4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.4. Xác ñị nh thời gian lây nhiễm thích hợp của vi khuẩn A.tumefaciens với bèo tấm Wolffia globosa
với bèo tấm Wolffia globosa
Thời gian lây nhiễm là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp ñến hiệu quả biểu hiện gen và khả năng phục hồi của mẫu sau khi biến nạp. Nếu thời gian lây nhiễm dài sẽ dẫn ñến sự sinh trưởng quá mức của vi khuẩn trong môi trường ñồng nuôi cấy sau khi lây nhiễm, ñồng thời làm giảm khả năng sống và tái sinh của mô thực vật sau chuyển gen. Thời gian lây nhiễm quá ngắn có thể làm cho vi khuẩn chưa kịp xâm nhiễm vào mô, tế bào thực vật. Vì vậy, với mỗi ñối tượng thực vật cần xác ñịnh khoảng thời gian lây nhiễm thích hợp.
Bèo tấm Wolffia globosa là một trong những loài có kích thước nhỏ bé nhất trên thế giới. Tuy nhiên, trái lại với kích thước nhỏ bé ñó nó lại có một lớp cutin và thành tế bào khá dày ñể bảo vệ. Ngoài ra, chính kích thước nhỏ
bé và hình dạng ñặc biệt của nó (hình dạng tròn hoặc elíp) nên việc gây tổn thương và lây nhiễm khi biến nạp vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây
gặp nhiều khó khăn.
ðể xác ñịnh khoảng thời gian biến nạp thích hợp nhất, chúng tôi ñã tiến hành lây nhiễm mẫu bèo Wolffia globosa sử dụng chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens AGL-1. Chủng vi khuẩn AGL-1 sử dụng ñể biến nạp ñược nuôi lắc trên môi trường YEB lỏng 200vòng/phút, ở 28oC, qua ñêm cho ñến khi ñạt ñược mật ñộ OD600=0,5–1,0. Mẫu bèo và vi khuẩn ñược chứa chung trong ống eppendoff và ñem ly tâm hút chân không với khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau từ 5, 10, 15, 20 và 25 phút. Công thức ñối chứng
ñược sử dụng là dung dịch YEB không chứa vi khuẩn. Sau 3 ngày ñồng nuôi cấy, một phần bèo tấm W. globosa ñược nhuộm bằng dung dịch X-gluc ñể ñánh giá khả năng biểu hiện của gen gus và thu ñược kết quả sau:
Bảng 4: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen
gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen
CTTN Thời gian (phút) Tổng số cánh nhuộm X-gluc Số cánh có ñốm xanh Tỷ lệ biểu hiện gen gus (%) 1 ðC (*) 211 0 0,00 2 5 261 17 6,51 3 10 178 19 10,67 4 15 235 27 11,49 5 20 197 30 15,23 6 25 233 29 12,45
Dễ nhận thấy rằng khi tăng thời gian lây nhiễm (từ 5 phút lên 25 phút) biểu hiện của gen gus tăng lên rõ rệt, từ 6,51 – 15,23%. Giá trị này thay ñổi không nhiều khi thời gian lây nhiễm từ 10 – 15 phút (ñạt 10,67–11,49). Tuy nhiên, khi tăng thời gian lây nhiễm lên 20 phút chúng tôi nhận thấy có nhiều cánh bèo bị tổn thương hơn do tác ñộng của việc ly tâm và hút chân không, tỷ
lệ biểu hiện gen gus cao nhất (ñạt 15,23%). Khi lây nhiễm trong 25 phút cũng cho tỷ lệ biểu hiện khá cao, nhưng do thời gian dài nên có nhiều cánh bèo bị
tổn thương nặng và chết khi ñồng nuôi cấy.
Mặt khác, chúng tôi quan sát thấy mức ñộ biểu hiện gen gus có sự khác nhau không rõ rệt giữa các công thức thí nghiệm với thời gian lây nhiễm khác nhau, màu xanh chàm ñều biểu hiện rõ rệt trên toàn bộ cành bèo. Vì vậy, thời gian lây nhiễm thích hợp nhất ñối với bèo tấm Wolffia globosa là 20 phút.
Hình 4.4: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus