4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.3. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñế n tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen
Hiệu quả chuyển gen thông qua A. tumefaciens phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Phương thức lây nhiễm là một yếu tố khá quan trọng quyết ñịnh ñến hiệu quả của quá trình biến nạp. Trong quá trình lây nhiễm, nếu sử dụng ñúng phương thức sẽ giúp vi khuẩn tiếp xúc tốt với tế bào thực vật và làm tăng khả
năng xâm nhiễm. Một số nghiên cứu chuyển gen thành công cho thấy việc áp dụng các biện pháp vật lí như ly tâm, hút chân không ñã có tác ñộng tích cực
ñến quá trình chuyển gen. Việc ly tâm giúp loại bỏ hoàn toàn bọt khí trong dịch vi khuẩn lây nhiễm, gây tổn thương nhẹ ñối với tế bào thực vật; ñồng thời việc hút chân không tạo ra sự chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài tế bào thực vật (Cheng et, al. 2004). Chính vì vậy, chúng tôi ñã tiến hành thí nghiệm xác ñịnh ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm
ñến hiệu quả chuyển gen.
Trong thí nghiệm này, chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL-1 ñược sử
dụng với mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm OD600=0,5–1,0; áp dụng 3 phương thức lây nhiễm vi khuẩn với bèo tấm như sau:
• Công thức 1: Lây nhiễm trong ñiều kiện bình thường bằng cách dùng máy votex trộn ñều khoảng 30 giây, sau ñó giữở nhiệt ñộ phòng 30 phút.
• Công thức 2: Lây nhiễm trong ñiều kiện ly tâm thường ở tốc ñộ 1200rpm trong 20 phút, sau ñó giữở nhiệt ñộ phòng 10 phút.
• Công thức 3: Lây nhiễm trong ñiều kiện ly tâm hút chân không với áp suất chân không 75cmHg, ly tâm ở tốc ñộ 1200rpm (sử dụng máy ly tâm chân không Concentrator 5301, Eppendorf, ðức), thời gian 20 phút, sau ñó giữ ở
Bảng 3: Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen
CTTN Tổng số cánh nhuộm X-gluc Số cánh có ñốm xanh Tỷ lệ biểu hiện gen gus (%) Mức ñộ biểu hiện gen gus 1 195 15 7,69 + 2 237 23 9,70 + 3 219 31 14,16 ++
Theo kết quả thu ñược (bảng 3), chúng ta có thể thấy các tác nhân vật lý
ñã có ảnh hưởng tích cực ñến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn A.tumefaciens vào bèo tấm. Trong quá trình biến nạp, khi các tác nhân vật lý càng tác ñộng mạnh thì hiệu quả chuyển gen càng cao. Cũng như những nghiên cứu ñã ñược công bố, việc ly tâm làm tăng cường sự tiếp xúc giữa vi khuẩn và cánh bèo nên hiệu quả chuyển gen cũng tăng lên từ 7,69% (trong ñiều kiện thường) lên 9,70% khi ly tâm. ðặc biệt, việc kết hợp giữa ly tâm và hút chân không ñã cho thấy hiệu quả chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa tăng lên rõ rệt, tỷ lệ biểu hiện của gen gus là cao nhất (ñạt 14,16%). Do ñó, chúng tôi quyết ñịnh lây nhiễm bằng cách ly tâm hút chân không với áp suất chân không 75 cmHg, ly tâm ở tốc
ñộ 1200rpm (sử dụng máy ly tâm chân không Concentrator 5301, Eppendorf,
ðức), thời gian 20 phút, sau ñó giữở nhiệt ñộ phòng 10 phút.
Hình 4.3: Ảnh hưởng của cách phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen.
A_votex trong 30 giây, B_Ly tâm thường, C_Ly tâm, hút chân không