Sau một thời gian đặt mảnh lá mầm chứa gen Gus lên môi trường chọn
lọc MS đặc bổ sung picloram 12mg/l, cefotaxim 500mg/l và kanamycin có nồng độ lần lượt là: 50; 100; 150 mg/l một số mảnh lá mầm bắt đầu cảm ứng tạo mô sẹo.
Kết quả các mẫu lá mầm cảm ứng tạo mô sẹo thu được như ở bảng 7. Sau khi mẫu tạo mô sẹo tiến hành chuyển gen Gus vào lá mầm với tổng số mẫu là 540, tương ứng với từng thí nghiệm là 30 và được lăp lại 3 lần.
Bảng 7. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm giống sắn KM 94
OD660nm Nồng độ kanamycin (mg/l) 0,2 0,5 0,8 Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Lây nhiễm ngay 21,00±1,05 70,00±1,33 23,00±1,45 76,67±1,33 23,00±1,56 76,67±1,67 50 17,00±0,67 56,67±1,14 20,00±1,22 66,67±1,54 21,00±1,21 70,00±1,03 100 12,00±0,35 40,00±0,78 12,00±0,13 40,00±0,82 11,00±0,94 36,67±1,33 150 Cảm ứng trƣớc 2 ngày 23,00±1,34 76,67±1,56 26,00±1,33 86,67±1,23 26,00±1,20 86,67±1,67 50 19,00±1,09 63,33±2,33 20,00±0,97 66,67±1,54 22,00±1,00 73,33±1,52 100 11,00±0,57 36,67±0,86 11,00±0,34 36,67±0,47 13,00±0,56 43,33±0,98 150
Từ kết quả bảng 7, cho thấy:
Tỉ lệ tạo mô sẹo ở mảnh lá mầm cao nhất khi OD660nm = 0,5 và 0,8 và nồng độ chọn lọc kanamycin là 50mg/l và tỉ lệ này là 86,67% (sau cảm ứng 2 ngày) và tỉ lệ này thấp nhất là 36,67% khi nồng độ chọn lọc kanamycin là 150mg/l.
Khi tăng nồng độ kanamycin lên 100;150mg/l thì tỉ lệ này giảm. Cụ thể: Khi OD660 = 0,5 và nồng độ kanamycin là 150mg/l thì tỉ lệ tạo mô sẹo của lá mầm chỉ chiếm 36,67% (sau cảm ứng 2 ngày) và bằng với tỉ lệ tạo mô sẹo ở
OD660nm = 0,8 (lây nhiễm ngay) khi cùng nồng độ kanamycin.
Ở mật độ khuẩn OD660nm = 0,2, tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm thấp hơn so với tỉ lệ tạo mô sẹo khi OD660nm = 0,5 hoặc 0,8. Cụ thể: Ở OD660nm = 0,2, nồng độ kanamycin là 50mg/l tỉ lệ tạo mô sẹo là 70% (lây nhiễm ngay) và khi
OD660nm = 0,5 và 0,8 thì tỉ lệ này là 76,67%.
Như vậy: Tỉ lệ tạo mô sẹo ở mảnh lá mầm cao hơn so với đoạn thân và mảnh lá chưa trưởng thành. Mật độ khuẩn (OD660nm) và nồng độ chọn lọc kanamycin ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm. Mật độ khuẩn (OD660nm) càng cao, nồng độ chọn lọc kanamycin càng thấp trong thí nghiệm này thì tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm càng cao. Chứng tỏ rằng mật
độ khuẩn (OD660nm) quá thấp dẫn đến xác suất xâm nhập vào hệ gen thực vật thấp, nếu mật độ vi khuẩn quá cao gây thường sẽ gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp và nồng độ chọn lọc kanamycin quá cao làm cho mẫu chết và không tạo mô sẹo. Bên cạnh đó, khi tiến hành lây nhiễm ngay thì tỉ lệ tạo mô sẹo thấp hơn khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày mới lây nhiễm.
Vì vậy, khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày sau đó mới tiến hành biến nạp với mật độ khuẩn 0,8 và nồng độ chọn lọc kanamycin 50mg/l là thích hợp nhất đến khả năng tạo mô sẹo của mảnh lá mầm.
Sau khi có kết quả tỉ lệ tạo mô sẹo, tiến hành nhuộm Gus vào mô sẹo của mảnh lá mầm và thu được kết quả ở bảng 8 như sau:
Bảng 8. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhộm Gus của mảnh lá mầm giống sắn KM 94
OD660nm Nồng độ kanamycin (mg/l) 0,2 0,5 0,8 Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Số lƣợng Tỉ lệ (%) Lây nhiễm ngay 15,00±1,46 71,43±1,15 20,00±1,54 86,95±1,56 18,00±1,34 78,26±1,57 50 12,00±0,74 70,58±1,94 16,00±1,09 80,00±1,00 15,00±1,32 71,43±1,64 100 7,00±0,23 58,33±1,35 5,00±0,76 41,67±0,89 6,00±0.78 54,55±0,67 150 Cảm ứng trƣớc 2 ngày 18,00±1,22 78,26±1,67 23,00±1,26 88,89±1,54 21,00±1,33 80,77±1,54 50 13,00±0,78 68,42±1,33 15,00±1,13 75,00±1,28 17,00±1,10 77,27±1,33 100 4,00±0,12 36,36±0,68 4,00±0,24 36,36±0,47 5,00±0,14 38,46±0,54 150
Từ kết quả bảng 8, cho thấy:
Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus khi OD660nm = 0,2: Ở nồng độ chọc lọc kanamycin 50mg/l tỉ lệ này là cao nhất bằng 71,43% (lây nhiễm ngay) và 78,26% (khi cảm ứng trước 2 ngày). Khi tăng nồng độ kanamycin lên 100; 150mg/l thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus giảm còn 36,36% (cảm ứng 2 ngày) và 58,33% (lây nhiễm ngay).
Ở OD660nm = 0,5 và 0,8 tỉ lệ mẫu bắt màu cao hơn so với OD660nm = 0,2.
Cụ thể ở OD660nm = 0,5, nồng độ kanamycin 50mg/l thì tỉ lệ bắt màu là 88,89% (cảm ứng 2 ngày) còn OD660nm = 0,2 chỉ 78,26% (cảm ứng trước 2 ngày). Khi tăng nồng độ kanamycin, tỉ lệ bắt màu giảm đáng kể và thấp nhất là 36,36 % khi
OD660nm = 0,5 và 38,46% khi OD660nm = 0,8 ở nồng độ kanamycin là 150mg/l.
Như vậy: Mật độ khuẩn (OD660nm) và nồng độ chọn lọc kanamycin ảnh hưởng rõ rệt đến tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus của mẫu. Mật độ khuẩn (OD660nm) càng cao, nồng độ chọn lọc kanamycin càng thấp trong thí nghiệm này thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus của mẫu càng cao. Khi tiến hành lây nhiễm ngay thì tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus thấp hơn khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày mới lây nhiễm. Vì vậy, khi cho mẫu cảm ứng trước 2 ngày sau đó mới tiến hành biến nạp với mật độ khuẩn là 0,8 và nồng độ chọn lọc kanamycin 50mg/l là thích hợp nhất đến khả năng bắt màu nhuộm Gus của mảnh lá mầm.
4. Quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
Với kết quả nghiên cứu như trên, chúng tôi tạm thời đưa ra quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens như sau:
Bƣớc 1: Chọn vật liệu chuyển gen là lá mầm giống sắn KM 94.
Cắt mảnh lá mầm có S=2×2mm.
Bƣớc 2: Cảm ứng trƣớc 2 ngày sau mới lây nhiễm
Đặt mảnh lá mầm có S=2×2mm lên môi trường cảm ứng MS có bổ sung picloram 12mg/l và VTM C 1ml/l và VTM mix 1ml/l trong 2 ngày.
Sau 2 ngày tiến hành lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
mang vector chứa gen Gus có mật độ quang của dung dịch khuẩn OD660nm là 0,8 trong thời gian 30 phút.
Bƣớc 3: Đồng nuôi cấy trong 2 ngày
Sau 30 phút biến nạp gắp mảnh lá mầm và thấm khô bằng giấp thấm. Sau đó đặt mảnh lá mầm lên môi trường đồng nuôi cấy (MS đặc bổ sung picloram 12mg/l và AS 200mg/l) và để tối trong 2 ngày.
Bƣớc 4: Rửa khuẩn
Sau khi đồng nuôi cấy trong 2 ngày tiến hành rửa khuẩn bằng dung dịch MS lỏng có bổ sung cefotaxim với nồng độ 500mg/l.
Bƣớc 5: Chọn lọc và tái sinh
Sau khi rửa khuẩn xong, thấm khô mảnh lá mầm bằng giấy thấm và đặt lên môi trường chọn lọc (MS đặc bổ sung picloram 12mg/l, cefotaxim 500mg/l và kanamycin có nồng độ là 50mg/l.)
Dán kín và đặt ra ngoài ánh sáng (thời gian chiếu sáng là 12h/ngày) và nhiệt độ thích hợp (28 – 29o
C).
Sau thời gian từ 4 – 8 tuần, mẫu tạo mô sẹo và xuất hiện phôi soma sơ cấp. Sau đó chuyển mẫu chứa phôi soma sơ cấp sang môi trường MS bổ sung BAP 3mg/l và AgNO3 3mg/l.
Sau một thời gian, phôi soma sơ cấp lớn lên và chuyển sang giai đoạn lá mầm. Tiến hành tách lá mầm và tái sinh trên môi trường MS đặc bổ sung picloram 12mg/l và vitamin C 1ml/l, vitamin mix 1ml/l.
Bƣớc 6: Tạo cây hoàn chỉnh và phân tích sự có mặt của gen
Sau đó lá mầm phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Xác định sự có mặt của gen Gus trong cây bằng phương pháp nhuộm mô hóa tế bào.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau: Khi tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV 58 vào mảnh lá mầm (cảm ứng trước 2 ngày) có OD660nm = 0,8 và nồng độ chọc lọc kanamycin là 50mg/l thì tỉ lệ mảnh lá mầm tạo mô sẹo cũng như tỉ lệ bắt màu nhuộm Gus cao :Trong đó tỉ lệ tạo mô sẹo là 86,67% và tỉ lệ có mặt gen
Gus là 88,89%.
Đã xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
2. Kiến nghị
Tiếp tục hoàn thiện hệ thống nuôi cấy, tái sinh cây và đánh giá hoạt động của gen Gus vào các giống sắn.
Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen mong muốn để cải tiến các giống sắn có chất lượng cao và khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008).
Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì bằng phương pháp bắn gen. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, 1(11), ĐHQG TP.HCM, tr: 90-95.
2. Lê Trần Bình (1997). Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến cây trồng. Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp.
3. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006). Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật). Nxb ĐH Huế.
4. Đỗ Xuân Đồng, Đỗ Hải Lan, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2012). Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây sắn (Manihot esculenta Crantz) qua phôi soma từ đỉnh chồi. Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 3.
5. Bùi Thúy Hiền (2010). Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen Gus vào giống đậu tương ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Khóa luận tốt nghiệp đại học. Trường Đại học khoa học Tự nhiên, Hà Nội.
6. Trần Thị Cúc Hòa (2008). Tối ưu hóa quá trình chuyển gen đậu tương bằng cải tiến phương pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 1, tr: 14-19.
7. Nguyễn Thị Phương Nam và cộng sự (2007). Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây ngô và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo protein giàu sắt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
8. Nguyễn Thị Thanh Nga, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2010). Nghiên cứu quy trình tái sinh cây in vitro cây dưa hấu (Citruluss lanatus Thumb).Tạp chí công nghệ sinh học, 8(3B):1353-1358.
9. Trần Ngọc Ngoạn (2007). Giáo trình cây sắn. Nxb Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên.
10. Đỗ Tiến Phát (2009). Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiệm khả năng chuyển gen Gus vào cây thông nhựa (Pinus merkussi Jungh & De Vries). Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
11. Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Xuân Tài, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2005).
Chuyển gen Gus vào cây bông thông qua Agrobacterium tumefaciens. Hội Nghị Khoa học Toàn Quốc 2005 Công nghệ Sinh học trong nghiên cứu cơ bản, Hà Nội. 12. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thu (2007). Chuyển gen Gus vào đỉnh phôi hạt chín giống đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium tumefacien. Tạp chí Công nghệ sinh học, 5(4), tr: 471-478.
13. Nguyễn Đức Thành (2003). Chuyển gen thực vật. Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
Tiếng nƣớc ngoài
14. C.J.J.M. Raemakers, E. Sofiari, E. Jacobsen & R.G.F. Visser (1997). Regeneration and transformation of cassava. Euphytica 96: 153–161.
15. Dimuth Siritunga, Richard T. Sayre (2003) Generation of cyanogen-free transgenic cassava. Planta 217: 367–373.
16. Dimuth Siritunga, Diana Arias-Garzon, Wanda White, and Richard T. Sayre (2004). Over-expression of hydroxynitrile lyase in transgenic cassava roots accelerates cyanogenesis and food detoxification. Plant Biotechnology Journal. 17. J. Groll, D.J. Mycock, V.M. Gray & S. Laminski (2001). Secondary somatic embryogenesis of cassava on picloram supplemented media. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 65:201–210.
18. Guohua Ma & Qiusheng Xu (2002). Induction of somatic embryogenesis and adventitious shoots from immature leaves of cassava. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70:281–288.
19. Hankoua B. B, S.Y.C. Ng, I. Fawole, J. Puonti-Kaerlas, M. Pillay & A.G.O.Dixon (2005). Regeneration of a wide range of African cassava genotypes via shoot organogenesis from cotyledons of maturing somatic
embryos and conformity of the field-established regenerants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 82( 2), pp 221-231.
20. Hankoua B.B, N.J.Taylor, S.Y.C. Ng, I. Fawole, J. Puonti-Kaerlas, C. Padmanabhan, J.S.Yadav, C.M.Fauquet, A.G.O.Dixon, V.N. Fondong (2006). Production of the first transgenic cassava in Africa via direct shoot organogenesis from friable embryogenic calli and germination of maturing somatic embryos. African Journal of Biotechnology, 5 (19), pp. 1700-1712.
21. N. K. Konan, C. Schiipke, R. C~ircamo, R. N. Beachy, C. Fauquet (1997).
An efficient mass propagation system for cassava (Manihot esculenta Crantz) based on nodal explants and axillary bud-derived meristems. Plant Cell Reports.
22. N. K. Konan • C. Sch6pke • R. C4rcamo - R. N. Beachy. C. Fauquet. Division of Plant Biology-BCC206. International Laboratory for Tropical
Agricultural Biotechnology (ILTAB/ORSTOM-TSRI).
23. Nigel J. Taylor, Munyaradzi V. Masona , Rosa Carcamo, Thao Ho, Christian Schöpke & Claude M. Fauquet (2001). Production of embryogenic tissues and regeneration of transgenic plants in cassava (Manihot esculenta Crantz).
Euphytica 120:25–34.
24. Nigel Taylor, Paul Chavarriaga, Krit Raemakers, Dimuth Siritunga and Peng Zhang (2004). Development and application of transgenic technologies in cassava. Plant Molecular Biology 56: 671–688.
25. Peng Zhang, Salak Phansiri & Johanna Puonti-Kaerlas (2001). Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitrate in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67: 47–54.
26. R. Sarria, E. Torres, F. Angel, P. Chavarriaga, W.M. Roca (2000). Transgenic plants of cassava (Manihot esculenta) with resistance to Basta obtained by Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Reports
19:339–344.
27. Tessy Joseph, Hock-Hin Yeoh & Chiang-Shiong Loh (2001). Linamarin content and genetic stability of cassava plants derived by somatic embryogenesis. Euphytica 120:7–13.