Sau một thời gian đặt đoạn thân non chứa gen Gus lên môi trường chọn lọc MS đặc bổ sung picloram 12mg/l, cefotaxim 500mg/l và kanamycin có nồng độ lần lượt là: 50; 100; 150 mg/l một số đoạn thân bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo.
Kết quả các mẫu cảm ứng tạo mô sẹo thu được như ở bảng 5. Chúng tôi tiến hành chuyển gen Gus vào đoạn thân với tổng số mẫu là 900 và số mẫu tương ứng với từng thí nghiệm là 50 và được lặp lại 3 lần.
Bảng 5. Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94
OD660nm Nồng độ kanamycin (mg/l) 0,2 0,5 0,8 Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Lây nhiễm ngay 18,34±1,67 36,67±1,16 22,34±1,67 44,67±1,34 27,00±1,57 54,00±1,67 50 13,00±1,45 26,00±0,67 16,34±1,54 32,67±0,87 23,67±0,89 47,33±1,23 100 0 0 3,00±0,34 6,00±0,67 4,67±0,12 9,33±1,07 150 Cảm ứng trƣớc 2 ngày 21,67±1,56 43,33±0,67 34,34±1,67 68,67±1,33 34,34±1,57 68,67±1,54 50 16,34±1,33 32,67±1,33 29,00±1,00 58,00±1,12 28,00±1,06 56,00±1,23 100 3,67±0,13 7,33,±0,25 4,00±0,13 8,00±0,38 4,67±0,23 9,33±0,86 150
Quan sát kết quả ở bảng 5, thấy rằng:
Khi OD660nm = 0,2: Tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất ở nồng độ kanamycin 50mg/l là 36,67% (khi lây nhiễm ngay) và 43,33% (khi cảm ứng trước 2 ngày). Khi nồng độ kanamycin tăng lên đến 100; 150mg/l thì tỉ lệ tạo mô sẹo giảm xuống 0% (khi lây nhiễm ngay) và 8 % (khi cảm ứng trước 2 ngày)
Khi OD660nm = 0,5; 0,8: Tỉ lệ tạo mô sẹo tăng lên so với OD660nm = 0,2. Cụ thể: Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân cao nhất ở OD660nm = 0,8 và nồng độ kanamycin 50mg/l là 54% (khi lây nhiễm ngay) và 68,67% (khi cảm ứng trước 2 ngày) và tỉ lệ này thấp nhất khi OD660nm = 0,5 và nồng độ kanamycin là 150mg/l là 6% (khi lây nhiễm ngay) và 8% (khi cảm ứng trước 2 ngày).
Như vậy: Mật độ khuẩn (OD660nm) và nồng độ chọn lọc kanamycin ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân. Mật độ khuẩn (OD660nm) càng cao, nồng độ chọn lọc kanamycin càng thấp trong thí nghiệm này thì tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân càng cao. Chứng tỏ rằng mật độ khuẩn (OD660nm) quá thấp dẫn đến xác suất xâm nhập vào hệ gen thực vật thấp, nếu mật độ vi khuẩn quá cao gây thường sẽ gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp và nồng độ chọn lọc kanamycin quá cao làm cho mẫu chết và không tạo mô sẹo. Bên cạnh đó, khi tiến hành lây nhiễm ngay thì tỉ lệ tạo mô sẹo thấp hơn khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày mới lây nhiễm.
Vì vậy, khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày sau đó mới tiến hành biến nạp với mật độ khuẩn là 0,8 và nồng độ chọn lọc kanamycin 50mg/l là thích hợp nhất đến khả năng tạo mô sẹo của đoạn thân.
Sau khi có kết quả tạo mô sẹo ở các mẫu tiến hành nhộm Gus kiểm tra sự có mặt của gen Gus. Kết quả đươc thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân non giống sắn KM 94
OD660nm Nồng độ kanamycin (mg/l) 0,2 0,5 0,8 Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Lây nhiễm ngay 8,15±0,56 44,44±1,67 12,19±1,21 54,55±1,45 21,00±1,23 77,78±1,53 50 5,00±0,15 38,46±1,33 8,65±0,67 52,94±1,43 17,75±1,00 75,00±0,88 100 0 0 0 0 1,87±0,24 40,00±1,15 150 Cảm ứng trƣớc 2 ngày 14,77±1,12 68,18±1,31 28,28±1,78 82,35±1,33 28,45±1,56 82,86±0,67 50 10,21±1,04 62,50±1,35 20,00±1,67 68,97±1,67 20,00±1,303 71,43±1,54 100 0,92±0,06 25,00±1,02 1,00±0,01 25,00±1,02 0,93±0,53 20,00±0,89 150
Hình 7. Mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 có mặt gen Gus
Quan sát bảng 6, thấy rằng:
Khi OD660nm = 0,8 và nồng độ kanamycin 50mg/l: Tỉ lệ bắt màu nhuộm
Gus là cao nhất chiếm 82,86% (khi cảm ứng trước 2 ngày) và 77,78% (khi lây nhiễm ngay). Khi nồng độ kanamycin tăng lên đến 100mg/l tỉ lệ bắt màu ở đoạn thân giảm xuống còn 71,43% (khi cảm ứng trước 2 ngày) và 75% (khi lây nhiễm ngay). Khi nồng độ kanamycin tăng lên 150mg/l thì tỉ lệ này giảm nhanh xuống còn 20% (khi cảm ứng trước 2 ngày) và 40% (khi lây nhiễm ngay)
Khi OD660nm = 0,5 và nồng độ kanamycin 50mg/l tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus
là 54,55% (khi lây nhiễm ngay) và 82,35% (khi cảm ứng trước 2 ngày). Khi nồng độ kanamycin là 150mg/l thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus giảm xuốn còn 0% (khi lây nhiễm ngay) và 25% (khi cảm ứng trước 2 ngày).
Ở OD660nm = 0,2: Tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus thấp hơn so với OD660nm =
0,5; 0,8. Cụ thể: Khi nồng độ kanamycin là 50mg/l, tỉ lệ này là 44,44% (khi lây nhiễm ngay) và 68,18% (khi cảm ứng trước 2 ngày). Khi nồng độ kanamycin tăng lên đến 100; 150mg/l thì tỉ lệ này giảm xuống còn 0% (khi lây nhiễm ngay) và 25% (khi cảm ứng trước 2 ngày)
Như vậy: Mật độ khuẩn (OD660nm) và nồng độ chọn lọc kanamycin ảnh hưởng rõ rệt đến tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus của mẫu. Mật độ khuẩn (OD660nm) càng cao, nồng độ chọn lọc kanamycin càng thấp trong thí nghiệm này thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus của mẫu càng cao. Khi tiến hành lây nhiễm ngay thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus thấp hơn khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày mới lây nhiễm. Vì vậy, khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày sau đó mới tiến hành biến nạp với mật độ khuẩn là 0,8 và nồng độ chọn lọc kanamycin 50mg/l là thích hợp nhất đến khả năng bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân.