Cây xạ đen [Ehretia asperula Zoll. et Mor] thuộc họ Boraginaceae là cây thảo dược có tác dụng hữu hiệu trong việc điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc và được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học cũng như hoạt chất có khả năng kháng sự phân chia tế bào ung thư. Việc nhân giống cây xạ đen là cần thiết nhằm mục đích bảo tồn giống và làm nguyên liệu cho ngành dược học.
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 NGHIÊN CỨU NHÂN CHỒI CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO Phạm Thị Mỹ Trâm(1), Lê Thị Bích Dun(1), Đồn Thị Thanh Giang(1), Ngơ Kế Sƣơng(3), Lê Thị Thuỷ Tiên(2) (1) Trường Đại học Thủ Dầu Một, (2) Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM (3) Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp HCM Ngày nhận 21/03/2019; Ngày gửi phản biện 30/03/2019; Chấp nhận đăng 02/05/2019 Email : tramptm@tdmu.edu.vn Tóm tắt Cây xạ đen [Ehretia asperula Zoll et Mor] thuộc họ Boraginaceae thảo dược có tác dụng hữu hiệu việc điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc nghiên cứu nhiều thành phần hố học hoạt chất có khả kháng phân chia tế bào ung thư Việc nhân giống xạ đen cần thiết nhằm mục đích bảo tồn giống làm nguyên liệu cho ngành dược học Trong nghiên cứu này, tạo chồi từ đoạn chồi nách xạ đen trồng vườn nuôi cấy môi trường MS Qua số thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chất điều hồ sinh trưởng lên tạo chồi xạ đen, nhận thấy đoạn chồi non xạ đen tự nhiên có khả nhân chồi tốt với mơi trường MS có bổ sung BA (0,6 mg/l) cho số lượng chồi phát sinh chồi/mẫu Từ khoá: chồi nách non, Ehretia asperula Zoll et Mor., in vitro, nhân chồi, xạ đen Abstract HIGH FREQUENCY SHOOT MULTIPLICATION OF XA DEN CULTURED IN VITRO Xa den (Ehretia asperula Zoll et Mor) belongs to the family Boraginaceae which is effective in treating pimples, inflammation, detoxification Many researches on the chemical compositions as well as secondary compounds were studied Propagation of Xa den tree is necessary for the purpose of preserving seeds and materials for the pharmaceutical industry In this study, shoot formation from young shoots of Xa den cultivated in the garden was cultured on MS medium In some experiments, the effects of growth regulators on young shoots, we found that the young shoots of Xa den in garden were capable of propagating well with MS medium supplemented BAP (0.6 mg/l) for shoots/sample Mở đầu Nuôi cấy mô thực vật q trình nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất kỹ thuật nuôi cấy phận khác (tế bào, mô, quan ) môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng Kỹ thuật in vitro dựa nguyên lý tế bào thực vật có tính tồn năng, nghĩa từ mô, quan, tế bào phận phát triển thành hoàn chỉnh ni mơi trường thích hợp (Hồng Thu, 2009; Nguyễn Văn Uyển, 1993) Kỹ thuật nhân giống in vitro không 57 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro ứng dụng để nhân giống phục tráng trồng mà đem lại hiệu kinh tế cao việc nhân nhanh tạo số lượng lớn đồng đều, bệnh, đặc biệt giữ tính trạng quý bố mẹ cho phép chủ động cung cấp nguồn giống vật liệu vô trùng cho thí nghiệm (Nguyễn Đức Lượng & Nguyễn Thị Thủy Tiên, 2002) Ngày nay, y dược học phát triển, với thuốc dân gian tìm số thuốc dân gian tìm thuốc tự nhiên có tác dụng ưu việc điều trị bệnh ung thư, mụn nhọt,… người Một thuốc dân gian xạ đen, có nhiều tác dụng đóng vai trò khơng thể thiếu thuốc cổ truyền Xạ đen có tên khoa học Ehretia asperula Zoll et Mor., thuộc họ Boraginaceae, bụi trườn, có tác dụng hữu hiệu việc điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc, thông kinh, sử dụng trị bệnh ung thư gan (Lê Thị Thủy Tiên & Trần Văn Minh, 2015) Dịch chiết từ loài xạ đen có hoạt tính gây độc tế bào, kháng lại dòng tế bào HEPA-2B (ung thư gan), COLO-25 (ung thư ruột kết), KH (ung thư mũi hầu) kháng virus HIV (Ly cs., 2006) Hiện xạ đen loài nhỏ trồng phổ biến tỉnh thành Sơn La, Hòa Bình, Hà Nam, Quảng Bình Tuy nhiên, lồi bị cạn kiệt dần tự nhiên bị khai thác nhiều Do vậy, công tác nhân giống trồng lại để bảo tồn nguồn gen cung cấp nguồn dược liệu từ xạ đen vấn đề nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Từ sở trên, nhóm chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu nhân chồi xạ đen Ehretia asperula Zoll et Mor phƣơng pháp in vitro” Vật liệu phƣơng pháp Vật liệu: Cây xạ đen Ehretia asperula Zoll et Mor tự nhiên Phương pháp Mẫu chồi nách xạ đen ngồi vườn Xà phòng, cồn 70% phút Khử trùng mẫu cấy với Javel 30%/5 phút Tạo chồi Nhân chồi Hình Sơ đồ quy trình thí nghiệm Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp NAA đến khả nhân chồi in vitro xạ đen Môi trường MS tạo chồi chứa 0,6 mg/l BAP kết hợp với nồng độ NAA khảo sát (bảng 1): Bảng Công thức nồng độ NAA lên vật liệu in vitro xạ đen Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Nồng độ NAA (mg/l) 0,5 1,5 58 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: (1) hình thái chồi; (2) số lượng chồi hình thành/1 mẫu cấy Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng nước dừa đến khả nhân chồi in vitro xạ đen Để tăng hệ số nhân chồi, ta kết hợp môi trường tạo chồi tốt thí nghiệm với thể tích nước dừa phù hợp tìm bảng cơng thức đây: Bảng Cơng thức thể tích nước dừa lên vật liệu in vitro xạ đen Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Thể tích nước dừa (ml) 5%V 10%V 15%V 20%V Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: (1) hình thái chồi; (2) số chồi hình thành/1 mẫu cấy Phương pháp xử lí số liệu: Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Số liệu xử lí phần mềm Microsoft Excel Kết thảo luận 3.1 Tạo vật liệu in vitro xạ đen Đoạn chồi non xạ đen trồng vườn sử dụng cho trình tạo chồi in vitro Đầu tiên, mẫu chồi non cắt khoảng – 4cm, đem rửa với xà phòng vòng 10 phút, sau rửa lại nhiều lần vòi nước máy Mẫu đưa vào tủ cấy rửa lại lần nước cất sử dụng cồn 700 để rửa mẫu phút Sau lắc cồn mẫu rửa lại nước cất Mẫu tiếp tục chuyển vào bình tam giác chứa Javen 30%, lắc nhẹ phút Sau đó, mẫu rửa lại nước cất vô trùng lần Thấm mẫu giấy lọc cắt đoạn thân có chồi nách để cấy vào bình mơi trường MS có chứa BAP 0,6 mg/l Đây bước quan trọng nuôi cấy mô xạ đen Sau tuần mẫu bắt đầu xuất chồi nách Và sau tháng chồi cấy chuyền qua bình mơi trường để nhân số lượng chồi (hình 2, 3) Hình Mẫu chồi nách xạ đen tự nhiên 59 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro nh Mẫu vô trùng sống phát sinh chồi 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp NAA đến khả nhân chồi in vitro xạ đen Qua theo dõi hình thành mẫu cấy 30 ngày môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l BAP nồng độ NAA khác nhau, kết ghi nhận bảng Ở mơi trường MS có bổ sung BAP NAA với nồng độ mg/l tạo sẹo nhỏ, chồi phát triển tốt, xanh, nhiều non, mơi trường khơng bị nâu hóa sau tuần Còn mơi trường MS bổ sung BAP 0,5 mg/l NAA số chồi giảm, nhỏ, chưa phát triển to chồi, sẹo to phát triển quanh gốc Môi trường MS bổ sung BAP 1mg/l NAA chồi, sẹo to phát triển quanh gốc mơi trường bị nâu hóa sau tuần Còn lại môi trường MS bổ sung BAP NAA với nồng độ 1,5 mg/l mg/l tạo sẹo quanh gốc, không tạo chồi, môi trường bị nâu chuyển sang màu đen Bảng Số chồi hình thành sau tuần ni cấy với 0,6 mg/l BAP kết hợp với nồng độ NAA khác Chất điều hoà sinh trƣởng 0,6 mg/l BAP + mg/l NAA 0,6 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA 0,6 mg/l BAP + mg/l NAA 0,6 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA 0,6 mg/l BAP + mg/l NAA Số chồi ban đầu Số chồi TB tăng lên sau tuần nuôi cấy Số TB chồi sau tuần nuôi cấy ± 1,22 ± 1,41 0,8 ± 0,45 3,6 ± 2,19 0,4 ± 0,55 0,8 ± 1,09 0,2 ± 0,45 0,4 ± 0,89 0 1 1 Nhìn chung mơi trường MS bổ sung 0,6 mg/l BAP thích hợp cho trình tạo chồi, số chồi trung bình đạt chồi/mẫu Kết tương tự với kết số tác giả khác Như theo nghiên cứu Dương Thị Minh (2014), với môi trường MS chứa 0,6 mg/l BAP hệ số nhân chồi Theo nghiên cứu Bùi Văn Thắng (2013), với nồng độ mg/l BAP số chồi trung bình đạt 2,95 chồi/mẫu (Vũ Quang Nam cs., 2013) Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy bổ sung NAA vào q trình tạo chồi khơng thích hợp Ngun nhân nồng độ auxin cao không tạo nhiều chồi mà ức chế sinh trưởng phát triển mơ cấy 60 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 nh Biểu đồ thể ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp NAA đến khả nhân chồi in vitro xạ đen A B C D nh Chồi xạ đen hình thành sau 30 ngày ni cấy môi trường MS bổ sung A: 0,6 mg/l BAP; B: 0,6 mg/l BAP 0,5 mg/l NAA; C: 0,6 mg/l BAP mg/l NAA; D: 0,6 mg/l BAP 1,5 mg/l NAA 61 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro 3.3 Ảnh hưởng nước dừa đến khả nhân chồi in vitro xạ đen Qua theo dõi hình thành mẫu cấy 30 ngày môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l BAP nồng độ nước dừa khác nhau, kết ghi nhận bảng hình Ở mơi trường MS có bổ sung BAP khơng chứa nước dừa tạo sẹo nhỏ, chồi phát triển tốt, xanh, nhiều non, mơi trường khơng bị nâu hóa sau tuần Còn mơi trường MS bổ sung BAP 5%V nước dừa chồi phát triển ít, xanh, xuất sẹo, môi trường bị nâu hóa sau tuần Mơi trường MS bổ sung BAP 10%V nước dừa, chồi (1 – chồi mẫu), nhỏ, sẹo to phát triển quanh gốc, mơi trường bị nâu hóa sau tuần Còn lại môi trường MS bổ sung BAP nước dừa với thể tích 15%, bị chết, tạo sẹo to quanh gốc, chồi (có khơng tạo chồi), nhỏ, vài chồi khơng có lá, mơi trường bị nâu hóa sau tuần Bảng Số chồi hình thành sau tuần ni cấy mơi trường MS bổ sung BAP kết hợp với nước dừa Thể tích nƣớc dừa bổ sung Số chồi ban đầu Số chồi TB tăng lên sau tuần nuôi cấy Số TB cụm chồi sau tuần nuôi cấy 0%V nước dừa ± 1,22 6,8 ± 1,09 5%V nước dừa ± 0,82 3,5 ± 1,91 10%V nước dừa 1,4 ± 0,55 1,6 ± 1,67 15%V nước dừa 1,2 ± 0,84 0,8 ± 1,09 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 1.4 1 ĐC CT1 Số chồi ban đầu 1 1.2 CT2 CT3 Số chồi sau 30 ngày nh Biểu đồ thể ảnh hưởng nước dừa lên hệ số nhân chồi mơi trường xạ đen Qua thí nghiệm cho thấy, có lẽ nước dừa chứa nhiều chất khống khơng thích hợp cho việc nhân chồi xạ đen Theo tác giả Nguyễn Văn Kết cs (2014), trà my hoa đỏ, môi trường WPM hàm lượng khoáng đa lượng thấp hàm lượng vitamin thiamin (B1) cao gấp 10 lần so với môi trường MS nên có tác dụng tốt cho q trình trao đổi chất, giúp cho mơ ni cấy hấp thụ trực tiếp loại vitamin môi trường nuôi cấy, đặc biệt giai đoạn nhân chồi tạo chồi Vì giai đoạn này, chồi non chưa hình thành nên khả quang hợp tự 62 Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 3(42)-2019 tạo chất hữu nhỏ Vì phát triển chồi phụ thuộc vào chất hữu môi trường nuôi cấy Vitamin có vai trò xúc tác q trình trao đổi chất diễn tế bào, muốn đạt sinh trưởng mạnh cho mô nuôi cấy nhà nghiên cứu thêm vào môi trường số vitamin thông thường như: nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, glycine Trong số đó, vitamin B1 coi vitamin thiết yếu cho sinh trưởng biến dưỡng tế bào thực vật Nguyễn Văn Kết cs (2014) A B C D nh Chồi xạ đen sau 30 ngày ni cấy mơi trường MS có bổ sung: A (0,6 mg/l BAP), B (0,6 mg/l BAP + 5%V nước dừa), C (0,6 mg/l BAP + 10%V nước dừa), D (0,6 mg/l BAP + 15%V nước dừa) Như vậy, thí nghiệm sử dụng nước dừa để nhân chồi khơng phù hợp Vì hàm lượng khống nước dừa cao, trình nhân chồi thân gỗ lại khơng cần q nhiều chất khống Sau q trình thử nghiệm loại mơi trường, chọn môi trường MS chứa 0,6 mg/l BAP để tạo nhân chồi xạ đen Sau tháng, chồi đạt – 5cm rễ (hình 7) Hình Chồi xạ đen sau tháng nuôi cấy 63 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Dương Thị Minh (2014) Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro bước đầu nhân nhanh xạ đen phương pháp tạo đa chồi Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội [2] Hoàng Thu (2009) Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro giống lan hồ điệp nhập nội (phalaenopsis) Luận văn tốt nghiệp đại học Viện Đại học Mở Hà Nội [3] Le Thi Thuy Tien, Tran Van Minh (2015) Tissue cultures of xa den Ehretia asperula Zollinger et Moritzi Journal of Science of An Giang University, 3(3),113-123 [4] Ly T N et al (2006) Isolation and characterization of rosmarinic acid oligomers in Celastrus hindsii Benth leaves and their antioxidative activity Agricultural and Food Chemistry, 54(11), 3786-3793 [5] Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Thị Thủy Tiên (2002) Công nghệ tế bào NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [6] Nguyễn Văn Kết cs (2014) Khảo sát khả nhân giống Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy) in vitro Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 30, 17-25 [7] Nguyễn Văn Uyển (1993) Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống trồng NXB Nông nghiệp [8] Vũ Quang Nam cs (2013) Nhân giống xạ đen (Celastrus hindsii Benth) phương pháp ni cấy mơ Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp Số 2, 11 – 16 [9] Quỹ Châu - Trung tâm Môi trường Phát triển cộng đồng (2012) Xạ đen – Cây thuốc người Dao Ba Vì http://huse.edu.vn/threads/nhung-cong-dung-cua-cay-xa-den-trong-y-hoc.50004 Truy xuất ngày 08/07/2016 64 ... 0,6 mg/l BAP để tạo nhân chồi xạ đen Sau tháng, chồi đạt – 5cm rễ (hình 7) Hình Chồi xạ đen sau tháng ni cấy 63 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro TÀI LIỆU THAM... 0,6 mg/l BAP 1,5 mg/l NAA 61 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro 3.3 Ảnh hưởng nước dừa đến khả nhân chồi in vitro xạ đen Qua theo dõi hình thành mẫu cấy 30 ngày mơi... để nhân số lượng chồi (hình 2, 3) Hình Mẫu chồi nách xạ đen ngồi tự nhiên 59 Phạm Thị Mỹ Trâm… Nghiên cứu nhân chồi xạ đen phương pháp invitro nh Mẫu vô trùng sống phát sinh chồi 3.2 Ảnh hưởng