4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3.Nghiên cứu xác ñị nh ngưỡng gây chết của kháng sinh thực vật ñế n bèo tấm W globosa
bèo tấm W. globosa
Sau khi ñồng nuôi cấy và diệt khuẩn, các cánh bèo trong thí nghiệm chuyển gen phải ñược ñưa sang môi trường có kháng sinh thực vật ñể chọn
lọc ra từng cánh bèo mang gen và nhân lên thành dòng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, vector chuyển gen mang gen chỉ thị chọn lọc hpt có vai trò trong việc sàng lọc và thu nhận các cá thể bèo tấm chuyển gen. Các loại kháng sinh
ñược sử dụng làm tác nhân chọn lọc ñối với gen hpt gồm: Geneticin, Paromomycin và Hygromycin. Tuy nhiên, ảnh hưởng của các tác nhân chọn lọc này ñối với mỗi ñối tượng cây trồng biểu hiện rất khác nhau. Vì vậy, nghiên cứu xác ñịnh ñược loại kháng sinh và nồng ñộ thích hợp của chúng trong quá trình chọn lọc bèo tấm chuyển gen là rất cần thiết.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ngưỡng gây chết của 2 loại kháng sinh thực vật là Geneticin và Paromomycin ñể sử dụng cho việc chọn lọc các cánh bèo ñược chuyển gen. Các cánh bèo W. globosa bình thường ñược nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 2 loại kháng sinh thực vật này với các nồng ñộ khác nhau và tiến hành theo dõi trong 15 ngày, cứ 5 ngày chúng tôi lại chụp ảnh và ñếm số lượng cánh bèo sống 1 lần. Số cánh và hệ số nhân (Số liệu trong ngoặc ở bảng là hệ số nhân) sau mỗi lần theo dõi
ñược thể trong 2 bảng sau:
Bảng 8: Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Geneticin
Ngày Geneticin
(mg/l)
Ban ñầu 5 10 15
0 154 223 (1,51) Quá nhiều Quá nhiều
5 166 246 (1,48) 312 (1,88) 343 (2,07) 10 133 197 (1,48) 246 (1,85) 119 (0,89) 20 113 176 (1,56) 31 (0,27) 0 (0,00) 30 137 103 (0,75) 0 (0,00) 0 (0,00) 40 123 79 (0,64) 0 (0,00) 0 (0,00) 50 169 114 (0,67) 0 (0,00) 0 (0,00)
Hình 4.9: Ảnh hưởng của Geneticin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa
Bảng 9: Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Paromomycin
Ngày
Paromomycin (mg/l)
Ban ñầu 5 10 15
0 115 211 (1,83) Quá nhiều Quá nhiều
25 122 234 (1,92) 313 (2,57) 365 (2,99)
50 108 187 (1,73) 219 (2,02) 162 (1,5)
100 118 201 (1,70) 107 (0,91) 29 (0,25)
Hình 4.10: Ảnh hưởng của Paromomycin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa
Sau 5 ngày G20 sau 10 ngày G30 sau 10 ngày
P100 sau 15 ngày P25 sau 15 ngày P50 sau 15 ngày
Dựa trên kết quả thí nghiệm thể hiện trên 2 bảng (bảng 8 và bảng 9) cộng với hình ảnh ñược chụp lại chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Với Geneticin, công thức ñối chứng không bổ sung Geneticin có lượng bèo liên tục tăng sau 15 ngày nuôi cấy. Trong khi ở các công thức khác số lượng cánh bèo có hiện tượng giảm xuống. ðiều này chứng tỏ Geneticin có tác ñộng tích cực trong việc chọn lọc. Công thức G5 cho thấy lượng bèo vẫn tăng lên sau 15 ngày nuôi cấy nhưng tốc ñộ tăng chậm hơn so với ñối chứng.
Ở công thức G10, mãi ñến ngày thứ 15 mới quan sát thấy số lượng cánh giảm ñi. Công thức G20, sau 5 ngày cánh vẫn nhân lên khá bình thường. Tuy nhiên, sau ñó giảm nhanh chóng ở ngày thứ 10 và sau 15 ngày thì bèo chết hoàn toàn.
Với các công thức G30, G40, G50, ngưỡng chết 50% ñều nằm trong khoảng sau 5 ngày ñến 10 ngày. Sau 10 ngày, hầu hết cánh bèo ñều chết (ñạt ngưỡng 100%). Sau 5 ngày, hệ số nhân chỉ bằng gần 1 nửa so với hệ số nhân
ở các công thức thí nghiệm bổ sung từ 0 – 20mg/l.
