sinh học bảo vệ thực vật 4 2.1.3 Một số hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen 5 2.1.4 Những thay ñổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro 6 2.2 Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 8 2.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 8 2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9 2.2.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA 10 2.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 10 2.2.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 12 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iv 2.2.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 2.3 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15 2.3.1 Hệ vector hai nguồn 15 2.3.2 Hệ vector liên hợp 16 2.3.3 Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vector biến nạp 18 2.4 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 20 2.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 20 2.4.2 Những nghiên cứu về gen cry 23 2.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể ñộc 23 2.4.4 Một số nghiên cứu về gen cry1Ac 25 2.5 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 27 2.6 Tình hình nuôi cấy mô lúa và chuyển gen vào lúa thông qua Agrobacterium tumefaciens 29 2.6.1 Trên thế giới 29 2.6.2 Ở Việt Nam 30 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Vật liệu 33 3.1.1 Vật liệu thực vật 33 3.1.2 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và vector biến nạp 34 3.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 35 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 36 3.2 Phương pháp nghiên cứu 39 3.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 39 3.2.2 Phương pháp ñánh giá khả năng tái sinh in vitro 39 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp v 3.2.3 Biến nạp gen cry1Ac thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 40 3.2.4 Phương pháp thu thập và phân tích số liệu thống kê thu ñược 42 3.2.5 Phân tích cây ñược biến nạp gen 42 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các phytohocmon (2,4D, BAP, NAA) ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64 46 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và hỗn hợp axít amin ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa IR64 46 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BAP và NAA) ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64 49 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR 64 51 4.2 ðánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn chỉnh của các giống lúa indica trên môi trường và ñiều kiện tối ưu cho giống lúa IR64 52 4.4 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen (mang gen cry1Ac) thông qua vi khuẩn Agrobecterium tumefaciens 57 4.5 Xác ñịnh sự tồn tại của gen chuyển trong hệ gen lúa sử dụng PCR 59 4.6 ðánh giá kiểu hình cây chuyển gen 60 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 61 5.1 Kết luận 61 5.2 ðề nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 72 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ B5 Môi trường Gamborg (1963) BAP 6-Benzyl Amino Purine Bp (base pair) Cặp bazơ nitơ Bt Bacillus thuringiensis Cs Cộng sự Kb Kilo base LB- Left Border Biên bên trái RB- Right Border Biên bên phải MS Môi trường Murashige - Skoog (1962) N6 Môi trường Chu et al (1975) NAA α- Napthalene axetic axit NST Nhiễm sắc thể PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp T-DNA (Transfer DNA) ðoạn DNA chuyển Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid) Plasmid gây khối u Vir (Virulence Region) Vùng gây ñộc 2,4 D 2,4-D-Dichlorophenoxi axetic axit Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các gen chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 18 2.2 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa 20 2.3 Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica 28 3.1 Danh sách và kí hiệu giống lúa sử dụng trong nghiên cứu 33 3.2 Thông tin liên quan ñến hệ thống biến nạp 34 3.3 Bảng tổng hợp các môi trường sử dụng trong ñánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây 37 3.4 Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen lúa 38 3.5 Bố trí thí nghiệm ñánh giá khả năng tái sinh in vitro 39 3.6 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 44 4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4 D và hỗn hợp axit amin ñến khả năng tạo mô sẹo của giống lúa IR64 46 4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp (BAP và NAA) ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua mô sẹo của giống lúa IR64 49 43 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR 64 51 4.4 Khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống lúa 53 4.5 Khả năng tái sinh cây của các giống lúa 54 4.8 Kết quả biến nạp gen thế hệ T 0 giống IR64 59 4.9 Một số ñặc ñiểm nông sinh học cây lúa chuyển gen và cây ñối chứng không chuyển gen 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Bản ñồ Ti- plasmid dạng octopin 10 2.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật 12 2.3 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 17 3.1 Cấu trúc vector pCAMBIA 1300enh 35Smang gen cryIAc 35 4.1 Một số hình ảnh về tạo mô sẹo và tái sinh cây IR64 55 4.2 Một số hình ảnh tái sinh cây in vitro của một số giống lúa 56 4.3 Một số hình ảnh liên quan biến nạp gen cryIAc vào giống lúa IR64 58 4.4 Khẳng ñịnh các dòng lúa mang các gen chuyển thế hệ T 0 bằng kỹ thuật PCR sử dụng mồi ñặc hiệu khuếch ñại ñoạn gen cryIAc tạo ra băng ñặc hiệu 750 bp. 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới với hơn 3 tỷ người sử dụng hàng ngày. Cây lúa ñược trồng chủ yếu ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của các châu lục. Trong ñó, khoảng 90 % diện tích lúa trồng trên thế giới thuộc về châu Á. Khoảng 80 % sản lượng lúa thế giới là của các giống indica. Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực quan trọng nhất, chiếm hơn 60 % tổng sản lượng lương thực và ñược gieo trồng 3,96 triệu hecta - là cây có diện tích lớn nhất ở Việt Nam. Do ñó, nghiên cứu về cây lúa ñã và ñang ñược quan tâm sâu sắc của nhiều nhà nghiên cứu. ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng nhanh hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo. Trong ñiều kiện diện tích ñất, nguồn nước sử dụng cho nông nghiệp bị giảm ñi nhanh và yêu cầu giảm thiểu sử dụng hoá chất nông nghiệp, việc chọn tạo các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng với sâu, bệnh, các tác nhân vô sinh ñang ñòi hỏi cấp thiết. Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ñã thu ñược nhiều giống có năng suất cao, sử dụng trong cuộc cách mạng xanh. Tuy nhiên, ñể tạo ra các giống mới bằng các phương pháp truyền thống thường mất 3- 4 năm. Do ñó, ñể tạo ra các giống lúa mới mang tính trạng mong muốn trong thời gian ngắn hơn, các phương pháp truyền thống cần kết hợp với những kết quả thu ñược do phương pháp Công nghệ sinh học tạo ra. Việc tạo ra các giống cây trồng biến ñổi di truyền có khả năng kháng sâu, bệnh và côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật ñang ñược quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và tính chống . dựng, ñánh giá khả năng tái sinh 2.1.1 Cơ sở khoa học của xây dựng và ñánh giá khả năng tái sinh Việc xây dựng và ñánh giá khả năng tái sinh của cây trồng. hợp và tối ưu các ñiều kiện nuôi cấy ñể tạo mô sẹo và tái sinh cây giống lúa IR64. • ðánh giá ñược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa indica