NGHIÊN cứu tạo RA các GIỐNG cây CHỊU hạn

NGHIÊN CỨU TẠO RA CÁC GIỐNG CÂY CHỊU HẠN I Đặt vấn đề Hạn yếu tố môi trường gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm suất, sản lượng trồng dẫn tới tình trạng an ninh lương thực Đặc biệt, bối cảnh biến đổi khí hậu tồn cầu, tình trạng hạn hán xảy ngày thường xuyên hơn, với mức độ ngày trầm trọng, nhiều lúc vượt tầm kiểm sốt người Chính vậy, việc nghiên cứu gen liên quan tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống trồng biến đổi gen có khả chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng việc trì tăng sản lượng nơng nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Hạn thực vật khái niệm dùng để trạng thái thiếu nước mơi trường gây nên suốt q trình sống hay giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển thực vật Môi trường khô hạn gây hàng loạt tác động tiêu cực tới thực vật tất cấp độ, từ hình thái tới phân tử tất giai đoạn phát triển Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật khởi động chế phòng vệ chống lại thiếu hụt nước, sau loạt chế cấp độ khác Đáp ứng chống chịu stress hạn thực vật thực thông qua chuỗi trình phức tạp với tham gia hàng loạt yếu tố chia thành giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu II Nội dung 1.Tổng quát 1.1 loại hạn - khái niệm : hạn tượng xảy thiếu nước =>lượng nước hút vào không bù đắp lượng nước bay =>cây cân nước bị héo - có dạng hạn :hạn đất , hạn khơng khí , hạn sinh lí a) Hạn đất :lượng nước dự trữ cho hấp thụ đất bị cạn kiệt =>không đủ nước ,mất cân nước b) Hạn không khí : độ ẩm khơng khí q thấp => thoát nước mạnh =>mất cân c) Hạn sinh lí : trạng thái sinh lí không cho phép hút nước dù môi trường không thiếu nước => cân Tác hại hạn - hệ thống keo nguyên sinh chất bị biến đổi mạnh : + thay đổi tính chất lý hóa chất ngun sinh : tăng độ nhớt chất nguyên sinh => chậm hoạt động sống ,giảm mức độ phân tán … + thay đổi đặc tính hóa keo : từ trạng thái sol => trạng thái coaxecva => trạng thái gel - Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước bị đảo lộn : từ hoạt động tổng hợp đủ nước => phân giải thiếu nước Hoạt động sinh lí bị kìm hãm : ức chế quang hợp khí khổng đóng =>thiếu CO2 , diệp lục bị phân hủy , ức chế tổng hợp diệp lục … - + thiếu nước lúc đầu tăng hô hấp vô hiệu => sau giảm hô hấp nhanh => hiệu sử dụng lượng thấp sinh nhiệt + làm cân nước : lượng nước thoát > lượng nước hấp thu vào => bị héo + dòng vận chuyển vật chất bị ức chế mạnh: tốc độ thoát nước giảm => hút chất khoáng giảm - Quá trình sinh trưởng phát triển bị kìm hãm + ức chế sinh trưởng : thiếu nước đỉnh sinh trưởng khơng phân chia => q trình dãn tế bào bị ức chế =>sinh trưởng chậm + ức chế hoa kết : thiếu nước ảnh hưởng đến phân hóa hoa =>đặc biệt la thụ tinh Bản chất thích nghi chống chịu khô hạn a) tránh hạn (trốn hạn) :những sống xa mạc khơ hạn ,có thời gian mưa ngắn năm - Giảm khả nước : + đóng khí khổng để giảm nước gặp hạn + thường có tầng cutin dày để giảm lượng nước bay qua cutin + giảm hấp thu lượng ánh sáng mặt trời cách vận động theo hướng song song với tia sáng + giảm diện tích để giảm bề mặt bay nước - Duy trì khả hấp thu nước : + có hệ rễ phát triển mạnh phân bố sâu xuống mạch nước ngầm để lấy nước + số lượng đường kính mạch dẫn tăng lên => tăng khả vận chuyển nước + tăng áp suất thẩm thấu sức hút nước mô khả điều chỉnh thẩm thấu thực vật : muối kali, acid hữu cơ, đường… - Duy trì tính ngun vẹn cấu trúc chức sinh lí tế bào + chất nguyên sinh tế bào giữ nguyên vẹn mà không bị thương tổn cấu trúc chức + độ nhớt tính đàn hồi trì mức cao - Các hoạt động trao đổi chất sinh lí trì mà khơng bị đảo lộn gặp hạn : suất giảm nhiều hay tùy mức độ hạn khả chống chịu Các cách tạo giống chịu hạn 2.1-Tạo chịu hạn công nghệ chuyển gen -Biến nạp gen( chuyển gen/ kỹ thuật di truyền ) thực vật khái niệm dùng mơ tả q trình chuyển số gen ngoại lai vào tế bào thực vật nhằm tạo tính trạng mối mà trước thể thực vật khơng có * Các bước phát triển trồng biến đổi gene 1.Sau xác định gene quan tâm( gene chịu hạn ) ta tiến hành phân lập gene quan tâm (Isolation of the gene(s) of interest) 2.Gắn gen cần chuyển vào vector chuyển gene (Insertion of the gene(s) into a transfer vector) : Đối tượng thường sử dụng để chuyển gene phân tử DNA vòng tròn (plasmid) từ vi khuẩn đất tựnhiên, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Gen (s) quan tâm xen vào plamid việc sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp (rDNA) 3.Biến nạp vào mô tế bào thực vật: Vi khuẩn A tumefaciens biến đổi chứa plasmid mang gen cần chuyển trộn lẫn với tế bào thực vật Một số tế bào tiếp nhận phần plasmid gọi T- DNA (transferred-DNA) A tumefacienschèn gene mong muốn vào nhiễm sắc thể tế bào thực vật tạo thành dạng tế bào GM (genetically modified) – tế bào bị biến đổi mặt vật chất di truyền Các phương pháp khác sử dụng để chuyển DNA bắn gen vi đạn (bombardement/gene gun) Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc: Sau biến nạp , có phương pháp khác sử dụng để phân biệt tế bào tích hợp gene tế bào khơng tích hợp gen mong muốn Thơng thường, gen marker chọn lọc có đặc tính kháng kháng sinh thuốcdiệt cỏ sử dụng để ưu tiên cho phát triển tế bào biến đổi tương đối so với tế bào không biến đổi Đối với phương pháp này, gen chịu trách nhiệm kháng chèn vào vector chuyển giao với gen (s) trao đặc điểm mong muốn vào tế bào thực vật Khi tế bào tiếp xúc với kháng sinh thuốc diệt cỏ, có tế bào tích hợp gene mong muốn (chứa thể gen đánh dấu lựa chọn) tồn Tái sinh biến nạp: thơng qua ni cấy mơ Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) 7.Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Có nhiều thành tựu thê giới Việt Nam tạo chịu hạn nhờ công nghệ gene Dưới ví dụ thực tế tiến hành Việt Nam giúp ta hiểu rõ công nghệ Tên đề tài nghiên cứu : Nghiên cứu chuyển gen nâng cao tính chịu hạn vào số dòng ngơ bố mẹ áp dụng SX thực viện nghiên cứu Ngô Các gene chịu hạn phân lập từ nguồn tự nhiên Việt Nam Kết phân lập gene chịu hạn gồm DREB2A, HVA1 CspB DREB2A HVA1 gen có khả chịu hạn chịu mặn, CspB gen có khả chịu nóng, cải thiện khả thụ phấn ngô điều kiện nhiệt độ cao Đối với vật liệu nhận gen, q trình nghiên cứu gặp khó khăn lớn tỉ lệ tái sinh thông qua nuôi cấy phôi non ngơ thường thấp Tuy nhiên, qua q trình dày cơng chọn tạo thí nghiệm 1.300 dòng ngơ nước, Viện tìm dòng ngơ có khả tái sinh tốt thơng qua ni cấy phơi non, dòng có tỉ lệ tái sinh cao Đây dòng ngơ bố mẹ giống ngơ lai Viện Nghiên cứu Ngơ Sau có nguồn vật liệu gen cho xác định dòng ngơ có tỉ lệ tái sinh cao nhất, phơi non dòng thu hoạch sau thụ phấn 12 ngày, sau ni cấy mơi trường thêm ngày để tạo mô sẹo nhằm sử dụng làm mơ đích để lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium (các chủngAgrobacterium tái tổ hợp mang vector pCAMBIA1300 biểu thực vật chứa cấu trúc gen Act1+HVA1, Ubi+DREB2A 35S+modiCspB) Kết trình biến nạp gen chịu hạn vào vật liệu mô sẹo nhận gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho kết khả quan Cụ thể: Tỉ lệ mô tái sinh thành ngô thếhệ T0 gen ZmDREB2A đạt trung bình 12%; gen Gene HVA1 đạt trung bình 13,6% gen CspB đạt 10,7% Kiểm tra phương pháp PCR (giải trình tự gen) ngơ hệ T0 cho thấy kết bất ngờ tỉl ệ hệ T0 mang gen chịu hạn cao, đạt từ 70% đến xấp xỉ 80% Trong số hệ T0 mang gen chịu hạn, có từ – 7% số mang hữu thụ (tự thụ phấn thành công trưởng thành) Như tính trung bình, hệ số biến nạp gen chịu hạn hệ T0 đạt 0,67% (trung bình 1.000 mang gen chịu hạn, có 6,7 hữu thụ) Nguồn chuyển gen hệ T0 gieo trồng đánh giá thêm tính ổn định gen hệ T1, T2 T3 Kết cho thấy, gen cấy vào ngô hoạt động tốt ngày có tính ổn định Cụ thể hệ T1, tỉ lệ mang gen chuyển chịu hạn đạt trung bình từ 75-80%; đến hệ T2 T3, tỉ lệ nâng lên đạt trung bình từ 99,1% đến 99,7% Theo Viện nghiên cứu Ngô, tỉ lệ cho thấy ngô chuyển gen chịu hạn hệ thứ đạt độ ổn định theo yêu cầu tiêu chuẩn quốc tế nay.Viện Nghiên cứu Ngô tiến hành lai thử nghiệm 21 cặp lai có thành phần bố/mẹ mang gen chuyển Kết đánh giá 15 cặp giai đoạn sinh trưởng phát triển trước trỗ cho thấy có cặp có khác biệt so với đối chứng số tính trạng đặc trưng theo hướng tốt như: Chiều cao cao đối chứng; diện tích trước trỗ lớn đối chứng; thời gian sinh trưởng dự đốn sớm hơn; đường kính thân to đối chứng Đồng thời, khơng phát cặp có tính trạng xấu so với đối chứng Điều cho thấy, ngô chuyển gen không làm tính trạng ban đầu, mà khiến số tính trạng tốt -Một số ưu điểm hạn chế việc tạo công nghệ chuyển gene Ưu điểm : Tạo nhiều giống trồng mang đặc điểm tốt ( chịu mặn, chịu hạn, suất cao…) Giảm chi phí sản xuất Tăng lợi nhuận nơng nghiệp Cải thiện môi trường Nhược điểm: Tiềm ẩn mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hàng hoang dại Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen Hình ảnh: Figure 1: Regeneration of transgenic banana using tissue culture method Somatic embryos are embryos that originate in tissue culture in response to plant hormones added to the growth medium Source: National Agricultural Biotechnology Centre, Uganda Phơi soma phơi có nguồn gốc từ ni cấy mơ để đáp ứng với kích thích tố thực vật vào môi trường tăng trưởng Nguồn: Trung tâm Công nghệ sinh học nông nghiệp quốc gia, Uganda 2.2-Tạo giống chọn dòng tế bào xơma có biến dị LẠC Lạc (Arachis hypogaea L.) Giống lạc L18 đánh giá có khả chịu hạn kém.Mục tiêu cải thiện khả chịu hạn giống lạc L18 công nghệ tế bào thực vật.Giống lạc L18 chịu hạn sử dụng thí nghiệm tạo dòng lạc chịu hạn kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, đối chứng giống lạc L23 có khả chịu hạn tốt Tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc mơi trường MS có bổ sung 2,4D Chú thích:- Mơi trường giàu chất dinh dưỡng: mơi trường MS (Murashige – Skoog) Đây môi trường khởi đầu cho q trình ni cấy mơ đối tượng nuôi cấy Môi trường MS môi trường thích hợp với nhiều loại cây, giàu cân chất dinh dưỡng • - Tạo dòng mô sẹo chịu nước, tái sinh Xử lý mô sẹo hệ thống nuôi cấy in vitro giống lạc L18 thí nghiệm =>kết thu 167 dòng mơ 198 dòng Đánh giá khả chịu hạn dòng chọn lọc thơng qua đánh giá tiêu nông sinh học vào thời kỳ chín của; đánh giá khả chịu hạn giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn non thơng qua phân tích hoạt độ α- amylase, hàm lượng đường khử, tỷ lệ héo, phục hồi số chịu hạn tương đối ngày hạn khác LÚA: (I) Nuôi cấy tế bào 2n sử dụng tạo nhiều dòng tế bào việc tạo trồng có nhiều gen khác giống ban đầu.ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để cải thiện khả chịu hạn lúa mỳ Abdelsamad et al (2007) hay đời hai giống lúa DR1, DR2 có khả chịu hạn Việt Nam Tạo lai có tính ưu việt kỹ thuật protoplast Protoplast tế bào trần, thành tế bào cellulose bị tiêu hủy enzyme cellulase hay drilselase, màng sinh chất bao quanh Protoplast có khả dung hợp (fusion) với để tạo thành thể lai vơ tính tác dụng tác nhân hóa học hay vật lý để làm màng kết dính lại với gây chuyển vận đại phân tử DNA, protein, bào tử từ tế bào sang tế bào Dung hợp trình hợp protoplast lại làm Các tế bào thực vật có khả dung hợp dạng protoplast, protoplast dung hợp lại sinh hoàn chỉnh dấu hiệu tế bào hợp lại q trình lai vơ tính (somatic hybridization) Ngày nay, nhờ lai vơ tính mà người ta cải tạo nhanh chóng máy di truyền tế bào nhằm tạo giống có suất cao, kháng sâu bệnh, chịu hạn, lạnh, phèn, mặn, v.v Tạo đặc tính mong muốn qua việc đưa vật liệu di truyền vào tế bào trồng kỹ thuật tái tổ hợp DNA  Việc cải tiến đưa gene vào tế bào thực vật qua cách đưa vật liệu di truyền ngoại lai vào đường tái tổ hợp DNA mở nhiều triển vọng tốt đẹp *Chú thích: Protoplast tế bào có thành tế bào loại bỏ màng tế bào chất lớp tế bào Protoplast thu enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp (II) - - - 