Bước 1: Chuẩn bị dịch vi khuẩn lây nhiễm
Cấy vi khuẩn A. tumefaciens từ ñĩa thạch sang ống fancol chứa 5ml môi trường YEB lỏng (pH=7,2), có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi lắc 200vòng/phút, ở 28oC, qua ñêm. Chuyển 1ml dịch vi khuẩn sang bình tam giác (loại 50ml) có chứa 10ml môi trường YEB lỏng (pH=5,6), bổ sung kháng sinh thích hợp và Acetosyringone (AS), nuôi lắc 200vòng/phút, ở
28oC, qua ñêm. Kiểm tra OD600 dịch vi khuẩn lây nhiễm bằng máy ño OD trước khi lây nhiễm.
Bước 2: Lây nhiễm bèo – vi khuẩn
Bèo tấm W.globosa sử dụng cho thí nghiệm biến nạp gen ñược nuôi trên ñĩa thạch chứa môi trường SH ñặc (Schenk and Hildebrandt, 1972) bổ
sung 10mg/l sucrose, thời gian từ 7–10 ngày. Chuyển mẫu bèo sang ống eppendoff 1,5ml chứa 1ml dịch khuẩn A. tumefaciens và trộn ñều bằng máy votex khoảng 30 giây. Sau ñó, tiến hành ly tâm ñể gây tổn thương cho cánh bèo giúp quá trình lây nhiễm diễn ra thuận lợi hơn.
Bước 3: ðồng nuôi cấy
Sau khi ly tâm, bèo ñược chuyển sang môi trường ñồng nuôi cấy SH (Schenk & Hildebrandt, 1972) có bổ sung 10mg/l sucrose và Acetosyringone (AS). Thời gian ñồng nuôi cấy 3 ngày trong ñiều kiện tủ nuôi Rumed (nhiệt
Bước 4: Loại bỏ vi khuẩn và nuôi phục hồi mẫu bèo
Sau thời gian ñồng nuôi cấy, chúng tôi tiến hành lấy 1 phần bèo ñem nhuộm X–glux, ủ trong tủ 37oC qua ñêm ñể kiểm tra hiệu quả chuyển gen. Phần bèo còn lại ñược chuyển sang nuôi trên môi trường diệt khuẩn (nền khoáng SH + 10mg/l saccarose + cefotaxime) trong tủ Rumed 2–3 ngày ñể
loại bỏ hết vi khuẩn trước khi ñem chọn lọc thực vật.
Sau ñó, tiếp tục cấy mẫu bèo ñã chuyển gen sang môi trường khoáng SH có bổ sung 10mg/l saccarose (1tuần/1lần) ñể phục hồi và tiến hành cấy chuyển trong 4–6 tuần ñể nhân mẫu trước khi ñưa mẫu bèo chuyển gen sang môi trường chọn lọc thực vật.
Bước 5: Chọn lọc bèo chuyển gen
Sau khi diệt khuẩn và nuôi phục hồi, bèo chuyển gen ñược ñưa sang môi trường chọn lọc có bổ sung tác nhân chọn lọc thích hợp ñể sàng lọc các cá thể bèo ñược chuyển gen. Những cánh bèo sống sót trên môi trường chọn lọc ñược tách riêng và nhân dòng. Duy trì và cấy chuyển các dòng bèo ñã chuyển gen trên môi trường chọn lọc trong 4–6 chu kỳ (5–7 ngày/chu kỳ) ñể
thu nhận sinh khối bèo.