2.3.2.1. Thí nghiệm 1. Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen
Mẫu đỉnh sinh trưởng cây Xạ đen sau khi được khử trùng sơ bộ trong tủ cấy vô trùng ta sẽ tiến hành xử lý mẫu bằng chất khử trùng javel và cồn với các nồng độ và thời gian tương ứng được bố trí như ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen
Công thức Chất xử lý/ thời gian
ĐC Xử lý sơ bộ CT1 Xử lý sơ bộ + javen 5% / 5 phút CT2 Xử lý sơ bộ + javen 5% / 10 phút CT3 Xử lý sơ bộ + javen 5% / 15 phút CT4 Xử lý sơ bộ + javen 5% / 20 phút CT5 Xử lý sơ bộ + javen 10% / 5 phút
18 CT6 Xử lý sơ bộ + javen 10% / 10 phút CT7 Xử lý sơ bộ + javen 10% / 15 phút CT8 Xử lý sơ bộ + javen 10% / 20 phút CT9 Xử lý sơ bộ + javen 15% / 5 phút CT10 Xử lý sơ bộ + javen 15% / 10 phút CT11 Xử lý sơ bộ + javen 15% / 15 phút CT12 Xử lý sơ bộ + javen 15% / 20 phút CT13 Xử lý sơ bộ + cồn 70% / 3 phút CT14 Xử lý sơ bộ + cồn 70% / 5 phút CT15 Xử lý sơ bộ + cồn 70% / 7 phút CT16 Xử lý sơ bộ + cồn 90% / 3 phút CT17 Xử lý sơ bộ + cồn 90% / 5 phút CT18 Xử lý sơ bộ + cồn 90% / 7 phút CT19 Xử lý sơ bộ + cồn 96% / 3 phút CT20 Xử lý sơ bộ + cồn 96% / 5 phút CT21 Xử lý sơ bộ + cồn 96% / 7 phút
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 5 ngày theo dõi.
19 Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%)
= ô
x 100
+ Tỷ lệ mẫu bị nhiễm khuẩn, nấm (%)
= ẫ ị ẩ ấ
ố ố ấ x 100 + Tỷ lệ mẫu vô trùng nhưng chết (%) =
ổ ố ẫ ấ x 100 Hiệu quả khử trùng = Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) - Tỷ lệ mẫu vô trùng nhưng chết (%).
2.3.2.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây Xạ đen
Sau khi đã khử trùng mẫu thành công chúng ta chuyển các mẫu sang môi trường tái sinh chồi MS bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau (0,3mg/l; 0,6mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l) BAP; pH = 5,8.
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro
Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4
Nồng độ BAP (mg/l) 0 0,3 0,6 1,0 1,5
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu. Đánh giá thí nghiệm sau 30 ngày theo dõi.
20
Chỉ tiêu theo dõi: + Thời gian tạo mô sẹo từ mẫu nuôi cấy. + Số chồi phát sinh/1 mẫu cấy.
+ Hệ số nhân chồi (lần). + Chiều cao chồi (cm).
2.3.2.3. Thí nghiệm 3. Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh Xạ đen tái sinh in vitro
Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh in vitro
Lấy mẫu đỉnh sinh trưởng của cây in vitro đem cân trên cân phân tích. Sau đó, đem mẫu sấy trong tủ sấy ở 1050
C trong thời gian 3 tiếng đến khối lượng không đổi, cân lại được khối lượng khô của mẫu [6].
• Xác định nồng độ và hàm lượng diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb), diệp lục tổng số (Ca + b), carotenoit tổng số (Cx+c)
Cách tiến hành:
- Làm lạnh mẫu lá bằng nitơ lỏng, nghiền thành bột mịn.
- Lấy 0,1 gam bột mịn vào ống, bổ sung 12 ml axeton và đợi nguyên liệu thấm axeton (khoảng 10 phút).
- Cho dung dịch vào ống fancol (loại 15 ml) ly tâm cho các hạt phân tán rơi xuống đáy.
- Đo sự hấp thụ của dịch chiết ở bước sóng 644,8 nm và 661,6 nm.
Nồng độ của diệp lục a (Ca), diệp lục b (Cb) và carotenoit tổng số (Cx+c) được tính toán theo phương trình sau ( dịch chiết là axeton tinh khiết) [6].
Ca (µg/ml) = 11,24.A661,6 - 2,04.A644,8 Cb (µg/ml) = 20,13.A644,8 - 4,19.A661,6
21
Hàm lượng diệp lục được tính theo công thức
Ca (µg/g khối lượng khô) = (11,24. A661,6 - 2,04. A644,8).12/ khối lượng khô. Cb (µg/g khối lượng khô) = (20,13. A644,8 - 4,19. A661,6).12/ khối lượng khô. Ca + b (µg/g khối lượng khô) = (7,05. A661,6 + 18,09.A644,8).12/ khối lượng khô.