Nghiên cứu chuyển gen Chitinase - glucanase kháng nấm vào cây cà chua thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens pdf

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 1 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Bùi Th Lan Hương 1 , Nguyn Th Trưng 4 , Vũ Duy Thanh 2 , Nguyn Th Kim Lý 2 , Nguyn c Doanh 2 , Phan T Phưng 2 , Nguyn Hng Minh 3 , Lê Th Ánh Hng 2 SUMMARY Study of antifungal genetransformation on tomato Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century. It is grown in almost every country of the world. Development of protocols for in vitro selection can provide new advances for the production of stress tolerant cultivars. Research objective is to develop transgenic plants from selected Vietnamese tomato cultivars carrying and expressing a chitinase gene under a constitutive promoter. The hypothesis is that the transgenic tomato plants expressing this gene will have enhanced resistance to economically important fungal diseases, which are a problem for warm and humid climatic conditions. Research results presented concerning study on the regeneration capacity of tomato varieties P375 after Agrobacterium mediated transformation. The experimental data show low generation capacity after transformation in P375 variety in both cotyledon (4,32) and hypocotyls (2,63). In this result we obtained two tomato lines confirmed the presence of Chitin’s gene with 788 bp. The primers were used in this investigation are: CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’; CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’ Further testing including tests of the field growth. Plant is necessary to identify individual transformed lines with resistance. Keywords: Callus, Cotyledon, Hypocotyls, genotype, ELISA, , Cytokine, Auxin. I. T VN  Chuyn gen là phương pháp gây bin d di truyn có nh hưng  cây trng (Rosen và cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun Park và cs., 2003) ã và ang ưc áp dng rng rãi trong nhng năm gn ây. Trong nghiên cu to ra cây chuyn gen kháng bnh, các nhà khoa hc ã phát hin ưc gen Chitinase trong cây trng có kh năng hn ch s phát trin các loi nm gây bnh cây như Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, hn ch s phát trin ca nm Verticillium dahliae chng 1 và 2 (Z.K. Punja, 2001; Schlumbaum, A. và cs., 1986) và mt s bnh nm khác. S kt hp gia các gen Chitinase và Glucanase còn to ra cây chuyn gen có kh năng kháng bnh cao hơn vi ph rng hơn so vi nhng cây trng ưc chuyn tng gen ơn l (Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994; Lawrence và cs., 2000). Ni dung trình bày dưi ây là mt s kt qu nghiên cu bưc u v chuyn gen vào ging cà chua P375 thông qua chng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có cha plasmid pCAMBIA 1300 mang gen kháng nm Chitinase (ngun tách t u Pysium), ưc tin hành ti Phòng Bnh phân t thc vt; Vin Di truyn N ông nghip. Ghi chú: 1 Viện Môi trường ông nghiệp, Hà ội, 2 Viện Di truyền ông nghiệp, 3 Trường Đại học ông nghiệp Hà ội, 4 Trường Trung cấp ông nghiệp, Hà ội T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 2 II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Các ging cà chua P375 ưc la chn là ging có kh năng cho tái sinh cao, ã ưc kim tra bnh bng k thut ELISA. Các mu ưc s dng trong thí nghim này là các b phn tr lá mm (hypocotyl) và lá mm (cotyledone) ca các cây cà chua ưc nuôi cy trong in vitro. - Vector mang gen kháng nm Chitinase ưc cung cp t IN RA- Pháp. Cu trúc vector: Hình 1. Cu trúc vector mang gen kháng nm Chitinase - Chng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA105 có cha plasmid pCAMBIA 1300 CHI-GLUC, mang 2 gen kháng nm: Chitinase, Glucanase và gen kháng Hygomicine (hpt). Gen hpt có promoter 35S, còn gen Chitinase - Glucanase có promoter A9, c 2 promoter này u hot ng rt mnh  genome thc vt, - Gen kháng nm Chitinase ưc tách t Phaseolus vulgaris cv Saxa (ngun N CBI-Genbank). 2. Phương pháp nghiên cứu - N uôi cy mu phc v cho bin np: Lá mm và tr lá mm ưc ct nh, t vào ĩa petri ã ưc kh trùng có cha môi trưng dinh dưng MS, thành phn gm các nguyên t a lưng và vi lưng ca MS, vitamins MS, 20 g/l ưng sucrose, 0,6% agar, pH: 5,8 có b sung 2 mg/l BA + 0,2 mg/l IAA, t trong phòng ti trong 36, 48 và 60 gi. Sau ó mu ly ra dùng vào bin np gen. - Chuyn gen gián tip qua Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình ca Swapan K. Datta và cs., 1997. - ánh giá hiu xut chuyn gen: Xác nh s mu sng sót, s cây tái sinh thu ưc, s cây tái sinh ưc chuyn gen. - S liu thí nghim x lý bng phương pháp Duncan's. III. KT QU VÀ THO LUN 1. ghiên cứu khả năng tái sinh của giống cà chua Nhng kt qu nghiên cu ca ca các nhà khoa hc (Shahin và cs.,1986; Chyi và Phillips, 1987; Mc. Cormick, 1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho thy, kh năng tái sinh ca cây cà chua liên quan n kiu gen ca ging, b phn s dng  nuôi cy, tui ca cây, các t hp và nng  các cht kích thích sinh trưng, iu kin nuôi cy v.v Trong iu kin nuôi cy in vitro, s “óng, m” và hot hoá gen vi mt cơ ch còn chưa rõ hoc thích hp, hoc không thích hp s dn n s tái sinh cây vi t l cao hoc thp  các ging cà chua khác nhau. Trong thí nghim, chúng tôi s dng ging cà chua (P375) có các c tính nông hc tt  ánh giá kh năng tái sinh ca tr lá mm và lá mm, nhm tìm ưc b phn có kh năng tái sinh cao làm vt liu nuôi cy chuyn np gen kháng nm gây bnh cây (bng 1). T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 3 Bảng 1. Khả năng tái sinh các mẫu trụ lá mầm và lá mầm của giống P375 (L. esculentum Mill) Giống cà chua Khả năng tạo callus (%) Khả năng tái sinh chồi (%) Khả năng tái sinh/mẫu Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm P375 83,3ac 93,3ab 37,7b 78.1 a 4,5c 4,2b Ghi chú: a, b, c ch s khác nhau không áng k. Các giá tr trung bình,  lch chuNn ưc thc hin theo chương trình ca Ducan vi  tin cy p ≤ 0,05. Kt qu cho thy, trong cùng mt môi trưng tái sinh chi, vi mô t bào t lá mm, ging cà chua P375 cho t l tái sinh chi t 78,1%, tr lá mm ch t 37,7%. Nhng kt qu này tương t vi nghiên cu ca các tác gi McComick et al., 1986; Zhang et al., 1999; Peres et al., 2001; Moghaieb et al., 2004; Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005. Theo các tác gi trên thì kh năng này có th còn ph thuc vào phn ng ca genotype i vi s nuôi cy mô - là kt qu ca quá trình óng m và hot hoá gen thông qua tác nhân trung gian là các cht kích thích sinh trưng như BAP, NAA và mt s yu t ngoi cnh khác. 2. ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm Chitinase vào cà chua P375 a. Kết quả biến nạp gen Chitinase Tin hành bin np gen Chitinase có kh năng kháng nm gây bnh cây vào ging cà chua P375 bng phương pháp gián tip thông qua vi khuNn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình ca Swapan K. Datta và cs., 1997). Ct nh các mu cy  to vt thương, nhim vi khuNn vào mu. Quá trình chuyn np gen Chitinase vào t bào cà chua ưc thc hin thông qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens ưc nhim vào các t bào b thương ang phân chia mnh trong môi trưng giàu auxin. Khi vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tip xúc vi t bào b thương chúng tit ra cht transzeatin  giúp quá trình bin np trong t bào thc vt và quá trình bin np gen ưc thc hin. Sau khi bin np, mu ưc chuyn sang môi trưng cng MS1 có b sung ng thi 2 loi kháng sinh Cefotaxim và Hygromicin. Cefotaxim nhm hn ch s phát trin tr li ca vi khuNn, trong ó kháng sinh Hygromicin là kháng sinh ch th  chn lc các t bào và các mô ã ưc bin np. b. ghiên cứu khả năng tái sinh của cây cà chua biến đổi gen Căn c vào tính cht tác ng lên các callus ca 2 loi kháng sinh ã ưc b sung vào môi trưng nuôi cy (250 mg/l Cefotaxime) và (50 mg/l Hygromicin). Tin hành theo dõi kh năng tái sinh cây ca mô t bào trên môi trưng to callus (MS1), sau thi gian nuôi cy 15 - 20 ngày, tính kháng vi kháng sinh Hygromicin ưc bt u biu hin. Trên nhng callus ưc bin np xut hin mu xanh và phát trin trên môi trưng, ngưc li nhng callus không ưc bin np, kh năng phát trin hu như b ình tr, các t bào ti b mt tip xúc vi môi trưng ã có xu hưng i mu, có nhng mu ã i sang mu thm. Hin tưng này biu hin  các mô t bào chưa mang gen ngoi lai hpt, trên môi trưng nuôi cy cha Hygromycin, các mô t bào b kháng sinh này c ch quá trình sinh tng hp protein làm mt kh năng xanh hóa ca mu.  các mu không thc hin ưc s chuyn np gen, mô phát trin kém, mt kh năng duy trì màu xanh ban u, úa dn en li và b cht. T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 4 T kt qu thí nghim cũng có th thy rng, các kháng sinh có nh hưng c ch khá rõ n sinh trưng và phát trin cũng như làm gim kh năng phát sinh cơ quan ca t bào và mô, ngoài ra ôi khi cũng còn gây ra nhng bin d soma làm gim tc  phát trin và sc sng ca mô. c. ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ vi khun và thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp Nhng nghiên cu ca Fillatti và cs., (1997) ã xác nh nng  vi khuNn và thi gian tin nuôi cy có nh hưng ln n hiu qu bin np i vi cây cà chua. Cơ ch ca quá trình này ưc thc hin trên cơ s vi khuNn Agrobacterium tumefaciens khi nhim vào các t bào ang phân chia mnh trên môi trưng nuôi cy, vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tit ra cht transzeatin giúp cho quá trình bin np gen ưc thc hin. Các tác gi như Sung. Park (2003); Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005 cho rng nng  vi khuNn o  bưc sóng 600 nm vi OD = 0,2 - 0,6 và thi gian x lý trong vòng 36 - 60 ting cho hiu qu chuyn gen vào cà chua là cao nht. Thí nghim bin np gen vào ging cà chua P375 ưc chúng tôi tin hành vi nng  vi khuNn  dng huyn phù ưc pha loãng vi 3 t l khác nhau: 1:10; 1:15 và 1:20. Thí nghim vi nng  t bào vi khuNn thp (1:20), hiu qu bin np hu như t ưc không áng k, có th vi nng  này, do lưng t bào vi khuNn thp, lưng transzeatin ưc tit ra quá ít, hn ch n kh năng bin np.  thí nghim s dng lưng t bào vi khuNn cao hơn (nng  1:10), s lưng mu sng sót thu ưc sau x lý cũng b gim áng k, trong trưng hp này, có th lưng transzeatin ưc tit ra li quá ln, gây ra nh hưng không có li i vi s phân chia t bào, cũng dn n làm gim hiu qu bin np. Khi s dng lưng t bào vi khuNn vi nng  1:15 (tương ương nng  vi khuNn o  bưc sóng 600 nm = 0,3) ã cho hiu qu bin np cao hơn 2 nng  trên. V thi gian x lý, vi thi gian x lý trong 48 gi cho hiu qu bin np cao nht (bng 2). Kt qu này ca chúng tôi phù hp vi kt qu ca Sung Park (2003) và Gorinova et al., 2005 “Thi gian x lý ít hoc nhiu hơn 48 gi, hiu qu bin np kém”. c bit, nu kéo dài thi gian x lý lên quá 48 gi s xut hin các vt hoi t trên các mu cy và mu s cht. Bảng 2. Hiệu quả biến nạp gen với các nồng độ vi khun và thời gian đồng nuôi cấy khác nhau ở cà chua P375 Mẫu thí nghiệm và công thức Số lượng mẫu thí nghiệm Số mẫu tái sinh Tổng số mẫu tái sinh Hiệu suất biến nạp (%) Bộ phận lấy mẫu Nồng độ vi khuẩn 36 giờ 48 giờ 60 giờ Cuống lá mầm 1: 10 300 1 1 - 2 chết 1: 15 266 1 5 1 7 2,63 1: 20 333 2 2 - 4 1,20 Lá mầm 1: 10 300 1 2 - 3 1,00 1: 15 301 3 9 1 13 4,32 1: 20 265 2 3 1 6 2,24 Cộng 1 765 35 S liu bng 2 cho thy, kh năng tái sinh sau bin np ca cà chua ph thuc vào nng  vi khuNn, thi gian ng nuôi cy và loi mu cy. Các chi ã phát trin ưc cy chuyn sang môi trưng MS3 MS + 2 mg/l kinetin + 1 mg/l IAA + 25 g/l sucrose + 5 g/l agar + các loi kháng sinh tương ng)  to cây T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5 hoàn chnh. Thí nghim thu ưc 16 cây hoàn chnh, trong quá trình cy chuyn còn li 12 cây hoàn chnh, kho mnh và ưc kim tra s có mt ca gen chuyn. 3. Kiểm tra sự có mặt của gen được chuyển a. Kiểm tra kiểu hình Phương pháp thưng ưc áp dng là cho cây tái sinh to r trong môi trưng dinh dưng có cha 50 mg/l kháng sinh chn lc (Joao và Brơn, 1993; Vidya và cs., 2000; Faino và cs., 2004). Do r cây rt mn cm vi kháng sinh, nu r cây phát trin kho mnh iu ó chng t cây có cha gen ưc chuyn (Draper và cs., 1988). Thí nghim ca chúng tôi cũng áp dng theo phương pháp này  xác nh nhng cây có kh năng ã ưc chuyn gen gm nhng cây có b r phát trin, cây kho mnh. b. Kiểm tra kiểu gen Tin hành phân tích v phân t i vi s biu hin ca gen, PCR (Shen, 1998; Bhat và Srinivasan, 2002), bng các enzyme c trưng HindIII, Pstl  xác nh các vùng có trng lung phân t tương ng vi gen Chitinase. Phn ng PCR ưc hoàn thành trong 50 µl ca mi mt hn hp phn ng chuNn vi enzym Taq ADN polimeraza, các nucleotid và vi cp mi c trưng ca gen Chitinase. CHIF. 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’ CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’ Kt qu in di cho thy trong 12 cây cà chua to ưc trên môi trưng chn lc ch có 2 cây biu hin có mt gen Chitinase, gen chuyn ưc khuych i tương ng 788 bp. (hình 2). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (-) Hình 1. Kt qu kim tra s có mt ca gen Chitinase trong các cây ưc chuyn gen 788 bp T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 IV. KT LUN 1. Kết luận Kt qu bưc u nghiên cu s dng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có cha plasmid PCAMBIA 1300  chuyn gen vào cà chua ã thu ưc 2 cây cà chua P375 mang gen kháng nm gây bnh cây Chitinase. Nghiên cu các yu t nh hưng n hiu sut chuyn gen  cây cà chua rút ra ưc mt s nhn xét tương t mt s kt nghiên cu ã ưc thc hin  nưc ngoài. Hiu sut chuyn gen  cà chua ph thuc vào các yu t: Kiu gen ca tng ging; cơ quan t ưc la chn  nuôi cy tái sinh và chuyn gen; nng  vi khuNn và thi gian ng nuôi cy; s dng loi kháng sinh chn lc 2. Đề nghị Tip tc nghiên cu hoàn thin quy trình chuyn gen kháng nm gây bnh cây vào ging cà chua P375. ánh giá c tính cây cà chua mang gen ưc chuyn trong iu kin cách ly nhm chn to ưc ging cà chua có nhng c tính tt và có kh năng kháng nm gây bnh cây phc v sn xut. TÀI LIU THAM KHO 1 Chyi Y-S, Phillips GC., 1987. High efficiency Agrobacterium - mediated transformation of Lycopersicon based on conditions favorable for regeneration. Plant cell Rep. 2 Lê Thị Ánh Hồng, 2000. Cơ s khoa hc công ngh chuyn gen  thc vt. Nhà xut bn Nông nghip, 2000. 3 guyễn Đức Thành, 2000. Nuôi cy mô t bào thc vt - nghiên cu và ng dng. NXB. Nông nghip. 4 Hu W, Philips GC., 2001. A combination of overgrowth- control and antibiotics improves Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformation efficiency for cultivated tomato (L. esculentum). In vitro cell Bio-Plant. 5 Park et al., 2003. Efficinet genotype-independent Agrobacterium - mediated tomato transformation. J.Plant Physiol. 160: 1253-1257. 6 Frary A, Earle ED., 1996. An examination of factor affecting the efficiency of Agrobacterium - mediated transformation of tomato. Plant Cell Rep. gười phản biện: guyễn Văn Vấn . nghÖ n«ng nghiÖp Vi t Nam 1 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Bùi. ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm Chitinase vào cà chua P375 a. Kết quả biến nạp gen Chitinase Tin hành bin np gen Chitinase có kh năng kháng