ðối với các dòng bèo thu ñược sau chọn lọc, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phân tích PCR theo phương pháp sau:
• Tách DNA tổng số từ bèo tấm
ðể tách triết DNA từ bèo tấm chúng tôi sử dụng phương pháp của Stewart & Vie (1993), cụ thể như sau:
Chuẩn bị dung dịch ñệm chiết: (DEB1)
100ml DEB1 gồm:
Dung dịch mẹ Lượng cần lấy cho 100ml DEB Nồng ñộ cuối cùng (100ml DEB) 1M Tris-HCl (pH=8) 10ml 0,1M Tris-HCl (pH=8) 5M NaCl 28ml 1,4M NaCl 1M EDTA (pH=8) 1ml 10mM EDTA (pH=8) - Thêm H2O ñến 100 ml - Khử trùng 117oC thời gian 20 phút
- Bổ sung CTAB, PVP và ascorbic acid vào DEB sau khi khử trùng (bổ
sung khi dung dịch ở khoảng 65oC ñể hoà tan hết các chất này).
CTAB 2g ( 2% CTAB)
PVP 2g (2% PVP)
Ascorbic acid 88mg (5mM ascorbic acid)
- Bổ sung mercaptoethanol 100µl /100ml DEB trước khi dùng – Chuẩn bị DEB1: ủở bểổn nhiệt 65oC.
- Nghiền khoảng 1g mẫu bèo thành bột mịn trong nitơ lỏng, chuyển sang eppendorf 1,5ml.
- Thêm 700µl ñệm DEB1 ở to 65oC. Ủở bểổn nhiệt 65oC ít nhất 1h. - Ly tâm 15 phút với tốc ñộ 12.000 vòng/phút.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới, bổ sung 50µl ARNase (10mg/l). - Ủ ở bểổn nhiệt 37oC trong 1–2h.
- Thêm 25 : 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10–15 phút. Ly tâm 10– 15 phút 12.000 – 13.000 vòng/phút.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới, bổ sung 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1. Votex trong 10 phút. Ly tâm 15phút ở 12.000–13.000 vòng/phút.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới, bổ sung isopropanol (tỷ lệ 1 : 1). Thêm 20µl Acetat natri 3M (xúc tác).
- ðưa vào tủ - 20oC trong 2h ñể thu ñược lượng kết tủa lớn nhất. - Ly tâm thu tủa và rửa sạch bằng cồn 75o ít nhất 2 lần.
- Thổi khô DNA ñã rửa sạch và hòa tan bằng TE.
•Kĩ thuật phân tích gen kháng nguyên Ha1:
Xác ñịnh sự có mặt của gen kháng nguyên Ha1 trong hệ gen thực vật bằng phản ứng PCR sử dụng các mồi ñặc trưng.
T-Ha1-F: 5’ – TACCCAGGGGATTTCAATGAC – 3’ T-Ha1-R: 5’ – GACACTTGGTGTTGCAGTTAC – 3’
Quy trình chạy PCR ñể phân tích gen Ha1: chu kỳ 1 ở 95oC trong 2 phút, 30 chu kỳ tiếp theo (95oC/30giây; 54oC/30giây, 72oC/75giây) và chu kỳ
Bảng thành phần phản ứng PCR phân tích gen Ha1
Chúng tôi tiến hành ñiện di sản phẩm PCR trên gel agarose (1%) và quan sát kết quả trên máy soi gel (Gel Doc-Pharmacia).
Thiết bị: Máy PCR (Peltier Thermal Cycler RTC-200); hệ thống ñiện di (Biorad); máy soi gel (Gel Doc-Pharmacia), máy chụp ảnh (Polaroid).
Thành phần Thể tích (µl) Betain 5M 4,00 DMSO 100% 1,00 MgCl2 25 mM 0,80 PCR buffer (+KCl) (-MgCl2) 10X 2,00 dNTPs 2 mM 2,00 Primer 1 (25pM) 1,00 Primer 2 (25pM) 1,00
Taq Polymerase 500U 0,50
DNA 50 ng 4,00
H2O 3,70 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơñồ quy trình chung chuyển gen vào Wolffia globosa
Chuẩn bị
dịch khuẩn
Lây nhiễm
Nuôi trong ðồng nuôi
tủ Rumed cấy Diệt khuẩn Nhân sinh khối Chọn lọc Phân tích cây chuyển gen
Cấy vi khuẩn Agro (-20oC) sang ñĩa thạch YEB + KS thích hợp 28oC , 2-3 ngày
Agro + 5 ml YEB lỏng (pH=7.2) + Kháng sinh thích hợp
1ml dịch khuẩn + 10ml YEB lỏng (pH=5.6) + KS thích hợp + Acetosyringone
ðo OD600 dịch vi khuẩn lây nhiễm Lấy 0,5g bèo từñĩa nuôi cấy + dịch khuẩn
Lây nhiễm trong ñiều kiện ly tâm Rửa lại mẫu bèo sau khi lây nhiễm
bằng nước cất khử trùng
Chuyển mẫu bèo sang môi trường SH + 1%sucrose + Acetosyringone
Cấy chuyển bèo sang SH + 1%sucrose + kháng sinh diệt khuẩn
Cấy chuyển bèo sang SH + 1% sucrose
Cấy chuyển bèo sang SH ñặc + 1%sucrose + tác nhân chọn lọc
Phân tích PCR
Nuôi lắc 200 vòng/phút, 28oC, qua ñêm
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
a) Nghiên cứu tối ưu hoá một số yếu tốảnh hưởng ñến quá trình biến nạp gen vào bèo tấm W. globosa