NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN pptx

Trong nghiên cứu tạo ra cây chuyển gen kháng bệnh, các nhà khoa học đã phát hiện được gen Chitinase trong cây trồng có khả năng hạn chế sự phát triển các loại nấm gây bệnh cây như Fusar

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Chitinase - glucanase

KHÁNG NẤM VÀO CÂY CÀ CHUA THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Bùi Thị Lan Hương1, Nguyễn Thị Trường4, Vũ Duy Thanh2, Nguyễn Thị Kim Lý2, Nguyễn Đức Doanh2, Phan Tố Phượng2, Nguyễn Hồng Minh3, Lê Thị Ánh Hồng2

SUMMARY

Study of antifungal genetransformation on tomato

Tomato is a major vegetable crop that has tremendous popularity over the last century It is grown

in almost every country of the world Development of protocols for in vitro selection can provide new advances for the production of stress tolerant cultivars

Research objective is to develop transgenic plants from selected Vietnamese tomato cultivars carrying and expressing a chitinase gene under a constitutive promoter

The hypothesis is that the transgenic tomato plants expressing this gene will have enhanced resistance to economically important fungal diseases, which are a problem for warm and humid climatic conditions

Research results presented concerning study on the regeneration capacity of tomato varieties

P375 after Agrobacterium mediated transformation The experimental data show low generation

capacity after transformation in P375 variety in both cotyledon (4,32) and hypocotyls (2,63)

In this result we obtained two tomato lines confirmed the presence of Chitin’s gene with 788 bp

The primers were used in this investigation are:

CHIF 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’;

CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’

Further testing including tests of the field growth Plant is necessary to identify individual transformed lines with resistance

Keywords: Callus, Cotyledon, Hypocotyls, genotype, ELISA, , Cytokine, Auxin

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Chuyển gen là phương pháp gây biến dị di

truyền có định hướng ở cây trồng (Rosen và

cs., 2003; Veluthambi và cs., 2003; Sung Hun

Park và cs., 2003) đã và đang được áp dụng

rộng rãi trong những năm gần đây Trong

nghiên cứu tạo ra cây chuyển gen kháng bệnh,

các nhà khoa học đã phát hiện được gen

Chitinase trong cây trồng có khả năng hạn chế

sự phát triển các loại nấm gây bệnh cây như

Fusarium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia, hạn

chế sự phát triển của nấm Verticillium dahliae

chủng 1 và 2 (Z.K Punja, 2001; Schlumbaum,

A và cs., 1986) và một số bệnh nấm khác Sự

kết hợp giữa các gen Chitinase và Glucanase

còn tạo ra cây chuyển gen có khả năng kháng bệnh cao hơn với phổ rộng hơn so với những cây trồng được chuyển từng gen đơn lẻ (Jongedyk e và cs., 1995; Zu và cs., 1994; Lawrence và cs., 2000)

Nội dung trình bày dưới đây là một số kết quả nghiên cứu bước đầu về chuyển gen vào giống cà chua P375 thông qua chủng vi

khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA 105

có chứa plasmid pCAMBIA 1300 mang gen

kháng nấm Chitinase (nguồn tách từ đậu Pysium), được tiến hành tại Phòng Bệnh phân

tử thực vật; Viện Di truyền N ông nghiệp Ghi chú: 1 Viện Môi trường %ông nghiệp, Hà %ội, 2 Viện Di truyền %ông nghiệp,

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP

N GHIÊN CỨU

1 Vật liệu nghiên cứu

- Các giống cà chua P375 được lựa

chọn là giống có khả năng cho tái sinh cao,

đã được kiểm tra bệnh bằng kỹ thuật

ELISA Các mẫu được sử dụng trong thí nghiệm này là các bộ phận trụ lá mầm (hypocotyl) và lá mầm (cotyledone) của các

cây cà chua được nuôi cấy trong in vitro

- Vector mang gen kháng nấm

Chitinase được cung cấp từ IN RA- Pháp

Cấu trúc vector:

Hình 1 Cấu trúc vector mang gen kháng nấm Chitinase

- Chủng vi khuNn Agrobacterium

tumefaciens EHA105 có chứa plasmid

pCAMBIA 1300 CHI-GLUC, mang 2 gen

kháng nấm: Chitinase, Glucanase và gen

kháng Hygomicine (hpt) Gen hpt có

promoter 35S, còn gen Chitinase - Glucanase

có promoter A9, cả 2 promoter này đều hoạt

động rất mạnh ở genome thực vật,

- Gen kháng nấm Chitinase được tách

từ Phaseolus vulgaris cv Saxa (nguồn

N CBI-Genbank)

2 Phương pháp nghiên cứu

- N uôi cấy mẫu phục vụ cho biến nạp: Lá

mầm và trụ lá mầm được cắt nhỏ, đặt vào đĩa

petri đã được khử trùng có chứa môi trường

dinh dưỡng MS, thành phần gồm các nguyên

tố đa lượng và vi lượng của MS, vitamins

MS, 20 g/l đường sucrose, 0,6% agar, pH: 5,8

có bổ sung 2 mg/l BA + 0,2 mg/l IAA, đặt

trong phòng tối trong 36, 48 và 60 giờ Sau

đó mẫu lấy ra dùng vào biến nạp gen

- Chuyển gen gián tiếp qua

Agrobacterium tumefaciens: Theo quy trình

của Swapan K Datta và cs., 1997

- Đánh giá hiệu xuất chuyển gen: Xác

định số mẫu sống sót, số cây tái sinh thu

được, số cây tái sinh được chuyển gen

- Số liệu thí nghiệm xử lý bằng phương

pháp Duncan's

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 !ghiên cứu khả năng tái sinh của giống cà chua

Những kết quả nghiên cứu của của các nhà khoa học (Shahin và cs.,1986; Chyi và Phillips, 1987; Mc Cormick, 1991; Van Roekel và cs., 1993; Shen và cs., 1998; Krasnyanski và cs., 2001) cho thấy, khả năng tái sinh của cây cà chua liên quan đến kiểu gen của giống, bộ phận sử dụng để nuôi cấy, tuổi của cây, các tổ hợp và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng, điều kiện nuôi cấy v.v

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, sự

“đóng, mở” và hoạt hoá gen với một cơ chế còn chưa rõ hoặc thích hợp, hoặc không thích hợp sẽ dẫn đến sự tái sinh cây với tỷ lệ cao hoặc thấp ở các giống

cà chua khác nhau

Trong thí nghiệm, chúng tôi sử dụng giống cà chua (P375) có các đặc tính nông học tốt để đánh giá khả năng tái sinh của trụ lá mầm và lá mầm, nhằm tìm được bộ phận có khả năng tái sinh cao làm vật liệu nuôi cấy chuyển nạp gen kháng nấm gây bệnh cây (bảng 1)

Bảng 1 Khả năng tái sinh các mẫu trụ lá mầm và lá mầm của giống P375

(L esculentum Mill)

Giống cà

chua

Khả năng tạo callus (%) Khả năng tái sinh chồi (%) Khả năng tái sinh/mẫu Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm Trụ lá mầm Lá mầm

Ghi chú: a, b, c chỉ sự khác nhau không đáng kể Các giá trị trung bình, độ lệch chuNn được thực hiện theo chương trình của Ducan với độ tin cậy p ≤ 0,05

Kết quả cho thấy, trong cùng một môi

trường tái sinh chồi, với mô tế bào từ lá

mầm, giống cà chua P375 cho tỷ lệ tái sinh

chồi đạt 78,1%, trụ lá mầm chỉ đạt 37,7%

Những kết quả này tương tự với nghiên cứu

của các tác giả McComick et al., 1986;

Zhang et al., 1999; Peres et al., 2001;

Moghaieb et al., 2004; Pravda et al., 2005;

Gorinova et al., 2005 Theo các tác giả trên

thì khả năng này có thể còn phụ thuộc vào

phản ứng của genotype đối với sự nuôi cấy

mô - là kết quả của quá trình đóng mở và

hoạt hoá gen thông qua tác nhân trung gian

là các chất kích thích sinh trưởng như BAP,

NAA và một số yếu tố ngoại cảnh khác

2 !ghiên cứu chuyển gen kháng bệnh

nấm Chitinase vào cà chua P375

a Kết quả biến nạp gen Chitinase

Tiến hành biến nạp gen Chitinase có

khả năng kháng nấm gây bệnh cây vào

giống cà chua P375 bằng phương pháp gián

tiếp thông qua vi khuNn Agrobacterium

tumefaciens (theo quy trình của Swapan K

Datta và cs., 1997) Cắt nhỏ các mẫu cấy để

tạo vết thương, nhiễm vi khuNn vào mẫu

Quá trình chuyển nạp gen Chitinase vào tế

bào cà chua được thực hiện thông qua vi

khuÈn Agrobacterium tumefaciens được

nhiễm vào các tế bào bị thương đang phân

chia mạnh trong môi trường giàu auxin Khi

vi khuNn Agrobacterium tumefaciens tiếp

xúc với tế bào bị thương chúng tiết ra chất

transzeatin để giúp quá trình biến nạp trong

tế bào thực vật và quá trình biến nạp gen

được thực hiện Sau khi biến nạp, mẫu được chuyển sang môi trường cứng MS1 có bổ

sung đồng thời 2 loại kháng sinh Cefotaxim

và Hygromicin Cefotaxim nhằm hạn chế sự

phát triển trở lại của vi khuNn, trong đó

kháng sinh Hygromicin là kháng sinh chỉ

thị để chọn lọc các tế bào và các mô đã được biến nạp

b %ghiên cứu khả năng tái sinh của cây cà chua biến đổi gen

Căn cứ vào tính chất tác động lên các

callus của 2 loại kháng sinh đã được bổ

sung vào môi trường nuôi cấy (250 mg/l

Cefotaxime) và (50 mg/l Hygromicin)

Tiến hành theo dõi khả năng tái sinh cây

của mô tế bào trên môi trường tạo callus

(MS1), sau thời gian nuôi cấy 15 - 20 ngày,

tính kháng với kháng sinh Hygromicin được bắt đầu biểu hiện Trên những callus

được biến nạp xuất hiện mầu xanh và phát triển trên môi trường, ngược lại những

callus không được biến nạp, khả năng phát

triển hầu như bị đình trệ, các tế bào tại bề mặt tiếp xúc với môi trường đã có xu hướng đổi mầu, có những mẫu đã đổi sang mầu thẫm Hiện tượng này biểu hiện ở các

mô tế bào chưa mang gen ngoại lai hpt,

trên môi trường nuôi cấy chứa

Hygromycin, các mô tế bào bị kháng sinh

này ức chế quá trình sinh tổng hợp protein làm mất khả năng xanh hóa của mẫu Ở các mẫu không thực hiện được sự chuyển nạp gen, mô phát triển kém, mất khả năng duy trì màu xanh ban đầu, úa dần đen lại

và bị chết

Từ kết quả thí nghiệm cũng có thể thấy

rằng, các kháng sinh có ảnh hưởng ức chế

khá rõ đến sinh trưởng và phát triển cũng

như làm giảm khả năng phát sinh cơ quan

của tế bào và mô, ngoài ra đôi khi cũng còn

gây ra những biến dị soma làm giảm tốc độ

phát triển và sức sống của mô

c %ghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ

vi khuOn và thời gian đồng nuôi cấy đến

hiệu quả biến nạp

Những nghiên cứu của Fillatti và cs.,

(1997) đã xác định nồng độ vi khuNn và

thời gian tiền nuôi cấy có ảnh hưởng lớn

đến hiệu quả biến nạp đối với cây cà

chua Cơ chế của quá trình này được thực

hiện trên cơ sở vi khuNn Agrobacterium

tumefaciens khi nhiễm vào các tế bào

đang phân chia mạnh trên môi trường

nuôi cấy, vi khuNn Agrobacterium

tumefaciens tiết ra chất transzeatin giúp

cho quá trình biến nạp gen được thực

hiện Các tác giả như Sung Park (2003);

Pravda et al., 2005; Gorinova et al., 2005

cho rằng nồng độ vi khuNn đo ở bước sóng

600 nm với OD = 0,2 - 0,6 và thời gian xử

lý trong vòng 36 - 60 tiếng cho hiệu quả

chuyển gen vào cà chua là cao nhất

Thí nghiệm biến nạp gen vào giống cà

chua P375 được chúng tôi tiến hành với

nồng độ vi khuNn ở dạng huyền phù được pha loãng với 3 tỷ lệ khác nhau: 1:10; 1:15 và 1:20

Thí nghiệm với nồng độ tế bào vi khuNn thấp (1:20), hiệu quả biến nạp hầu như đạt được không đáng kể, có thể với nồng độ này, do lượng tế bào vi khuNn thấp,

lượng transzeatin được tiết ra quá ít, hạn

chế đến khả năng biến nạp Ở thí nghiệm sử dụng lượng tế bào vi khuNn cao hơn (nồng

độ 1:10), số lượng mẫu sống sót thu được sau xử lý cũng bị giảm đáng kể, trong

trường hợp này, có thể lượng transzeatin được tiết ra lại quá lớn, gây ra ảnh hưởng

không có lợi đối với sự phân chia tế bào, cũng dẫn đến làm giảm hiệu quả biến nạp Khi sử dụng lượng tế bào vi khuNn với nồng độ 1:15 (tương đương nồng độ vi khuNn đo ở bước sóng 600 nm = 0,3) đã cho hiệu quả biến nạp cao hơn 2 nồng độ trên

Về thời gian xử lý, với thời gianxử lý trong

48 giờ cho hiệu quả biến nạp cao nhất (bảng 2) Kết quả này của chúng tôi phù hợp với kết quả của Sung Park (2003) và Gorinova et al., 2005 “Thời gian xử lý ít hoặc nhiều hơn 48 giờ, hiệu quả biến nạp kém” Đặc biệt, nếu kéo dài thời gian xử lý lên quá 48 giờ sẽ xuất hiện các vết hoại tử trên các mẫu cấy và mẫu sẽ chết

Bảng 2 Hiệu quả biến nạp gen với các nồng độ vi khuOn

và thời gian đồng nuôi cấy khác nhau ở cà chua P375

Mẫu thí nghiệm và công thức Số lượng

mẫu thí nghiệm

Số mẫu tái sinh Tổng số

mẫu tái sinh

Hiệu suất biến nạp (%)

Bộ phận lấy

mẫu

Nồng độ vi khuẩn 36 giờ 48 giờ 60 giờ

Cuống lá mầm

Lá mầm

Số liệu bảng 2 cho thấy, khả năng tái

sinh sau biến nạp của cà chua phụ thuộc

vào nồng độ vi khuNn, thời gian đồng nuôi

cấy và loại mẫu cấy

Các chồi đã phát triển được cấy chuyển sang môi trường MS3 MS + 2 mg/l kinetin + 1 mg/l IAA + 25 g/l sucrose + 5 g/l agar + các loại kháng sinh tương ứng) để tạo cây

hoàn chỉnh Thí nghiệm thu được 16 cây

hoàn chỉnh, trong quá trình cấy chuyển còn

lại 12 cây hoàn chỉnh, khoẻ mạnh và được

kiểm tra sự có mặt của gen chuyển

3 Kiểm tra sự có mặt của gen được chuyển

a Kiểm tra kiểu hình

Phương pháp thường được áp dụng là

cho cây tái sinh tạo rễ trong môi trường dinh

dưỡng có chứa 50 mg/l kháng sinh chọn lọc

(Joao và Brơn, 1993; Vidya và cs., 2000;

Faino và cs., 2004) Do rễ cây rất mẫn cảm

với kháng sinh, nếu rễ cây phát triển khoẻ

mạnh điều đó chứng tỏ cây có chứa gen

được chuyển (Draper và cs., 1988) Thí

nghiệm của chúng tôi cũng áp dụng theo

phương pháp này để xác định những cây có

khả năng đã được chuyển gen gồm những

cây có bộ rễ phát triển, cây khoẻ mạnh

b Kiểm tra kiểu gen

Tiến hành phân tích về phân tử đối với

sự biểu hiện của gen, PCR (Shen, 1998; Bhat và Srinivasan, 2002), bằng các enzyme đặc trưng HindIII, Pstl để xác định các vùng có trọng luợng phân tử tương ứng

với gen Chitinase Phản ứng PCR được

hoàn thành trong 50 µl của mỗi một hỗn hợp phản ứng chuNn với enzym Taq ADN polimeraza, các nucleotid và với cặp mồi

đặc trưng của gen Chitinase

CHIF 5’ATGGGGAAGAATAGGATGATG-3’ CHIR.5’GCCGACAGTGGTCCCAAAGAT-3’

Kết quả điện di cho thấy trong 12 cây

cà chua tạo được trên môi trường chọn lọc chỉ có 2 cây biểu hiện có mặt gen

Chitinase, gen chuyển được khuyếch đại

tương ứng 788 bp (hình 2)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (-)

Hình 1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Chitinase

trong các cây được chuyển gen

788 bp

IV KẾT LUẬN

1 Kết luận

Kết quả bước đầu nghiên cứu sử dụng vi khuNn Agrobacterium tumefaciens EHA

105 có chứa plasmid PCAMBIA 1300 để chuyển gen vào cà chua đã thu được 2 cây cà

chua P375 mang gen kháng nấm gây bệnh cây Chitinase Nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến hiệu suất chuyển gen ở cây cà chua rút ra được một số nhận xét tương tự một

số kết nghiên cứu đã được thực hiện ở nước ngoài Hiệu suất chuyển gen ở cà chua phụ thuộc vào các yếu tố: Kiểu gen của từng giống; cơ quan tử được lựa chọn để nuôi cấy tái sinh và chuyển gen; nồng độ vi khuNn và thời gian đồng nuôi cấy; sử dụng loại kháng sinh chọn lọc

2 Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen kháng nấm gây bệnh cây vào giống cà chua P375 Đánh giá đặc tính cây cà chua mang gen được chuyển trong điều kiện cách ly nhằm chọn tạo được giống cà chua có những đặc tính tốt và có khả năng kháng nấm gây bệnh cây phục vụ sản xuất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Chyi Y-S, Phillips GC., 1987 High efficiency Agrobacterium - mediated

transformation of Lycopersicon based on conditions favorable for regeneration Plant cell Rep

2 Lê Thị Ánh Hồng, 2000 Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen ở thực vật Nhà xuất

bản Nông nghiệp, 2000

3 %guyễn Đức Thành, 2000 Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu và ứng dụng

NXB Nông nghiệp

4 Hu W, Philips GC., 2001 A combination of overgrowth- control and antibiotics improves Agrobacterium tumerfaciens - mediated transformation efficiency for

(L esculentum) In vitro cell Bio-Plant

5 Park et al., 2003 Efficinet genotype-independent Agrobacterium - mediated tomato

transformation J.Plant Physiol 160: 1253-1257

6 Frary A, Earle ED., 1996 An examination of factor affecting the efficiency of Agrobacterium - mediated transformation of tomato Plant Cell Rep

!gười phản biện: !guyễn Văn Vấn