Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm Codonopsis sp) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

LỜI MỞ ĐẦUSâm dây hay còn gọi là Đảng Sâm, là loài dây leo thảo, sống nhiều năm. Theo sách đỏ Việt Nam thì đẳng sâm là nguồn gen quý và là cây thuốc quý, được sử dụng phổ biến trong y học dân tộc. Sâm dây có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể; có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của Đảng sâm là rễ. Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt chất có trong Đảng Sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn. Về công dụng, Đảng sâm được dùng thay thế cho nhân sâm trong các bệnh thiếu máu, da vàng, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có anbumin, hợp chân phù đau; dùng làm thuốc bổ dạ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu.Do có giá trị dược lý và kinh tế nên hiện nay người dân đang tập trung khai thác rễ cây sâm dây trong rừng một cách triệt để; làm cạn kiệt và giảm khả năng tái sinh nguồn cây trong tự nhiên.Vì vậy để bảo vệ nguồn cây dược liệu mang tính đặc hữu của các vùng cần có các hướng nghiên cứu bảo tồn, nhân giống, phát triển nguồn cây dược liệu này. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn A.rhizogenes và tế bào vật chủ. Đặc biệt rễ tơ là có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Vì vậy, việc chuyển từ trồng cả cây sang chỉ nuôi cấy rễ tơ để thu các hợp chất thứ cấp quan trọng được nghiên cứu phát triển rất nhanh do tiềm năng to lớn trong ngành công nghiệp dược. Ứng dụng công nghệ nuôi rễ tơ sẽ góp phần tạo nguồn dược liệu quý phục vụ sức khỏe cộng đồng và đóng góp cho công tác bảo tồn các cây dược liệu quý của Việt Nam. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm Codonopsis sp.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” với nội dung bao gồm:1) Xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro cây sâm dây2) Xây dựng qui trình chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes3) Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen.=========================MỤC LỤCLỜI MỞ ĐẦU 1Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31.1.Giới thiệu về cây sâm dây. 31.1.1.Phân loại 31.1.2.Đặc điểm hình thái 31.1.3.Giá trị dược liệu. 41.1.4.Tình hình nghiên cứu về sâm dây. 61.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 71.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 71.2.2. Sự phát sinh hình thái thực vật. 81.3. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào tế bào thực vật thông qua Agrobacterium rhizogenes 131.3.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen. 131.3.2. Rễ tơ. 18Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 232.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm . 232.1.1. Thời gian. 232.1.2. Địa điểm . 232.2. Vật liệu. 232.2.1. Nguồn mẫu. 232.2.2. Trang thiết bị thí nghiệm . 232.2.3. Môi trường. 242.2.4. Điều kiện nuôi cấy. 242.3. Nội dung thí nghiệm . 242.3.1. Tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen. 242.3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ cây sâm dây 272.4. Phương pháp nghiên cứu. 282.4.1. Cách bố trí thí nghiệm . 282.4.2. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hiện hành. 282.4.3. Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 292.5. Các chỉ tiêu theo dõi 302.6. Phương pháp xử lý số liệu. 31Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 323.1. Tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen. 323.1.1. Thí nghiệm A1: Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tạo chồi của cây sâm dây 323.1.2. Thí nghiệm A2: Ảnh hưởng của 2,4D và TDZ đến khả năng tạo mô sẹo. 343.1.3. Thí nghiệm A3: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ. 373.1.4. Ra cây và chăm sóc cây. 393.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây sâm dây. 403.2.1. Thí nghiệm B1: Ảnh hưởng của các loại nguyên liệu đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ. 403.2.2. Thí nghiệm B2: Ảnh hưởng của mật độ khuẩn OD đến khả năng tạo rễ tơ. 443.2.3. Thí nghiệm B3: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ 45Chương 4 : KẾT LUẬN 474.1. Kết luận :. 474.2. Đề nghị 47TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ……………………. KHOA HOÁ BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên : Trần Thị Lệ Lớp : 08SH Ngành : Công nghệ sinh học Khoá : 2008 – 2013 1. TÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo rễ tơ cây sâm dây (Đảng sâm- Condonopsis sp) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. 2. NỘI DUNG CÁC PHẦN CỦA ĐỒ ÁN Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Lời mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo 3. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Họ và tên cán bộ hướng dẫn: TS.Phạm Bích Ngọc 4. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 12/12/2013 5. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 28/05/2013 Thông qua bộ môn: Ngày … tháng … năm 2013 TỔ TRƯỞNG BỘ MÔN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) TS. Đặng Đức Long TS. Phạm Bích Ngọc CÁN BỘ PHẢN BIỆN SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Trần Thị Lệ KẾT QUẢ ĐIỂM ĐÁNH GIÁ:…………… Ngày…….tháng… . 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký và ghi rõ họ tên) Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc LỜI CẢM ƠN Sau 6 tháng thực tập tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, được sự giúp đỡ và chỉ dạy tận tình của các thấy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô trong khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng trong suốt năm năm qua đã nhiệt tình giảng dạy và trang bị cho em rất nhiều kiến thức. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới TS.Phạm Bích Ngọc và TS.Nguyễn Thị Thúy Hường đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo em để em có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS.Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công Nghệ Sinh học _ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực tập. Cuối cùng em xin cảm ơn sự quan tâm, động viên của gia đình, toàn thể bạn bè luôn khuyến khích giúp đỡ em. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Trần Thị Lệ SVTH: Trần Thị Lệ 3 08SH Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc MỤC LỤC Trang DANH MỤC HÌNH Trang DANH MỤC BẢNG Trang SVTH: Trần Thị Lệ 4 08SH Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc SVTH: Trần Thị Lệ 5 08SH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT SVTH: Trần Thị Lệ 6 08SH 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid A.rizogenes : Agrobacterium rhizogenes BAP : 6-Benzylaminopurine IBA : Indole-3-butyric MS : Murashige và Skoog, 1962 NAA : Naphthalence acid Ri plasmid : Root induction plasmid Rol : Root locus Sp : Species Ss T-DNA : Single strain T-DNA TDZ : Thidiazuron UV : Ultra violet (tia cực tím) YMB : Yeast Manitol Broth SVTH: Trần Thị Lệ 7 08SH LỜI MỞ ĐẦU Sâm dây hay còn gọi là Đảng Sâm, là loài dây leo thảo, sống nhiều năm. Theo sách đỏ Việt Nam thì đẳng sâm là nguồn gen quý và là cây thuốc quý, được sử dụng phổ biến trong y học dân tộc. Sâm dây có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể; có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của Đảng sâm là rễ. Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt chất có trong Đảng Sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn. Về công dụng, Đảng sâm được dùng thay thế cho nhân sâm trong các bệnh thiếu máu, da vàng, bệnh bạch huyết, viêm thượng thận, nước tiểu có anbumin, hợp chân phù đau; dùng làm thuốc bổ dạ dày, chữa ho, tiêu đờm, lợi tiểu. Do có giá trị dược lý và kinh tế nên hiện nay người dân đang tập trung khai thác rễ cây sâm dây trong rừng một cách triệt để; làm cạn kiệt và giảm khả năng tái sinh nguồn cây trong tự nhiên. Vì vậy để bảo vệ nguồn cây dược liệu mang tính đặc hữu của các vùng cần có các hướng nghiên cứu bảo tồn, nhân giống, phát triển nguồn cây dược liệu này. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra bởi quá trình tương tác giữa vi khuẩn A.rhizogenes và tế bào vật chủ. Đặc biệt rễ tơ là có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Vì vậy, việc chuyển từ trồng cả cây sang chỉ nuôi cấy rễ tơ để thu các hợp chất thứ cấp quan trọng được nghiên cứu phát triển rất nhanh do tiềm năng to lớn trong ngành công nghiệp dược. Ứng dụng công nghệ nuôi rễ tơ sẽ góp phần tạo nguồn dược liệu quý phục vụ sức khỏe cộng đồng và đóng góp cho công tác bảo tồn các cây dược liệu quý của Việt Nam. SVTH: Trần Thị Lệ 8 08SH Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây sâm dây (Đảng Sâm - Codonopsis sp.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” với nội dung bao gồm: 1) Xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro cây sâm dây 2) Xây dựng qui trình chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 3) Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen. SVTH: Trần Thị Lệ 9 08SH Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây sâm dây Cây sâm dây hay còn gọi là cây Đảng Sâm. Cây Đảng Sâm là một loài dây leo, củ dùng làm thuốc bổ. Tại Kontum, dân địa phương thường gọi là cây “ Hồng đảng sâm”. Cây còn có nhiều tên khác như “cây đùi gà”, “mằn ráy cáy” (dân tộc Tày), “co nha đòi” (Thái), “ canh ho” (H’Mông). Trong Đông y, vị thuốc đảng sâm được khai thác từ nhiều loài khác nhau, cùng thuộc chi Codonopsis- thuộc họ hoa chuông (Campanulaceae). Tại Việt Nam thường gặp loài có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook. Loài này phân bố ở độ cao 900-2200m, có ở hầu hết các tỉnh miền núi. Tập trung nhất ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang…ở phía Nam, có ở núi Ngọc Linh và vùng Đà Lạt. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc tương đối tập trung ở các vùng nương rẫy cũ, ven rừng, nhất là loại hình rừng núi đá vôi sau khi đã bị khai phá để lấy đất canh tác [ 25]. 1.1.1. Phân loại Giới : Plantae Phân giới : Tracheobionta Nhóm lớn : Spermatophyta Nhóm : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Phân lớp : Asteridae Bộ : Campanulales Họ : Campanulaceae Giống :Codonopsis Wall. Loài : Codonopsis sp Hình 1.1. Cây sâm dây 1.1.2. Đặc điểm hình thái Sâm dây là một loại cây thảo sống lâu năm. Mọc bò hay leo bằng thân quấn, phân nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn. Toàn cây có nhựa mủ SVTH: Trần Thị Lệ 10 08SH [...]... các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp đã công bố đều sử dụng vector trung gian là vi khuẩn Agrobacterium 1.3.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen 1.3.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Hình 0.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium rhizogenes (tên cũ Phytomonas rhizogenes) được định danh lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm Vi khuẩn A .rhizogenes. .. A .rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở thực vật: hội chứng tạo rễ tơ hay bệnh rễ nhày A .rhizogenes là vi khuẩn đất hình que, gram âm, thuộc chi Agrobacterium Vi khuẩn đất gram âm A .rhizogenes, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm Giống như vi khuẩn A.tumefaciens mang Ti-Plasmid, A .rhizogenes mang Ri (rootinducing) plasmid và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị... của cây sâm dây 2.3.2.2 Thí nghiệm B2: Ảnh hưởng của mật độ OD đến khả năng tạo rễ tơ SVTH: Trần Thị Lệ 33 08SH Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bởi giá trị quang phổ OD ở bước sóng 600 nm của dịch lỏng vi khuẩn, thông qua đó xác định được số lượng tế bào trong một thể tích nhất định Trong các thí nghiệm về chuyển gen, mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của quá trình chuyển gen Ở. .. nghệ tế bào thực vật _Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam 2.2 Vật liệu 2.2.1 Nguồn mẫu Nguồn mẫu ban đầu là cây sâm dây in vitro và vi khuẩn A .rhizogenes chủng TR105 tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật _Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam b a Hình 0.5 Nguồn mẫu: a) Cây Sâm dây in vitro; b) Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes TR105 2.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm Cân kỹ thuật,... (mg/l) 0 0 0 0,5 0,5 08SH C6 1 0,5 2.3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ cây sâm dây Để thành công cho vi c chyển gen tạo rễ tơ ở một số loài thực vật thì phải xét một số điều kiện cần thiết như : các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, mẫu cấy thích hợp, loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm và loại môi trường nuôi cấy phù hợp Hầu hết... cuống lá, lá mầm, củ, rễ đều có thể sử dụng để tạo rễ tơ [17 ] Tuy nhiên đối với các loài khác nhau vật liệu thích hợp để chuyển gen tạo rễ tơ, và độ tuổi vật liệu là khác nhau Để tạo ra rễ tơ ta thực hiện lây nhiễm mẫu nguyên liệu đã tạo vết thương với vi khuẩn A .rhizogenes, hoặc tiêm trực tiếp vi khuẩn vào nguyên liệu, đồng nuôi cấy trong 2 ngày Sau 2 ngày các mẫu cấy được chuyển qua môi trường có chứa... đảng sâm Vi t Nam” của Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh và Nguyễn Mạnh Tuyển; được đăng trên tạp chí dược liệu, tập 7 số 1/2002 Đây là nghiên cứu lần đầu tiên công bố các thành phần hóa học của cây đảng sâm Vi t Nam Bằng một số phương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm sống và cao sâm, nhóm tác giả đã nhận thấy đặc điểm thực vật của cây sâm dây mọc ở sapa; các thành phần có trong rễ sâm dây. .. chủ Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A .rhizogenes sang tế bào cây chủ được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F, trong đó virC và virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp Các gen này có vai trò quan trọng trong vi c nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học acetosyringone(AS) Tín hiệu hoá học được nhận biết đầu tiên bởi virA Gen virA sẽ tổng hợp nên một loại... toàn cây chữa tiểu đường dạng 2 Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu [27] 1.1.4 Tình hình nghiên cứu về sâm dây Các nghiên cứu trong nước SVTH: Trần Thị Lệ 12 08SH Trong nước, các nghiên cứu trên cây sâm dây chủ yếu là về phân tích thành phần hóa học và các tác dụng dược lý của vị thuốc quý này Năm 2002, công trình “Bước đầu nghiên cứu. .. trưởng hoặc chúng có thể là hệ thống tổ chức mới Sự hình thành rễ bất định gồm ít nhất là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi: giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hay chu luân và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ này Rễ bất định thường được khởi sinh ở vùng lân cận của các mô mạch dẫn đang phân hóa của cơ quan đã tạo ra chúng Nếu cơ quan này còn non, sơ khởi . nhiều để làm thuốc. Trong các loài sâm thường chứa các hoạt chất như: terpen, acid amin, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid và hợp chất saponin. Thành phần saponin, được hiểu. Hoạt chất có trong đảng sâm việt nam Stt Nhóm chất Kết quả stt Nhóm chất Kết quả 1 Đường khử + 6 Glycosid - SVTH: Trần Thị Lệ 11 08SH 2 Chất béo + 7 Flavonoid - 3 Acid amin + 8 Tanin - 4 Saponin. nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (tranfer DNA) từ Ri- plasmid vào