- Với Paromomycin, một ñiều dễ quan sát thấy là trong dải nồng ñộ thí
nghiệm này, sau 5 ngày ñầu tiên số lượng cánh bèo vẫn tăng lên, hệ số nhân của bèo tương ñối bình thường, không thấy có dấu hiệu ảnh hưởng của kháng sinh. Và hệ số nhân chỉ bắt ñầu có dấu hiệu giảm ñi từ ngày thứ 10 ở công thức thí nghiệm P50 và P100. Sau 15 ngày, chỉ có công thức P100 là số lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cánh giảm hơn 50%. Khi ñể kéo dài theo dõi thêm thì thấy sau 20 ngày ñến 25
ngày ở công thức P100 vẫn còn có cánh sống. Hai công thức ñối chứng và
P25 chúng tôi nhận thấy bèo vẫn nhân lên nhanh, gần như không thấy rõ ñược
ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc.
Vì vậy, chúng tôi ñã sử dụng kháng sinh Geneticin với nồng ñộ 30mg/l
ñể chọn lọc bèo tấm sau chuyển gen.
Như vậy, sau rất nhiều thí nhiệm nghiên cứu chúng tôi ñã bước ñầu tối ưu
ñược một số yếu tố trong quy trình chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dựa vào tỷ lệ và
mức ñộ biểu hiện của gen chỉ thị gus. Hiệu quả chuyển gen vào bèo tấm Wolffia
globosa nguyên cây ñạt cao nhất khi: Sử dụng chủng vi khuẩn AGL-1, mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ở OD600 là 0,5–1,0 x 109 tế bào/ml; biến nạp trong ñiều kiện ly tâm, hút chân không trong 20 phút; và sau ñó ñồng nuôi cấy trong 3 ngày trên môi trường SH ñặc có bổ sung 200µM Acetosyringone.
Hình 4.8: Biểu hiện của gen gus khi chuyển gen bằng quy trình hoàn thiện
ðể thu ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosa mang gen kháng nguyên Ha1, chúng tôi ñã dựa vào kết quả thu ñược của các thí nghiệm trên: Sử dụng chủng vi khuẩn AGL-1 mang vectơ p6d35SUbiHa1 chứa gen Ha1 (gen kháng virus H5N1) và gen chỉ thị chọn lọc hpt (hygromycin phospho transferase),
mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ở OD600 là 0,5–1,0 x 109 tế bào/ml; biến nạp trong
ñiều kiện ly tâm, hút chân không trong 20 phút; và sau ñó ñồng nuôi cấy trong 3 ngày trên môi trường SH ñặc có bổ sung 200µM Acetosyringone.
Bèo tấm sau chuyển gen và diệt khuẩn ñược chuyển sang nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh thực vật là Geneticin với nồng ñộ
30mg/l, cứ 5–7 ngày cấy chuyển 1 lần. Sau 4–6 chu kỳ như vậy, chúng tôi chọn ra ñược những cánh bèo sống sót, tách riêng thành từng dòng và tiếp tục nhân lên trong môi trường có kháng sinh chọn lọc. Kết quả chúng tôi ñã tạm thu ñược 12 mẫu bèo tấm chuyển gen có thể sống và phát triển bình thường trên môi trường SH có bổ sung 30mg/l Geneticin. Các mẫu bèo tấm này ñã
ñược nhân sinh khối, khi lượng sinh khối bèo chuyển gen của mỗi mẫu ñạt khoảng 2g chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số và phân tích PCR.
Sơñồ quy trình chuyển gen Ha1 vào Wolffia globosa nguyên cây
AGL-1 + 5 ml YEB lỏng (pH=7.2) +
Kanamycin, Cabemycin
1ml dịch AGL-1 + 10ml YEB lỏng (pH=5.6) + Kanamycin, Cabemycin + 200µM Acetosyringone
ðo OD600 dịch vi khuẩn (0,5-1,0 x 109 TB/ml)
Lấy 0,5g bèo từñĩa nuôi cấy + dịch khuẩn Lây nhiễm trong ñiều kiện ly tâm hút chân không
20phút
Rửa lại mẫu bèo sau khi lây nhiễm bằng nước cất khử trùng
Chuyển mẫu bèo sang môi trường SH ñặc + 1%sucrose + 200µM Acetosyringone
Cấy chuyển bèo sang SH ñặc + 1% sucrose
Phân tích PCR
Nuôi lắc 200
vòng/phút, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
28oC,qua ñêm
Cấy vi khuẩn AGL-1(-20oC) sang ñĩa thạch YEB + KS thích hợp 28oC , 2-3 ngày Chuẩn bị dịch khuẩn Lây nhiễm ðồng nuôi cấy Diệt khuẩn
Diệt khuẩn trên SH ñặc + 1%sucrose +250µM Cefotaxim (200µl Timentin)
Nhân mẫu
Chọn lọc bèo chuyển gen trên SH ñặc +
1%sucrose + 200µM Geneticin Chọn lọc Phân tích cây chuyển gen Nuôi trong tủ nuôi Rumed
4.4. Phân tích PCR cây chuyển gen
ðối với mỗi mẫu bèo thu ñược chúng tôi tiến hành lấy khoảng 1g mẫu