22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen
Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh. Đây là bước quan trọng trong nuôi cấy mô cây Xạ đen. Mục tiêu đạt được của thí nghiệm này là xác định được nồng độ của chất khử trùng javen, cồn và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn vật liệu sạch cho các thí nghiệm sau.
Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Xạ đen.
Bước 1. Thu đỉnh sinh trưởng mẫu
Xạ đen từ tự nhiên.
Bước 2. Rửa sạch đỉnh sinh trưởng
23
Bước 3.Xử lý bằng các chất khử
trùng (xử dụng ống fancon) sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng
từ 3 - 5 lần
Bước 4. Thấm khô mẫu trên giấy lọc
khô đã khử trùng và cắt mẫu dài khoảng 2 – 2,5 cm
Bước 5: Cấy mẫu vào môi trường MS cơ bản
24
Bảng 3.1. Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy
Công thức Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
Mẫu sạch Hiệu quả
khử trùng (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) ĐC 100,0 0,0 0,0 0,0 CT1 100,0 0,0 0,0 0,0 CT2 70,0 20,0 10,0 10,0 CT3 60,0 30,0 10,0 20,0 CT4 60,0 30,0 10,0 20,0 CT5 20,0 65,0 15,0 50,0 CT6 0,0 97,0 3,0 94,0 CT7 0,0 98,0 2,0 96,0 CT8 0,0 96,0 4,0 92,0 CT9 24,4 60,3 15,3 45,0 CT10 20,0 60,0 20,0 40,0 CT11 0,0 0,0 100,0 0,0 CT12 0,0 0,0 100,0 0,0 CT13 60,0 35,0 5,0 30,0 CT14 80,0 15,0 5,0 10,0 CT15 82,7 0,0 17,3 0,0 CT15 75,0 20,0 5,0 15,0 CT17 0,0 5,0 95,0 0,0 CT18 0,0 3,0 97,0 0,0 CT19 0,0 5,0 85,0 0,0 CT20 0,0 0,0 100,0 0,0 CT21 0,0 0,0 100,0 0,0
25 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0 10 20 20 50 94 96 92 45 40 0 0 30 10 0 15 0 0 0 0 0 Hiệu quả khử trùng (%)
26
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy ở công thức ĐC (xử lý sơ bộ) mẫu đều bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy. Khi khử trùng mẫu với javel ở nồng độ 5% (CT1 đến CT4) thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao khi tăng thời gian xử lý thì hiệu quả khử trùng tăng lên xong vẫn thấp hơn so với các công thức còn lại. Ở nồng độ javel 10% thì chỉ có duy nhất ở thời gian xử lí 5 phút (CT5) đạt 50% còn lại ở các công thức từ CT6 đến CT8 thì hiệu quả khử trùng cao trên 90%, đặc biệt ở CT7 đạt tỉ lệ không nhiễm cao, mẫu sống có khả năng phát triển tốt, số lượng mẫu bị chết rất thấp (2/100 mẫu) hiệu quả khử trùng đạt 96 %. Với CT6 và CT8 đều đạt tỉ lệ mẫu sạch cao trong đó CT6 có 3/100 mẫu chết, hiệu quả khử trùng đạt 94% còn ở CT8 có 5/100 mẫu chết, hiệu quả khử trùng đạt 90%. Đối với nồng độ 15% chỉ có ở thời gian 5 phút (CT9) và 10 phút (CT10) có mẫu sống với tỉ lệ tương ứng là 45% và 40%, còn ở thời gian 15 (CT11) và 20 phút (CT12) các mẫu đều chết.
Qua kết quả trên cho thấy xử lý mẫu với javen ở nồng độ thấp thì tỉ lệ nhiễm cao còn ở nồng độ cao thời gian xử lý dài thì các mẫu bị chết nhiều. Nồng độ thích hợp nhất là nồng độ 10% với thời gian xử lí từ 10 đến 20 phút.
Đối với chất khử trùng là cồn (CT13 đến CT21) qua số liệu thu được thì các mẫu xử lí bằng cồn thường cho kết quả mẫu không nhiễm rất thấp ở thời gian xử lí ngắn hoặc có thể bị chết nếu xử lí ở thời gian dài. Kết quả này có thể giải thích do cồn không có khả năng khử trùng sâu bên trong mẫu nên tỉ lệ nhiễm cao và xử lí thời gian dài thì đỉnh sinh trưởng bị chết. Đối với cồn tuyệt đối 96% thì đỉnh sinh trưởng của mẫu đều bị chết do nồng độ cồn quá cao. Điều này cho thấy xử lý mẫu với nồng độ cồn quá cao thì cồn sẽ phá huỷ các tế bào, hay mô phân sinh ở đỉnh sinh trưởng làm cho cây không thể sinh trưởng được và bị chết do các tế bào bị tổn thương nghiêm trọng.
27
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây Xạ đen
3.2.1. Sự hình thành mô sẹo (callus)
Bảng 3.2. Thời gian hình thành mô sẹo trên môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ BAP khác nhau.
Môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP Thời gian hình thành mô sẹo
MS (ĐC) Không hình thành mô sẹo
MS + 0,3mg/l BAP 4 ngày MS + 0,6mg/l BAP 4 ngày MS + 1,0mg/l BAP 6 ngày MS + 1,5mg/l BAP 8 ngày Hình 3.3. Mẫu vô trùng sống phát sinh chồi
Hình 3.4. Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển
28
Qua theo dõi sự hình thành của mẫu được cấy trong các môi trường MS có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau thì thấy kết quả như sau:
Ở môi trường MS có bổ sung BAP với nồng độ 0,3 và 0,6 mg/l có sự hình thành mô sẹo sớm nhất (chỉ sau 4 ngày nuôi cấy). Còn ở môi trường MS bổ sung BAP với nồng độ 1,0 và 1,5 mg/l thì thời gian hình thành mô sẹo lâu hơn tương ứng là 6 ngày và 8 ngày. Sau 30 ngày theo dõi thì kết quả thấy khối mô sẹo ở môi trường MS cơ bản bổ sung 0,3 mg/l BAP và MS cơ bản bổ sung 0,6 mg/l BAP lớn hơn so với khối mô sẹo trong môi trường MS cơ bản bổ sung 1,0 mg/l BAP và MS cơ bản bổ sung 1,5 mg/l BAP.
Hình 3.5. Khối mô sẹo sau 7 ngày theo dõi
Hình 3.6. Khối mô sẹo sau 15 ngày theo dõi
29
3.2.2. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi mới in vitro
Bảng 3.3. Số chồi tạo thành, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi của mẫu cấy trong các môi trường MS có bổ sung nồng độ BAP khác nhau
Môi trường Số chồi ban đầu (chồi/bình) Số chồi mới tạo thành sau 30 ngày (chồi/bình) Chiều cao chồi mới (cm) Hệ số nhân chồi MS (ĐC) 2 2 0 1,0 MS + 0,3 mg/l BAP 2 8 0,5 – 1 4,0 MS + 0,6 mg/l BAP 2 10 1,5 – 2,5 5,0 MS + 1,0 mg/l BAP 2 4 0,3 – 0,5 2,0 MS + 1,5 mg/l BAP 2 2 0 1,0
Theo dõi mẫu sau 30 ngày nuôi cấy trong các môi trường ta thu được kết quả ở bảng 3.3. Ta thấy tỉ lệ tạo chồi mới lớn nhất ở môi trường MS + 0,6 mg/l BAP sau đó đến môi trường MS+ 0,3 mg/l BAP, ở môi trường MS + 1,0 mg/l BAP thì khả năng tạo chồi mới kém (hình 3.10) ở môi trường MS + 1,5 mg/l BAP thì mẫu không tạo được chồi mới (hình 3.9). Qua kết quả theo dõi 30 ngày nhận thấy các chồi mới trong môi trường MS + 0,3 mg/l BAP và MS + 0,6 mg/l BAP phát triển mạnh các chồi có màu xanh (hình 3.7). Chồi trong môi trường MS + 1,0mg/l BAP và MS + 1,5 mg/l BAP phát triển chậm hơn lá kém xanh hơn (hình 3.8).
30
Qua bảng 3.3 ta cũng thấy chiều cao chồi mới cũng có sự khác nhau ở các môi trường khác nhau. Chiều cao chồi lớn nhất ở môi trường MS + 0,6 mg/l BAP là từ 1,5 đến 2,5 cm, sau đó là ở môi trường MS + 0,3 mg/l BAP từ 1 đến 1,5 cm, còn ở môi trường MS + 1,0 mg/l BAP và MS + 1,5 mg/l BAP thì chồi gần như không phát triển, các lá cũng trở nên úa vàng sau một thời gian nhất định.
Qua bảng 3.3 ta thấy ở môi trường MS + 0,6 mg/l BAP có hệ số nhân chồi cao nhất, và đây cùng là môi trường thích hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi cây Xạ đen, sau đó là môi trường MS + 0,3 mg/l BAP cũng có hệ số nhân chồi tương đối cao. Ta thấy rằng nếu bổ sung BAP với nồng độ cao MS + 1,0 mg/l BAP và MS + 1,5 mg/l BAP vào môi trường thì nó gây ức chế quá trình sinh trưởng của cây. Không phát triển về chiều cao, cũng không tạo chồi mới.
Hình 3.7. Chồi mới tạo ra và sinh trưởng mạnh
Hình 3.8. Chồi mới không phát triển
31 0 2 4 6 8 10 12 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
số chồi ban đầu số chồi sau 30 ngày
Hình 3.9. Không tạo chồi mới Hình 3.10. Chồi mới tạo ra chậm phát triển
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hệ số nhân chồi ở các môi trường của cây Xạ đen
32
3.3. Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh tái sinh in vitro
Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh in vitro
Bảng 3.4. Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh tái sinh in vitro.
Mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình
Khối lượng tươi (gam) 0,0112 0,0277 0,0115 0,0168
Khối lượng khô (gam) 0,0018 0,0066 0,0024 0,0036
Xác định nồng độ và hàm lượng diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb), diệp lục tổng số (Ca + b), carotenoit tổng số (Cx+c)
Qua việc tiến hành đo sự hấp thụ của dịch chiết ở sóng 644,8 nm và 661,6 nm, chúng tôi thu được kết quả của nồng độ diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb), và diệp lục tổng số (Ca + b), carotenoit tổng số (Cx+c) ở bảng sau.
Bảng 3.5. Nồng độ và hàm lượng diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb) và diệp lục tổng số (Ca + b), carotenoit tổng số (Cx+c). Mẫu Nồng độ Hàm lượng In vitro Ca 2,67 320,40 Cb 1,46 175,20 Ca + b - 496,50 Cx+c 0,66 - Tự nhiên Ca 13,35 1602,00 Cb 6,14 736,80 Ca + b - 2339,10 Cx+c 3,97 -
Qua bảng 3.5 ta thấy hàm lượng diệp lục a, diệp lục b và hàm lượng diệp lục tổng số Ca + b của cây in vitro đều thấp hơn và thấp hơn rất nhiều so với
33
cây tự nhiên. Có thể mẫu in vitro có điều kiện ánh sáng chưa thực sự phù hợp, làm cho hàm lượng diệp lục trong lá thấp hơn.
34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau:
- Mẫu cây Xạ đen thực sinh được vô trùng tốt nhất trong chất khử trùng Javen nồng độ 10% với thời gian xử lí từ 10 đến 20 phút, đạt hiệu quả khử trùng lần lượt là 94%, 96%, 90%. Đây là thời gian có thể nói là hợp lý nhất cho quá trình khử trùng mẫu cây Xạ đen.
- Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi cây Xạ đen là môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ BAP là 0,6 mg/l với hệ số nhân chồi là 5,0. Chiều cao của chồi cũng phát triển tốt nhất ở môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ BAP là 0,6 mg/l khoảng từ 1,5 – 2,5 cm.
- Các chỉ tiêu sinh lí về nồng độ và hàm lượng diệp lục cũng như sắc tố carotenoit của chồi đỉnh tái sinh in vitro đều thấp hơn ở cây tự nhiên.
Kiến nghị
Cần nghiên cứu nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng khác nhau để thích hợp cho sự nhân nhanh và ra rễ của cây Xạ đen.
35
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Bá Bổng (1995), Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang.
2. Trần Thị Dung (2003), Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.
3. Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.
5. Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ tế bào, Nxb Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
6. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Trần Văn Minh (2004), Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp tập 1, 2.
9. Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
10. Huang HC, Shen CC, Chen CF, Wu YC, Ku YH (2000) Graduate Institute of Natural Products, Kaohsiung Medical College, Taiwan, ROC.Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 48(7): 1079-1080.
11. Murashige T., and Skoog F., (1962), “Development of MS medium”, Physiol. Plant, 15: 473 – 479.
36
12. Pham Hoang Ho (1999), Cay co Viet Nam (An Illustrated Flora of Vietnam). Youth Publishing House, II, p.153.
13. Thorpe, TA, (1980), Organogenesis in vitro: Structural, physiological and biochemical aspects, Int. Rev. Cytol. (Suppl.) , 11A:71–111.
Tài liệu internet
14. http://vmmu.edu.vn/thuochvqy/DuocPham.aspx?madp=9
15. http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_042.htm
16.http://danso.giadinh.net.vn/y-te/dieu-tri-ung-thu-xa-den-chi-co-tac-
dung-ho-tro-40580.htm
37
PHỤ LỤC
Hình 1. Thao tác trong box cấy vô trùng
Hình 2. Kiểm tra mẫu cấy thường xuyên
Hình 3. Dịch chiết mẫu lá tự nhiên cây Xạ đen
Hình 4. Dịch chiết mẫu lá in vitro cây Xạ đen
38
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ
1. ThS La Việt Hồng, Trần Thị Thắm, Phạm Thị Tươi, Dương Thị Minh, Mai Thị Hồng (2014), “Quy trình khử trùng đơn giản mẫu cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.)Harms) in vitro”, (Kỷ yếu Hội Nghị Khoa Học Trẻ)