2.3- Một số phương pháp khác Giống ngô chịu khô hạn mexico khả chịu hạn giống ngô dựa chế tính loại đường có tên gọi trehalosa cho phép giữ nước tế bào thân Qua nghiên cứu nhà khoa học thấy tự nhiên có chất men trehalasa làm nhiệm vụ phân hủy chất đường trehalosa làm giảm khả chịu hạn ngô Trên sở này, nhóm nghiên cứu tiến hành đưa vào đồ gen ngô loại vi trùng, tên khoa học tumefaciens tồn thềm đất trồng lãnh thổ Mexico, làm nhiệm vụ vơ hiệu hóa hoạt động chất men trehalasa, bảo tồn lượng đường trehalosa, đồng nghĩa với việc tăng khả chịu hạn ngơ Điều đáng nói giống ngô lai tạo dạng biến đổi gen sinh trưởng điều kiện thời tiết nóng 40 độ C, phù hợp với điều kiện tự nhiên bang miền Tây Bắc Mexico Tạo giống chịu hạn phương pháp lai Tạo giống lúa mỳ chịu hạn, cao sản Các nhà khoa học thuộc Trung tâm cải tạo lúa mỳ bắp quốc tế (Mexico) vừa tạo giống lúa mỳ cho sản lượng cao 50% điều kiện khô hạn Để tạo giống lúa mỳ chịu hạn trên, trước tiên nhà nghiên cứu tạo giống lúa mỳ tổng hợp từ lúa mỳ emmer cỏ dê Sau đó, họ cho lúa mỳ tổng hợp lai với lúa mỳ bình thường Theo nhà lai giống lúa mỳ Richard Trethowan, giống lúa mỳ trơng xấu xí song lại mang gien quý Chúng tiếp tục sinh trưởng nơi khơ hạn nóng Tính trạng chịu hạn lấy từ cỏ dê Giống lúa CH207 Giống lúa CH207 chọn tạo từ tổ hợp lai Lúa nương Hà giang Nơng nghiệp 75-6 Phương pháp: Lai hữu tính, chọn lọc theo phương pháp phả hệ Đặc điểm - Thời gian sinh trưởng; Vụ xuân 160-165 ngày , vụ mùa 120-125 ngày - Giống CH207 có dạng hình cứng, gọn, đứng ngắn, màu xanh đậm - Chiều dài 22- 24 cm, số hạt/bông đạt 135-150, hạt to dài, tỷ lệ D/R= 2,9; khối lượng 1000 hạt 26 – 27, hàm lượng amylose 25,5%, hàm lượng protein 9,19%; cơm mềm, đậm, ngon - Năng suất ổn định 45,0 – 55,0 tạ/ha điều kiện bấp bênh nước Trong điều kiện chủ động nước cho suất 57,0 -65,0 tạ/ha - Giống lúa chịu hạn CH207 có khả chịu hạn khá, mức độ nhiễm sâu bệnh hại thấp hẳn so với giống đối chứng, chống đổ chịu rét tốt Giống lúa OM8901 -OM8901 thuộc giống lúa thuần, tạo chọn nhóm tác giả Nguyễn Thị Lang, Bùi Phước Tâm, Nguyễn Thị Nhiên Bùi Chí Bửu từ tổ hợp lai ban đầu OM1490/OM4495/OM4495, Nhằm khai thác đặc tính quý giống chọn làm mẹ tổ hợp lai OM1490 va giống chọn làm cha OM4495 đặc tính quý (tính trạng mục tiêu) cá thể cha, mẹ (khả chịu khô hạn, suất cao ổn định, chất lượng gạo tốt, tính chống chịu sâu bệnh…) mà quần thể lai có khả thừa hưởng, kiểm tra thông qua sử dụng công cụ marker phân tử Việc kiểm tra tính trạng mục tiêu thực quần thể lai gian đoạn BC1F2, nhằm giúp rút ngắn thời gian chọn lọc lai mang gene mục tiêu Marker sử dụng trình nghiên cứu, đánh giá, chọn lọc cá thể mang tính trạng mục tiêu quần thể lai marker MR 201 (để chọn lọc tính trạng chống chịu hạn phẩm chất) Ưu điểm Giống lúa OM8901 có ưu điểm giống đặc sản, ngắn ngày (90 - 105 ngày, tuỳ mùa vụ chế độ nước), đẻ nhánh khá, cứng cây, suất cao (vụ ĐX từ - tấn/ha; HT từ - /ha); dài, số hạt bơng cao (trung bình 80 - 90 hạt), nặng hạt trung bình (trọng lượng 1.000 từ 24 – 25g), hạt đóng khít (bơng chùm), số thu hoạch cao 53%, hạt gạo dài (7,1cm) cơm dẽo (hàm lượng amylose trung bình khoảng: 22,2 %), chất lượng gạo vụ Đông Xuân tốt, tỷ lệ gạo nguyên liệu (80,1%), gạo trắng (69,5%) gạo nguyên (55,6%) cao, hạt gạo sáng đẹp, không bạc bụng, hàm lượng protein cao (8,81%), giống sinh trưởng phù hợp nhiều vùng đất khác có khó khăn nước tưới Giống lúa OM8901 có khả chống chịu tốt với khơ hạn, kháng bệnh cháy bìa (cấp 3) Tạo giống phương pháp ghép cành Nhân giống cách ghép Ghép phương pháp đem cành hay mầm nhánh có nhiều ưu điểm phẩm chất tốt, suất cao… gắn sang gốc loại mẹ để tạo thành thể thống Ưu điểm: Cây sau ghép giữ đặc tính con, mau cho trái, tuổi thọ cao Nhân nhiều giống Sử dụng đặc tính tốt mẹ làm gốc ghép chịu hạn, chịu úng, chịu lạnh Ví dụ: -Qt gốc ghép cho qt Cây ghép có tán thấp, mau quả, suất cao, phẩm chất tốt, chịu lạnh, chịu hạn, chống bệnh thối gốc - Quýt hồng (Phúc Kiến) gốc ghép cho quýt Phúc Kiến, cam Phát triển khỏe chịu lạnh, chịu hạn, suất cao, chậm III Kết luận Bước đầu tìm phương pháp để tạo giống chịu hạn ưu điểm nhược điểm phương pháp Phương pháp tạo chịu hạn công nghệ chuyển gen cho thấy rõ ưu điểm vượt trội giúp ích cho nơng nghiệp mơi trường tiềm ẩn vài nguy hại Các phương pháp tạo chịu hạn công nghệ tế bào phương pháp khác ghép cành lai giống đem lại hiệu định đến nông nghiệp nhiên vài hạn chế Cần tìm hiểu nghiên cứu thêm phương pháp tạo giống chịu hạn để có đáp ứng tốt tính kinh tế thân thiện với mơi trường đảm bảo hệ sinh thái sau mà ko đem lại tác dụng phụ - - - - Tài liệu tham khảo -http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/process-of-developing -TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3): 357-362 357 Vũ Thị Thu Thủy* , Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu Trường (Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên) -http://khoahoc.vnhide.net/khampha/sinh-vat-hoc/thuc-vat/29294_mexico-lai-taothanh-cong-giong-ngo-chiu-kho-han.aspx -http://khoahoc.tv/khampha/sinh-vat-hoc/sinh-hoc/3346_tao-giong-lua-my-chiu-hancao-san.aspx http://cantho.gov.vn/wps/wcm/connect/sonnptnt/sub_site/sitemenu/khuyen+nong -+hoat+dong+kn-kn/trongtroy/kjrefkfsdjfjsdkfjsdjfksdfjlsdjfkls - ... hồi trì mức cao - Các hoạt động trao đổi chất sinh lí trì mà khơng bị đảo lộn gặp hạn : suất giảm nhiều hay tùy mức độ hạn khả chống chịu Các cách tạo giống chịu hạn 2.1 -Tạo chịu hạn công nghệ chuyển... Tạo giống lúa mỳ chịu hạn, cao sản Các nhà khoa học thuộc Trung tâm cải tạo lúa mỳ bắp quốc tế (Mexico) vừa tạo giống lúa mỳ cho sản lượng cao 50% điều kiện khô hạn Để tạo giống lúa mỳ chịu hạn. .. thực viện nghiên cứu Ngô Các gene chịu hạn phân lập từ nguồn tự nhiên Việt Nam Kết phân lập gene chịu hạn gồm DREB2A, HVA1 CspB DREB2A HVA1 gen có khả chịu hạn chịu mặn, CspB gen có khả chịu nóng,