Nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của các chủng C. neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm não - màng não đối với amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) và flucytosine (5-FU) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG IN VITRO CỦA CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM Nhữ Thị Hoa, Phạm Quốc Trung* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá khả đáp ứng in vitro chủng C neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm não-màng não amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) flucytosine (5-FU) phương pháp khuếch tán thạch Phương pháp: thử nghiệm in vitro tiến hành 107 loài C neoformans phân lập từ bệnh nhân lưu trữ môn Ký Sinh-Vi Nấm Học, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Phục hồi loài C neoformans môi trường SDA chuột bạch gây suy giảm miễn dịch định danh kiểm tra mơi trường Staib-Ajello Xác định bước sóng ngưỡng OD tương đương 106 CFU/ml để định lượng dịch treo nấm quang phổ kế Mơi trường Muller Hinton có bổ sung glucose methylen blue sử dụng đánh giá đáp ứng thuốc Đường kính vòng nấm đo sau ngày Phân tích số liệu phần mềm Stata 10.0 Kết quả: bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ nấm C neoformans 640nm; OD tương đương 106 CFU/ml 0,06 Trong 107 mẫu khảo sát, 8,4% thuộc var gattii, 91,6% thuộc var neoformans Tỉ lệ C neoformans nhạy với amphotericin B, fluconazol, flucytosine 76,6% , 71% , 0,9%; nhạy 23,4%, 16,8% 0% Không ghi nhận trường hợp kháng amphotericin B, đó, 12,2% C neoformans kháng fluconazol 99% C neoformans kháng flucytosine Các chủng kháng tập trung nhóm var neoformans Chưa phát mối liên quan khả đáp ứng thuốc in vitro với chủng (variety) việc sử dụng fluconazol dự phòng Kết luận đề xuất: bước sóng 640nm (máy spectro SC) bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ dịch treo nấm C neoformans Mức độ nhạy C neoformans amphotericin B fluconazol có khuynh hướng giảm Cần tiến hành khảo sát MIC hoạt chất kháng nấm chủng phân lập từ môi trường bệnh nhân nhằm đưa kết luận xác cụ thể Từ khóa: C neoformans, bước sóng 640nm, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, tỉ lệ kháng, tỉ lệ nhạy ABSTRACT IN VITRO SUSCEPTIBILITY OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TO ANTIFUNGALS Nhu Thi Hoa, Pham Quoc Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No - 2012: 70 - 75 Objectives: to assess in vitro susceptibility of C neoformans isolated from meningo-encephalitic patients to amphotericin B, fluconazol, flucytosine by disk diffusion method Method: in vitro susceptibility to amphotericin B, fluconazol, flucytosine of 107 C neoformans isolates, preserved in 10% glycerine solution at Pham Ngoc Thach University of Medicine, was assessed by disk diffusion method The strains were recovered by inoculating into SDA (Sabouraud dextrose agar) or intra-peritoneal injection to immunosuppressed mice and identified via Staib-Ajello culture Optimal wavelength and OD Bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Hoc, trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: Ths Nhữ Thị Hoa ĐT: 0903379566 Email: drnhuhoa@yahoo.com 70 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học equivalent to 106 CFU/ml were determined for quantification of yeast cells suspension by spectrophotometry Muller-Hinton media supplemented with glucose and methylen blue was used for assessing susceptibility