4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây
Wolffia globosa nguyên cây
Theo công bố quốc tế, các nhà khoa học ñã nghiên cứu và chọn lọc
ñược một số chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo tấm, ñó là
các chủng: EHA105, EHA101, GV3101, LBA4404, AGL-1 và C58. Trong thí
nghiệm này, chúng tôi tiến hành sử dụng 05 chủng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens là: GV3101, LBA4404, EHA105, AGL-1 và C58 do viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp ñể lây nhiễm với bèo tấm W.globosa. Tất cả các chủng này ñều mang vector pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị gus và gen chỉ thị chọn lọc hpt. Ban ñầu, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
ñược cấy từ ñĩa thạch sang ống fancol chứa 5ml môi trường YEB lỏng (pH=7,2), có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi lắc 200vòng/phút, ở 28oC, qua ñêm. Sau ñó chuyển 1ml dịch vi khuẩn sang bình tam giác (loại 50ml) có chứa 10ml môi trường YEB lỏng (pH=5,6), bổ sung kháng sinh thích hợp và Acetosyringone (AS), nuôi lắc 200vòng/phút, ở 28oC, qua ñêm. Kiểm tra OD600 dịch vi khuẩn lây nhiễm bằng máy ño OD. Và công thức ñối chứng chúng tôi sử dụng ở ñây là dung dịch YEB không có vi khuẩn. Sau 3 ngày
ñồng nuôi cấy, mẫu bèo biến nạp ñược nhuộm bằng dung dịch X-gluc ñểñánh giá khả năng biểu hiện của gen gus.
Theo kết quả thu ñược (bảng 4.1), ở công thức ñối chứng sau khi nhuộm X-gluc, không có cánh bèo nào cho biểu hiện màu xanh chàm của gen
gus (hình 4.1_A). Do vậy, có thể khẳng ñịnh không có hiện tượng dương tính giả xảy ra và kết quả thí nghiệm thu ñược hoàn toàn ñáng tin cậy.
Xét về ảnh hưởng của vi khuẩn A. tumefaciens ñến hiệu quả chuyển gen, chúng tôi nhận thấy trong số 05 chủng A. tumefaciens thì chủng AGL-1 và GV3101 xâm nhiễm có hiệu quả nhất vào bèo tấm Wolffia globosa. Trong
ñó, chủng AGL-1 có tỷ lệ biểu hiện của gen gus cao nhất (ñạt 6,93%) và GV3101 (5,50%). Các chủng khác có mức ñộ xâm nhiễm kém hơn lần lượt là
EHA105 (3,92%), LBA4404 (2,16%) và chủng C58 không có khả năng xâm
nhiễm vào bèo W. globosa.
Bảng 1: Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa
CTTN Chủng VK Tổng số cánh nhuộm X-gluc Số cánh có ñốm xanh Tỷ lệ biểu hiện gen gus (%) Mức ñộ biểu hiện gen gus
1 ðC (*) 198 0 0,00 - 2 GV3101 181 10 5,50 ++ 3 LBA4404 139 3 2,16 + 4 C58 131 0 0,00 - 5 EHA105 153 6 3,92 + 6 AGL-1 231 16 6,93 ++
Ghi chú: (*)_bèo ñược lây nhiễm trong môi trường không có vi khuẩn A.tumefaciens; Mức ñộ biểu hiện của gen gus (dựa trên quan sát ñộ ñậm của
ñốm xanh): (-)_không có ñốm xanh, (+)_kém (++)_trung bình, (+++)_cao.
Ngoài ra, theo quan sát chúng tôi còn nhận thấy ở công thức sử dụng chủng AGL-1 mức ñộ biểu hiện của gen gus cũng cao hơn so với các chủng khác, màu xanh chàm ñậm hơn và xuất hiện trên toàn bộ cánh bèo (hình 4.1_F). Vì vậy, chúng tôi quyết ñịnh sử dụng chủng AGL-1 làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 4.1: Biểu hiện của gen gus khi biến nạp bằng các chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefacies
A_ðối chứng (dung dịch YEB); B_GV3101; C_LBA4404; D_C58; E_EHA105; F_AGL-1
Sau khi xác ñịnh ñược AGL-1 là chủng vi khuẩn thích hợp nhất ñể biến