Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro và bước đầu nhân nhanh cây xạ đen bằng phương pháp tạo đa chồi

Ý nghĩa lý luận và thực tiễn - Ý nghĩa lý luận: bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây Xạ đen - Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng trong nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

************

DƯƠNG THỊ MINH

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO

VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

************

DƯƠNG THỊ MINH

NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO

VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học

Th.S LA VIỆT HỒNG Th.S ONG XUÂN PHONG

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Th.S La Việt Hồng và Th.S Ong Xuân Phong đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên khích lệ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ đang công tác tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện, môi trường làm việc tốt nhất cho em thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài

Em xin cảm ơn tới toàn thể các thầy cô đang công tác tại khoa Sinh – KTNN, đó là những người đã cho em nguồn kiến thức vô cùng quý giá để em

có thể hoàn thành tốt đề tài

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn

Ngày 19 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện

Dương Thị Minh

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và xuất phát từ các

nghiên cứu thực nghiệm mà chúng em đã tiến hành trên đối tượng Xạ đen và

không trùng lặp với kết quả của tác giả khác

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 13

Hình 1.2 Quả cây Xạ đen 13

Hình 3.1 Các bước tạo vật liệu vô trùng in vitro cây Xạ đen 23

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu quả khử trùng của chất khử trùng 25

Hình 3.3 Mẫu vô trùng sốngphát sinh chồi 27

Hình 3.4 Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) 27

Hình 3.5 Khối mô sẹo sau 7 ngàytheo dõi 28

Hình 3.6 Khối mô sẹo sau 15 ngàytheo dõi 28

Hình 3.7 Chồi mới tạo ra và sinh trưởng mạnh 30

Hình 3.8 Chồi mới không phát triển 30

Hình 3.9 Không tạo chồi mới 31

Hình 3.10 Chồi mới tạo ra chậm phát triển 31

Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện hệ số nhân chồi ở các môi trường của cây Xạ đen 31

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và thời gian

xử lý mẫu 9

Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 17

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro 19

Bảng 3.1 Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy 24

Bảng 3.2 Thời gian hình thành mô sẹo trên môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ BAP khác nhau 27

Bảng 3.3 Số chồi tạo thành, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi của mẫu cấy trong các môi trường MS có bổ sung nồng độ BAP khác nhau 29

Bảng 3.4 Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh tái sinh in vitro 32

Bảng 3.5 Nồng độ và hàm lượng diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb) và diệp lục tổng số (Ca + b), carotenoit tổng số (Cx+c) 32

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG………3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nhân giống cây trồng in vitro 3

1.1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) 3

1.1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

1.1.3 Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro 6

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô 8

1.2 Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 12

1.2.1 Vị trí phân loại 12

1.2.2 Đặc điểm sinh học 13

1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.2.4 Công dụng 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 16

2.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 16

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 16

2.2.3 Điều kiện nuôi cấy 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp khử trùng mẫu sơ bộ 17

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 17

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 22

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây

Xạ đen 27

3.2.1 Sự hình thành mô sẹo (callus) 27

3.2.2 Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi mới in vitro 29

3.3 Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh tái sinh in vitro 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC……… 37

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ… 38

Hiện nay cây Xạ đen là loại cây nhỏ được trồng phổ biến ở các tỉnh như Sơn La, Hoà Bình, Hà Nam, Quảng Bình Xạ đen được dùng trong y dược học cổ truyền Việt Nam để chữa các bệnh như viêm dạ dày, ung nhọt, trị khối

u, ung thư, chống oxi hoá [12]

Tỷ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng tăng cao Hiện trên thế giới mỗi năm có khoảng 12 triệu người được phát hiện mắc ung thư Việt Nam cũng là quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh này thuộc loại cao Thông tin này được đưa ra trong buổi phát động chiến dịch mang tên ”Ung thư cũng có thể ngăn ngừa” nhân ngày Ung thư thế giới (4/2), do Hiệp hội phòng chống ung thư thế giới (UICC) tổ chức Theo thống kê của Bộ Y tế, năm 2006 tại Việt Nam đã có hơn 77.280 ca ung thư ác tính được phát hiện Đứng đầu là ung thư vú với gần 8.400 ca, kế đến là ung thư cổ tử cung, gần 6.770 ca, ruột kết và trực tràng gần 6.290, dạ dày 5.860, khí quản, phế quản

ứng cho nhu cầu về số lượng cây cho y dược học cổ truyền, phương pháp này

có ưu điểm là nhân nhanh giống mà không phụ thuộc vào điều kiện mùa vụ, môi trường

Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo cây in vitro

Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro

của cây Xạ đen

Xác định một số chỉ tiêu sinh lý của chồi đỉnh tái sinh in vitro

3 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

- Ý nghĩa lý luận: bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây Xạ

đen

- Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu Góp phần sản xuất và nhân nhanh cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt ứng dụng vào sản xuất cây trồng dược liệu phục

vụ cho các ngành khoa học khác

3

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân giống cây trồng in vitro

1.1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro)

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ ban đầu, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất [1], [3]

Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm

Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay

mô sẹo (callus) mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, được phân chia và cấy chuyền để nhân giống [3]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White

và Nobercourt, 1939) Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân

tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan [13]

Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy

có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đó là môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng nuôi cấy [1]

Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ

của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ [1]

4

1.1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 – 20 năm trở lại đây Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy

mô nước ngoài nhận định [8]:

- Đó là tính toàn năng của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng loại trừ virut bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng

vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt,…)

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocrom và nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất, cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,…), cây làm thuốc,…

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo

- Khả năng hấp thu AND ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen

1.1.3 Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những ưu điểm sau:

Nuôi cấy mô giống như nhân giống vô tính vì phương pháp này tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền Đối với cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh

ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống từ nuôi cấy mô có ưu điểm hơn nhân giống từ hạt [1]

So với kiểu nhân giống vô tính bình thường (chiết cành, giâm, hom,…), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn [1]

Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ và nghiêm ngặt hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên

6

sạch bệnh Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất [1]

1.1.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro

chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn [2]:

 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô nuôi cấy là một thao tác khó và ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy nhiên nếu kiên trì tìm ra được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau một vài lần thử sẽ mang lại kết quả như mong muốn

 Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy

Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi

đỉnh (đỉnh sinh trưởng) hoặc chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tùy từng đối tượng mà người ta còn có thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa, Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy, quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy Theo Anolerson (1980) mẫu nuôi cấy của cây được lấy vào thời kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

 Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích

tạo ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình

7

Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin), các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch thủy phân Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau từ 1 – 2 tuần, từ những chồi riêng

lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất  - indole - acetic acid (IAA), Indode - 3 - butyric acid (IBA), α - Napthalene acelic acid (α-NAA) và 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất

 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm

ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết

định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ,

để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc Để đảm bảo cho cây có tỷ

lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp

từ 10 – 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng

sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh

8

(nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô

 Mô nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hoá gỗ đang sinh trưởng mạnh như:

Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,…, khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo, phân hoá thành rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau

Việc chọn mẫu để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được nhưng cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giai đoạn nhất định [5] Chủ yếu là người ta chọn mẫu nuôi cấy là chồi bên và mô phân sinh đỉnh

 Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân chia

tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, vì vậy nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày môi trường nuôi cấy sẽ phủ đầy nấm hoặc vi khuẩn, trong điều kiện này thí nghiệm phải loại bỏ vì mô cấy không thể phát triển và chết dần

Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đòi hỏi rất cao mới

có hy vọng thành công Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy chúng ta phải thực hiện yêu cầu sau:

- Vô trùng mẫu nuôi cấy bằng cách rửa sạch mẫu tự nhiên dưới vòi nước, rồi đưa vào buồng cấy và rửa sạch mẫu lại lần nữa bằng nước cất vô trùng, sau đó tiến hành xử lý sơ bộ bằng cồn (etanol) 70% và một số hoá chất xử lý

- Vô trùng môi trường nuôi cấy và nút đậy bằng nồi hấp khử trùng

- Thao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận, không đưa tay qua bề mặt thoáng của dụng cụ nuôi cấy cũng như môi trường nuôi cấy để tránh rơi nấm, bụi hoặc khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

- Khi cấy mẫu vô trùng vào môi trường cần phải tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các hoá chất

có hoạt tính diệt nấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để

và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mô cấy

Trần Văn Minh (2004) đưa ra nồng độ, thời gian và hiệu quả sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [7]

Bảng 1.1 Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và

thời gian xử lý mẫu

Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý

 Môi trường nuôi cấy

Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính sau đây:

- Các muối khoáng đa lượng

-Các muối khoáng vi lượng

- Các Vitamin

- Đường làm nguồn cacbon

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, Ethylendiamin Tetraacetic Acid (EDTA), hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào trong môi trường tuỳ theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3 môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Muashige and Skoog, 1962)

 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy

Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến

11

các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, sinh hoá khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường [9]

- Auxin: auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài của tế bào, kìm hãm sự rụng của lá, hoa và quả, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của ống phấn [9]

Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm

Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có

NAA Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí

quan trọng, hai tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ [7]

- Cytokinin: các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ [3]

- Gibberellin: hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ

và biểu bì

Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin Xử lý gibberellin làm tăng năng

12

suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng) Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin [9]

 Ảnh hưởng của pH và Agar

pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát

triển của mô [1], [8]

Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết môi trường dinh dưỡng Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả năng làm đông môi trường Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước và hấp thụ hoá chất Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %

1.2 Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth)

Loài: Celastrus hindsii Benth

Một số tên gọi khác của cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) như: cây

Bách giải, cây Đồng triều, cây Bạch vạn hoa, dây gối, quả nâu, người Mường gọi là cây ung thư

13

1.2.2 Đặc điểm sinh học

Xạ đen thuộc loại cây dây leo thân gỗ, mọc thành búi, dễ trồng, nhánh non tròn, không có lông, lá mọc cách và không rụng theo mùa, phiến bầu dục xoan ngược, gân phụ 7 cặp, bìa có răng thấp Cuống lá dài từ 5 – 7 mm Chùm hoa ở ngọn hay ở nách lá, dài 5 – 10 cm Cuống hoa dài từ 2 – 4 mm Hoa mẫu 5, cánh hoa trắng, hoa cái có bầu 3 ô Quả nang hình trứng, dài cỡ 1 cm,

nổ thành 3 mảnh Hạt có áo hạt màu hồng Ra hoa tháng 3 – 5, Ra quả tháng

(Celastrus hindsii Benth)

Hình 1.2 Quả cây Xạ đen

Vì, Thừa Thiên - Huế, Gia Lai

1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới

Từ năm 1977, tác giả Lưu Khải Thọ ở Trung Quốc đã bắt đầu nghiên cứu về cây Xạ đen, ông đã chiết xuất được chất Saponin Triterpenoid từ cây

1.2.3.2.Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở Việt Nam

Mở đầu cho công trình nghiên cứu về cây Xạ đen đó là tác giả Lê Thế Trung ông đã biết đến “mối quan hệ” giữa cây Xạ đen và căn bệnh ung thư từ năm 1989 Ông quan tâm tới các thành phần hoá dược của cây Xạ đen, ở lá, thân, rễ của cây đều có 4 chất chính (chỉ khác nhau về hàm lượng) là: Fanavolnoid, Quinon, Saponin Triterpenoid và Tanin Pyrocatechic, 4 chất này

có tác dụng hạn chế sự phát triển của các khối u trên cơ thể động vật mà ông thí nghiệm ban đầu [15]

Ngày nay có thêm các nghiên cứu khác về cây Xạ đen, và các nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào nhân giống cây Xạ đen bằng kĩ thuật giâm, hom,… truyền thống