of the yeast to antifungi Diameter of antifungal zone was recorded after 48 hours Data were analyzed with Stata10.0 Results: the optimal wavelength to defining the density of cryptococcal suspension is 640 nm, and OD being equivalent to 106 CFU/ml is 0.06 Among 107 isolates evaluated, there were 8.4% var gattii, and 91.6% var neoformans In vitro susceptibility of C neoformans to amphotericin B, fluconazol, and flucytosine are respectively: susceptible: 76.6%, 71% and 0.9%; intermediate: 23.4%, 16.8% and 0% No resistant strains to amphotericin B were observed, but 99.07% and 12.15% of isolates were readily resistant to flucytosine and fluconazol respectively Most of strains resisting to fluconazol and flucytosine belong to var neoformans No correlation between in vitro susceptibility and fungal variety, together with the prophylactic use of fluconazol were found Conclusions and recommendations: wavelength of 640nm (Spectro SC apparatus) is optimal for determining density of cryptococcal suspension In vitro susceptibility to fluconazol, amphotericine B tends to decline It is really necessary to conduct research on amphotericin B, fluconazol and flucytosine MICs of isolates from environment and patients Key words: C neoformans, spectrophotometry, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, resistance, susceptibilty số C neoformans gây bệnh ĐẶT VẤN ĐỀ người(6) C neoformans tác nhân Tại Việt Nam, khảo sát viêm nãogây nhiễm trùng hội, đặc biệt địa màng não C neoformans năm 2004, N.Q HIV/AIDS, đó, kháng nấm dự phòng Trung ghi nhận 12/15 trường hợp nhập viện lần khuyến cáo áp dụng đối tượng điều trị trì với fluconazol(12) nguy cao Ngoài điều trị, sau đợt N.L.H Anh L.G Hiếu trình bày cơng, phác đồ kéo dài đòi hỏi để trường hợp tương tự vào năm 2009(11) Tuy ngăn ngừa tái phát(2) Các phương pháp xử trí nhiên, việc sử dụng thuốc kháng retrovirus dẫn đến nguy thay đổi ngưỡng Việt Nam chưa bao phủ khắp đối đáp ứng C neoformans thuốc kháng tượng HIV/AIDS Như vậy, tượng giảm nấm(13, 15) đáp ứng C neoformans hoạt chất Thật vậy, trước thập niên 90, ngưỡng MIC kháng nấm thật hậu tình fluconazol ln ổn định(3) Sau đại dịch trạng suy giảm miễn dịch không cải thiện HIV/AIDS, nhiều tác giả ghi nhận tình trạng bệnh nhân? Trên sở đó, khảo sát tác dụng giảm tác dụng fluconazol C in vitro thuốc kháng nấm C neoformans neoformans(7, 8, 13) Borann phát ngưỡng MIC tiến hành fluconazol tăng dần từ năm 2000 đến năm ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2002, số trường hợp kháng fluconazol tăng 5,6 lần: 2,5% năm đầu so với 14% vào Phương pháp khuếch tán thạch sử 13) ( năm thứ (p0,05 Khơng: nhạy kháng; Có: nhạy * Sự đáp ứng in vitro với thuốc kháng nấm tương tự chủng Bảng 5: khả đáp ứng với AMB phân bố theo thời gian việc dùng FLU dự phòng Thời gian (năm 2000) Dùng FLU dự phòng * Trước Sau Khơng Có Đáp ứng* (n, %) Khơng Có (31,3) 11 (68,8) 20 (22,0) 71 (78,0) 23 (22,6) 79 (77,5) (40,0) 2 (Fisher) p > 0,5 p > 0,3 (60,0) Khơng: nhạy kháng; Có: nhạy Chưa ghi nhận khác biệt việc dùng FLU dự phòng chủng trước sau 2008 đáp ứng in vitro AMB C neoformans Bảng 6: khả đáp ứng với FLU phân bố theo thời điểm thu thập chủng việc dùng FLU dự phòng: * Thời gian (năm Trước 2008) Sau Dùng FLU dự Không phòng Có Đáp ứng ( n, %) χ (Fisher) Khơng Có (12,5) 14 (87,5) p > 0,1 29 (31,9) 28 (27,5) 62 (68,1) 74 (72,6) (60,0) (40,0) p >0,1 *Khơng: nhạy kháng; Có: nhạy Việc đáp ứng in vitro fluconazol không phụ thuộc thời điểm phân lập chủng nấm việc dùng fluconazol dự phòng BÀN LUẬN Đặc điểm mẫu nghiên cứu Tổng mẫu nghiên cứu bao gồm 107 lồi Cryptococcus neoformans phân lập từ bệnh nhân, 96,1% từ địa nhiễm HIV/AIDS, chủ yếu sau năm 2008, 5,1% trường hợp Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Nghiên cứu Y học điều trị dự phòng với fluconazol (Bảng 1), chứng tỏ việc dự phòng nhiễm nấm hội bệnh nhân HIV/AIDS chưa quan tâm mức Tình trạng bị tác động lý : 1) khó khăn kinh tế không cho phép bệnh nhân tuân thủ điều trị fluconazol dự phòng; 2) tương tác fluconazol với thuốc điều trị khác, rifampicin; 3) nhiều đối tượng nguy cao phát nhiễm HIV vào thời điểm chẩn đoán viêm nãomàng não vi nấm; 4) việc dự phòng fluconazol dẫn đến kháng thuốc(9) Về phân bố chủng (variety), 91,6% C neoformans thuộc var neoformans (Bảng 1), phù hợp với đặc điểm sinh học Cryptococcus neoformans: var neoformans công chủ yếu người suy giảm miễn dịch(9) Swinne so sánh trước sau 1986, cho thấy tỉ lệ nhiễm C neoformans var neoformans gia tăng với đại dịch HIV(13) Ngoài ra, phân bố C neoformans phân lập từ bệnh nhân nước Đông Nam Á nói chung nghiêng var neoformans(10, 13), vậy, Việt Nam, nước khu vực, nhiều mang dáng dấp mơ hình Hầu hết chủng phân tích lưu trữ từ năm 2008 (Bảng 1), chủng trước 2008 1/6, chất thay đổi mức đáp ứng với thuốc kháng nấm theo thời gian, tồn tại, chưa bộc lộ rõ khảo sát Xác định bước sóng OD thích hợp việc định lượng nồng độ nấm thông qua phương pháp quang phổ kế Mật độ nấm yếu tố ảnh hưởng đến khả đáp ứng in vitro vi nấm thuốc kháng nấm, cần đảm bảo xác số lượng tế bào nấm dịch treo thử nghiệm Hiện có nhiều phương pháp xác định nồng độ dịch treo, định lượng quang phổ kế bước sóng thích hợp phổ biến Tuy nhiên, bước sóng tối ưu C neoformans chưa đề cập danh mục chuẩn nên việc xác định 73 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 bước sóng tiến hành dựa mức độ hấp thu sóng nồng độ định C neoformans nhiều bước sóng khác Biểu đồ cho thấy bước sóng 640nm cho giá trị OD cao chủng quốc tế: var neoformans ATCC 28957 var gattii ATCC 76108 Đây chủng có bao nang dày rõ rệt Ngược lại, bao nang C neoformans từ bệnh nhân phân lập canh cấy SDA thường trở nên mỏng hơn, chí khơng thể nhìn thấy Vì thế, C neoformans phân lập từ bệnh nhân có bao nang mỏng dùng để kiểm chứng cho kết bước sóng tương tự Qua chứng tỏ khả hấp thụ sóng loại tế bào hạt men Cryptococcus neoformans không bị ảnh hưởng bao nang Do vậy, bước sóng 640nm sử dụng để định lượng nồng độ dịch treo tế bào C neoformans nghiên cứu này, khác với bước sóng 625nm dùng cho vi nấm nói chung ghi nhận y văn(15) Sự khác biệt tất yếu khác biệt tùy loại máy quang phổ, loại Cuvet, loại vi nấm sử dụng … Sử dụng bước sóng 640nm để xác định OD nồng độ 106 CFU/ml dịch treo tế bào nấm, bảng cho thấy: OD = [0,058 – 0,065] tương ứng với mật độ nấm dao động khoảng (0,9 – 1,3) x 106 CFU/ml Bên cạnh đó, chênh lệch OD trung bình var khơng tồn tại, 0,062 0,060 Vì để thuận tiện cho việc tính tốn, đo đạc, OD = 0,06 chọn làm OD chuẩn, tương đương với nồng độ 106 CFU/ml dịch treo nấm cho var neoformans var gattii Đánh giá khả đáp ứng In vitro C neoformans thuốc kháng nấm Theo bảng 3, 76,6% C neoformans nhạy với Amphotericin B, thấp nghiên cứu Espinel(4) (96,4%); tỉ lệ cao kết Gomez(5) (23,4% so với 5,8%) Sự khác biệt quy cho môi trường cấy khác lượng nấm tiêm vào điều kiện quy định ngưỡng đánh giá tương ứng Những sai sót đo đạc vòng kháng nấm xảy xuất đường kính 74 vòng ức chế mập mờ ranh giới phân lớp: nhạy– nhạy nhạy – kháng Vì vậy, bảng gợi ý thay đổi khả đáp ứng C neoformans Amphotericin B Những thử nghiệm MIC cần thực chủng phân lập trước, tái phát sau điều trị để khẳng định tượng Trong thử nghiệm Fluconazol, tỉ lệ nhạy, nhạy kháng 71%, 20,5% 14%, tương đồng với nghiên cứu Borann(13) Tuy nhiên tỉ lệ nhạy lại thấp nhiều so với nghiên cứu Aller, 55% (1) Koletar, 20%(8) Nhiều khảo sát MIC ghi nhận khuynh hướng tăng dần Fluconazol so với trước đại dịch AIDS Tuy nhiên mức độ đáp ứng thay đổi tùy thuộc vào thời gian sử dụng Fluconazol nên kết thay đổi theo báo cáo Xét tính đáp ứng chủng hoạt chất kháng nấm, bảng chưa thể khác biệt, tương tự báo cáo George(15) Tuy nhiên Gomez(5), T.T.H.Chau(17) phát var gattii đáp ứng với amphotericin B tốt var neoformans, không khác biệt fluconazole Theo Luciana, amphotericin B tác dụng var var gattii nhạy với fluconazol hơn(18) Lý bắt nguồn từ cỡ mẫu chủng: tập trung chủ yếu vào var neoformans số liệu George, Gomez, T.T.H Châu khảo sát tại; lệch phía var gattii đánh giá Luciana Do đó, để khẳng định, cần có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn cân đối hai chủng Xét thời điểm thu thập mẫu, khơng tìm thấy thay đổi khả đáp ứng In vitro C neoformans theo thời gian (bảng 5, bảng 6) Nguyên nhân mầm bệnh không phát tán vào môi trường không lan truyền cách tự nhiên từ người sang người qua đường khơng khí qua chất tiết, chất thải, đột biến gây kháng thuốc tế bào nấm, hội “di truyền” Vì thế, tượng kháng thuốc nhạy Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 chủng C neoformans nhiều khả hình thành thời gian tồn thể bệnh nhân bị nhiễm Về việc sử dụng fluconazol dự phòng, tượng kháng chéo thường xảy hoạt chất nhóm, từ năm 1995, Joseph-Horne phát khả kháng chéo amphotericin B fluconazole số chủng C neoformans gây bệnh người(6) Tuy nhiên, bảng chưa ghi nhận mối liên hệ việc dùng fluconazol dự phòng mức độ đáp ứng in vitro C neoformans amphotericin B, chí fluconazol Có lẽ cỡ mẫu che dấu chất vấn đề: 5/107 trường hợp ghi nhận phòng ngừa nhiễm nấm hội fluconazol Do vậy, để nhận định xác vấn đề cần nghiên cứu khác với cỡ mẫu phù hợp 10 11 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Bước sóng 640 nm thích hợp cho việc định lượng nồng độ dịch treo nấm C neoformans dòng máy spectro SC C neoformans kháng mạnh với flucytosine có khuynh hướng giảm đáp ứng với fluconazol amphotericin B Chưa tìm thấy khác biệt đáp ứng in vitro var neoformans var gattii thuốc kháng nấm Khảo sát MIC chủng C neoformans phân lập từ bệnh nhân môi trường thiên nhiên nên tiến hành với cỡ mẫu phù hợp để đánh giá xác thay đổi khả đáp ứng, có, C neoformans hoạt chất kháng nấm 12 13 14 15 16 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aller AI, Lozano F (2000) Correlation of fluconazole MICs with clinical outcome in cryptococcal Infection Antimicrob agents Chemother, 44(6):1544 - CDC (2009) Guidelines for prevention and treatment of opportunistic infections in HIV-infected adults and adolescents March 24, Vol.58: 48-50 Davey KG, Johnson EM , Holmes AD (1998) In vitro susceptibility of C neoformans isolates to fluconazole and itraconazole Antimicrob Chemother, 42:217 - 20 Espinel-Ingroff A, Gibbs D, and Wang A (2007) Correlation of Neo-Sensitabs tablet diffusion assay results on three different Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 18 Nghiên cứu Y học agar media with CLSI broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp and C neoformans to amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole, and voriconazole Journal of clinical microbiology, 45(3):858 - 64 Gomez-Lopez A, Dos M , Martins A, Melhem MC, RodriguezTudela JL, and Cuenca-Estrella M (2008) In vitro susceptibility of Cryptococcus gattii clinical isolates J Clin Microbiol Infect, 14:727 - 30 Josep-Horne T, Hollomon D (1995) Cross-resistance to polyene and azole drugs in Cryotococcus neoformans Antimicrob Agents Chemother, 39:1526-9 Kimberly E, Hanson BDA, and Perfect J (2009) Drug resistance in C neoformans In: Mayers DL Antimicrobial Drug Resistance p 967 - 81 Koletar SL, Buesching WJ and Fass R.J (1995) Emerging resistance to fluconazole among blood and CSF C neoformans isolates Antimicrob agents Chemother, p 98 Kovacs JA Masur H (2000) Prophylaxis against opportunistic infections in patients with human immunodeficiency virus infection N Engl J Med., 342(19): 1416-29 Kwon – Chung KJ, and Bennett JE (1984) Epidemiologic differences between the two varieties of Crytococcus neoformans Am J Epidemiol., 120:123 - 30 Nguyễn LH Anh, La G Hiếu (2009) Đặc điểm dịch tễ & bệnh học C neoformans bệnh nhân viêm não-màng não điều trị BV Bệnh Nhiệt Đới từ 11/08 - 06/09 2009 Luận văn Tốt nghiệp bác sĩ khóa XV (2003 – 2009) Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch TP HCM Nguyễn Quang Trung (2005) VMN nấm Cryptococcus neoformans bệnh nhân AIDS bệnh viện Nhiệt Đới 20042005 Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú Đại học Y Dược TP HCM Sar B, Monchy D, Vann M, Keo C, Sarthou JL, and Buisson Y (2004) Increasing in vitro resistance to fluconazole in C neoformans Cambodian isolates: April 2000 to March 2002 J of Antimicro Chemother, 54:563 - Swinne D, Nkurikiyinfura JB, and Muyembe TL (1986) Clinical isolates of Crytococcus neoformans from Zaire Eur J Clin Microbial, 5:50 -1 Thompson GR, Wiederhold NP, Fothergill AW, Vallor AC, Wickes BL, and Patterson TF (2009) Antifungal susceptibilities among different serotypes of C gattii and C neoformans Antimicrob agents Chemother, 53(1):309 –11 Thornsberry C (1991) Antimicrobial susceptibility testing In: Balows A et al Manual of clinical Microbiology, 5th ed, pp 10591201 American Society for Microbiology, Washington DC Tran T H Chau, Ho D Nghia, Ly V Chuong, Dinh X Sinh, Van A Duong, Pham T Diep, Campbell JI, Baker S (2010) A prospective descriptive study of cryptococcal meningitis in HIV uninfected patients in Vietnam - high prevalence of C neoformans var grubii in the absence of underlying disease BMC Infectious Diseases, 10:199 Trilles L, Torres BF, Lazéra MS, Wanke B, and Guarro J (2004) In vitro antifungal susceptibility of C gattii Journal of clinical microbiology, 42(10): 4815 - 75 ... tương đương với nồng độ 106 CFU/ml dịch treo nấm cho var neoformans var gattii Đánh giá khả đáp ứng In vitro C neoformans thuốc kháng nấm Theo bảng 3, 76,6% C neoformans nhạy với Amphotericin B, thấp... Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 kháng với fluconazol Bảng 4: phân bố khả đáp ứng với thuốc kháng nấm theo chủng: Chủng * AMB FLU* gattii neoformans gattii neoformans Đáp. .. flucytosine có khuynh hướng giảm đáp ứng với fluconazol amphotericin B Chưa tìm thấy khác biệt đáp ứng in vitro var neoformans var gattii thuốc kháng nấm Khảo sát MIC chủng C neoformans phân lập từ bệnh