4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.2.Xác ñị nh mật ñộ vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa
nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn AGL-1 mang vectơ p6d35SUbiHa1 chứa gen
Ha1 (gen kháng virus H5N1) và gen chỉ thị chọn lọc hpt (hygromycin
phospho transferase) kháng kháng sinh hygromycin. Chủng vi khuẩn này sẽ ñược sử dụng cùng với chủng vi khuẩn AGL-1 mang vector pCAMBIA1301 trong các thí nghiệm tiếp theo ñể tạo mẫu bèo mang gen chuyển Ha1.
4.1.2. Xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa Wolffia globosa
Mật ñộ vi khuẩn trong môi trường lây nhiễm là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả quá trình chuyển gen. Mật ñộ cao quá hay thấp quá
ñều không tốt. Nếu mật ñộ quá cao sẽ làm gia tăng sự tiếp xúc của mô, tế bào
A B
F E E
C
mẫu với vi khuẩn. Tuy nhiên, có thể chính sự xâm nhiễm quá nhiều của vi khuẩn sẽ làm các mô, tế bào chết nhiều hơn và gặp rất nhiều khó khăn trong việc loại bỏ vi khuẩn và tái sinh mẫu sau khi biến nạp. Nhưng ngược lại, nếu mật ñộ vi khuẩn quá thấp thì sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với các mô, tế bào sẽ
bị hạn chế làm hiệu quả chuyển gen thấp. Trong thí nghiệm này, chúng tôi ñã tiến hành lây nhiễm bèo tấm Wolffia globosa với chủng A. tumefaciens AGL- 1 ở các mật ñộ tế bào khác nhau, có giá trị OD600nm dao ñộng từ 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3; 1,5. Kết quả thí nghiệm ñược trình bày trên bảng 2.
Bảng 2: Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen
CTTN Mật ñộ VK Tổng số cánh nhuộm X-gluc Số cánh có ñốm xanh Tỷ lệ biểu hiện của gen gus (%)
1 ðC (*) 241 0 0,00 2 0,3 369 43 11,65 3 0,5 241 37 15,35 4 0,7 312 51 16,35 5 1,0 273 41 15,02 6 1,3 299 31 10,37 7 1,5 247 28 11,34
Kết quả trên bảng 2 cho thấy, mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ảnh hưởng không nhiều tới hiệu quả chuyển gen. Khi tăng mật ñộ tế bào vi khuẩn từ 0,3– 1,5 thì biểu hiện gen gus dao ñộng không nhiều, từ 10,37–16,35%. Tỷ lệ biểu hiện của gen gus ñạt giá trị cao nhất khi lây nhiễm bèo tấm với dịch vi khuẩn có mật ñộ tế bào OD600 = 0,5 – 1,0, ñạt 15,02–16,35%.
cũng ñạt khá cao. Tuy nhiên, do mật ñộ tế bào vi khuẩn cao nên ñã xuất hiện nhiều cánh bèo bị chết sau khi ñồng nuôi cấy. Hơn nữa, việc diệt khuẩn sau
ñồng nuôi cấy ñối với các cánh bèo trong công thức thí nghiệm này gặp khó khăn hơn nhiều so với các công thức thí nghiệm khác, nồng ñộ kháng sinh diệt khuẩn cao hơn và thời gian ñể loại bỏ cũng dài hơn hơn. Vì vậy, chúng tôi thấy rằng mật ñộ tế bào vi khuẩn có giá trị OD600 = 0,5–1,0 là thích hợp nhất cho lây nhiễm với bèo tấm Wolffia globosa và quyết ñịnh chọn ñể sử
dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 4.2: Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gusở bèo tấm W. globosa sau khi biến nạp với A. tumefaciens
AGL-1. A_ðC (*); B_0,3; C_0,5; D_0,7; E_1,0; F_1,3; G_1,5 A B C E D G F
4.1.3. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen