Đang tải... (xem toàn văn)
Với các ưu điểm vượt trội của cây Keo lai so với các loài cây lâm nghiệp khác mà hiện nay loài cây này chiếm phần lớn trên diện tích trồng rừng của Việt Nam. Từ đó nhu cầu về giống cho trồng rừng là vô cùng lớn. Tuy nhiên việc nhân giống bằng các phương pháp truyền thống như giâm hom, gieo hạt không đáp ứng được nhu cầu về cây giống sạch bệnh, đồng đều về phẩm chất. Cùng với những kết quả về cải thiện giống, công nghệ nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) được xem là giải pháp công nghệ hàng đầu để duy trì chất lượng di truyền của cây giống. Việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống in vitro là một phương tiện hữu hiệu và nhanh chóng.
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI KEO LAI DÒNG BV75 TRONG NHÂN GIỐNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO Nguyễn Thanh Bình1, Nghiêm Thị Hƣơng2 TĨM TẮT Với ưu điểm vượt trội Keo lai so với loài lâm nghiệp khác mà lồi chiếm phần lớn diện tích trồng rừng Việt Nam Từ nhu cầu giống cho trồng rừng vô lớn Tuy nhiên việc nhân giống phương pháp truyền thống giâm hom, gieo hạt không đáp ứng nhu cầu giống bệnh, đồng phẩm chất Cùng với kết cải thiện giống, công nghệ nhân giống phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) xem giải pháp công nghệ hàng đầu để trì chất lượng di truyền giống Việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng nhân giống in vitro phương tiện hữu hiệu nhanh chóng Cytokinin N6-benzyladenine (BA) hay N6 - benzylaminopurine (BAP) cho khả kích thích nhân chồi Keo lai dòng BV75 với hệ số nhân chồi cao (7,7 chồi/cụm, hệ số nhân chồi 2,96 lần) nồng độ 1,5mg/l môi trường MS* Khi kết hợp Cytokinin Auxin nhân nhanh chồi tổ hợp phù hợp để nhân chồi 1,5mg/l BAP 1,0mg/l NAA (Napthalen acetic acid) môi trường MS* (đạt 7,8 chồi/cụm hệ số nhân chồi 3,0 lần, chiều cao chồi 4,5 cm, chồi sinh trưởng tốt) Đây môi trường cho chất lượng chồi tốt để phục vụ giai đoạn nghiên cứu rễ Như vậy, môi trường phù hợp để nhân giống Keo lai dòng BV75 MS* + 1,5mg/l BAP 1,0mg/l NAA Từ khóa: Keo lai, nhân giống in vitro, chất kích thích sinh trưởng, cytokinin, auxin ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Keo lai (Acacia hybrid) có số đặc điểm vƣợt trội so với rừng khác nhƣ khả sinh trƣởng nhanh giúp làm giảm sức ép lên rừng tự nhiên nhu cầu gỗ cho sản xuất công nghiệp N c khả cố định đạm khí từ đ cải tạo đất tốt, tạo điều kiện thuận lợi việc luân canh Keo lai với trồng khác, giảm nhu cầu sử dụng phân bón, hạ giá thành sản phẩm sản xuất nông lâm nghiệp Với ƣu điểm vƣợt trội Keo lai so với loài lâm nghiệp khác mà loài chiếm phần lớn diện tích trồng rừng Việt Nam Với diện tích trồng lên đến 400.000 ha, bao gồm 220.000 keo lai (Acacia mangium × Acacia auriculiformis), Keo đƣợc trồng phổ biến Việt Nam, trở thành trồng rừng sản xuất Việt Nam [3, 4] Từ đ nhu cầu giống cho trồng rừng vô lớn Tuy nhiên việc nhân giống phƣơng pháp truyền thống nhƣ giâm hom, gieo hạt không đáp ứng đƣợc nhu cầu 1,2 Khoa Nông - Lâm - Ngư nghiệp, Trường Đại học Hồng Đức TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 giống bệnh, đồng phẩm chất Cùng với kết cải thiện giống, công nghệ nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy mô (tissue culture) đƣợc xem giải pháp cơng nghệ hàng đầu để trì chất lƣợng di truyền giống Nuôi cấy mô tế bào phƣơng pháp nhân giống đƣợc thực nuôi cấy quan, mô, tế bào môi trƣờng dinh dƣỡng đặc biệt, hồn tồn vơ trùng đƣợc kiểm sốt Vật liệu đƣợc sử dụng ni cấy thƣờng nhỏ thao tác thí nghiệm thực môi trƣờng nhân tạo nên phƣơng pháp nhân giống đƣợc gọi vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro Phƣơng pháp nhân giống in vitro đ đƣợc sử dụng có hiệu ngành cơng nghệ sinh học rừng tạo số lƣợng lớn giống giống hệt kể kiểu gen kiểu hình, đồng thời khơng chứa mầm bệnh, hỗ trợ tiết kiệm không gian thời gian [1; tr.574] Nhiều loài keo khác (A senegal, A nilotica, A auriculiformis, A.sinuata A mangium) đ đƣợc nhân giống kỹ thuật in vitro thành công [2; tr.663-671] Tuy nhiên, rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, phản ứng kiểu gen với điều kiện môi trƣờng khác thực tế cho thấy giống khác hiệu nhân giống hồn tồn khác cho dù lồi, đ khơng thể áp dụng quy trình chung cho tất giống Keo lai dòng BV75 Trung tâm nghiên cứu giống rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chọn tạo, đ đƣợc công nhận giống tiến kỹ thuật, có tiềm sinh trƣởng tốt thích nghi nhiều loại lập địa khác nhau, đặc biệt thích hợp cho lập địa miền Bắc Để tái sinh chồi keo, loại mẫu cấy khác đƣợc sử dụng nuôi cấy môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trƣởng khác Trong đ nồng độ chất sinh trƣởng có vai trị định đến hệ số nhân chồi Hơn chất chất kích thích sinh trƣởng khác ảnh hƣởng khác đến hệ số nhân chồi Nghiên cứu nhằm xác định loại chất nồng độ phù hợp chất điều tiết sinh trƣởng cho hệ số nhân chồi cao nhân giống in vitro keo lai dòng BV75 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chồi Keo lai in vitro dòng BV75 Trung tâm nghiên cứu giống rừng Ba Vì cung cấp Các chất kích thích sinh trƣởng đƣợc sử dụng nhân giống in vitro thuộc nhóm Cytokinin, bao gồm: N6-benzyladenine (BA, BAP), 6-furfurylaminopurine (kinetin), chất thuộc nhóm auxin, bao gồm: Acid indolacetic (IAA) Napthalen acetic acid (NAA) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm thuộc loại thí nghiệm phịng Tất thí nghiệm phịng sử dụng mơi trƣờng: MS + 7,5 g/l agar + 30g/l saccarose, pH = 5,8 Thí nghiệm gồm công thức, nhắc lại lần, 30 mẫu/lần, đƣợc theo dõi ngày/lần, theo d i liên tục tuần Các thí nghiệm đƣợc tiến hành điều kiện nhân tạo Các mẫu đƣợc nuôi cấy dƣới b ng đèn neol, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, điều kiện tối 8h/ngày, nhiệt độ 22 - 240C, độ ẩm từ 70 - 80% Thu thập số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng số cytokinin đến khả nhân nhanh Keo lai dịng BV75 Cytokinin chất kích thích sinh trƣởng đƣợc dùng phổ biến nhân giống in vitro Chúng c khả kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ thực vật Cytokinin ảnh hƣởng r rệt đặc trƣng lên phân h a quan thực vật, đặc biệt phân h a chồi Để tăng hệ số nhân giống, ngƣời ta tăng nồng độ cytokinin môi trƣờng nuôi cấy giai đoạn tạo chồi in vitro Một cytokinin đƣợc dùng chủ yếu nhân nhanh in vitro N6 - Benzylaminopurine (BAP) Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh chồi Keo lai BV75 đƣợc thể bảng Bảng Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân chồi Keo lai dòng BV75 BAP (mg/l) 1,5 2,0 Số chồi/ cụm TB 4,3 ± 0,28 6,8 ± 0,12 7,7 ± 0,28 7,6 ± 0,28 Chiều cao chồi (cm) 3,0 ± 0,12 3,7 ± 0,16 4,0 ± 0,12 3,8 ± 0,16 Chất lƣợng chồi +++ +++ ++ + Ghi chú: (+) chồi sinh trưởng kém; (++) chồi sinh trưởng trung bình; (+++) chồi sinh trưởng tốt Khi nồng độ BAP tăng lên từ đến 2,0 số chồi cụm tăng dần theo nồng độ từ 4,3 đến 7,6 chiều cao chồi phát triển tăng từ 3,0 đến 3,8 chất lƣợng chồi phát triển tốt Số chồi/cụm hệ số nhân chồi Keo lai dịng BV75 có khác biệt rõ rệt cơng thức thí nghiệm Môi trƣờng MS* bổ sung 1,5 mg/l BAP cơng thức thích hợp để nhân nhanh số lƣợng chồi cho Keo lai dòng BV75 Với nồng độ này, đạt 7,7 chồi/cụm hệ số nhân chồi đạt 2,96 (cao công thức đối chứng 1,31 lần), chiều dài chồi 4,0 cm; chồi sinh trƣởng tốt Ngoài BAP, loại cytokinin khác đƣợc sử dụng để đánh giá khả kích thích nhân chồi Keo lai dịng BV75 Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng kinetin để kích thích nhân chồi keo lai Các nghiên cứu chứng minh, mô nuôi cấy c đủ hàm lƣợng BAP việc bổ sung kinetin vào mơi trƣờng ni cấy kích thích tạo số lƣợng chồi nhiều so với việc bổ sung BAP [2] Do đ thí nghiệm chúng tơi đ sử dụng Kinetin với nồng độ khác để kích nhân nhanh chồi Keo lai Bảng Ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến nhân chồi Kinetin (mg/l) 1,0 1,5 2,0 Số chồi/ cụm TB 4,3 ± 0,2 4,8 ± 0,24 5,7 ± 0,28 5,5 ± 0,36 Chiều cao chồi (cm) 3,0 ± 0,12 3,6 ± 0,16 3,8 ± 0,16 3,7 ± 0,24 Chất lƣợng chồi +++ +++ ++ ++ Ghi chú: (+) chồi sinh trưởng kém; (++) chồi sinh trưởng trung bình; (+++) chồi sinh trưởng tốt Từ kết bảng cho thấy nồng độ kinetin tăng lên từ đến 2,0 số chồi cụm tăng dần theo nồng độ (tăng 4,3 đến 5,5), chiều cao chồi phát triển (tăng 3,0 đến 3,7) chất lƣợng chồi phát triển tốt TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 Số chồi/cụm hệ số nhân chồi giống Keo lai dòng BV75 có khác biệt rõ rệt cơng thức thí nghiệm Mơi trƣờng MS* bổ sung 1,5 mg/l kinetin cơng thức thích hợp để nhân nhanh số lƣợng chồi Với nồng độ này, đạt 5,7 chồi/cụm, chiều dài chồi 3,8 cm, chồi sinh trƣởng tốt Việc kết hợp BAP kinetin nuôi cấy mô cho hệ số nhân chồi đạt kết cao đ đƣợc chứng minh số nghiên cứu trƣớc đây, từ đ chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhân nhanh chồi Keo lai dòng BV75 với kết hợp BAP kinetin nồng độ khác Kết thể bảng Bảng Ảnh hƣởng tổ h p BAP v inetin đến khả nhân chồi BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Số chồi/ cụm TB Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 0 4,3 ± 0,2 3,0 ± 0,12 +++ 1,5 0,5 7,1 ± 0,12 4,4 ± 0,16 +++ 1,5 1,0 6,8 ± 0,08 4,3 ± 0,2 ++ 1,5 1,5 6,5 ± 0,12 4,2 ± 0,08 + Ghi chú: (+) chồi sinh trưởng kém; (++) chồi sinh trưởng trung bình; (+++) chồi sinh trưởng tốt Số chồi/cụm giống Keo lai dịng BV75, có khác biệt rõ rệt cơng thức thí nghiệm Mơi trƣờng MS* bổ sung 1,5 mg/l BAP 0,5 kinetin công thức thích hợp để nhân nhanh số lƣợng chồi cho giống Keo lai dòng BV75 Với nồng độ đạt 7,1 chồi/cụm (cao cơng thức đối chứng 1,08 lần), chiều dài chồi 4,4 cm, chồi sinh trƣởng tốt 3.2 Ảnh hƣởng tổ h p cyto inin v auxin đến khả nhân nhanh chồi Keo lai dòng BV75 Vai trò quan trọng cytokinin kích thích mạnh mẽ phân hóa chồi Chính với auxin, cytokinin điều chỉnh tƣợng ƣu ngọn, giải phóng chồi bên khỏi ức chế tƣơng quan chồi Hiệu phụ thuộc vào tỷ lệ auxin/cytokinin Sự kết hợp auxin cytokinin môi trƣờng nhân chồi với liều lƣợng tỷ lệ hợp lý có tác dụng kích thích chồi phát triển hài hịa số lƣợng chất lƣợng chồi, thân chồi cứng cáp hơn, hàm lƣợng xenllulo tăng, diện tích, số đốt thân tăng lên Nhiều nghiên cứu khác cho thấy chất điều tiết sinh trƣởng thực vật đơn lẻ không gây ảnh hƣởng lớn đến hình thành chồi Tuy nhiên, tiến hành sử dụng kết hợp, hệ số tạo chồi tăng lên cách đáng kể Al-Wasel (2000) thử nghiệm BAP N-phenyl-N0-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea (Thidiazuron TDZ) kết hợp với NAA để kiểm tra ảnh hƣởng kết hợp đến khả nhân chồi giống keo Acacia seyal Kết nghiên cứu cho thấy, NAA khơng thể kích thích phát sinh chồi sử dụng đơn lẻ, khơng bổ sung BAP tạo chồi Tuy nhiên, số lƣợng chồi keo lớn đƣợc tạo sử dụng kết hợp BAP NAA Bảng Ảnh hƣởng tổ h p BAP v NAA đến khả nhân chồi BAP (mg/l) 1,5 1,5 1,5 NAA (mg/l) Số chồi/ cụm TB Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 4,3 ± 0,2 3,0 ± 0,12 +++ 0,5 7,1 ± 0,16 4,4 ± 0,2 ++ 1,0 7,8 ± 0,12 4,5 ± 0,12 +++ 1,5 6,8 ± 0,12 4,4 ± 0,16 ++ Ghi chú: (+) chồi sinh trưởng kém; (++) chồi sinh trưởng trung bình; (+++) chồi sinh trưởng tốt TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 Kết nghiên cứu cho thấy khác biệt số chồi/cụm giống Keo lai (BV75) cơng thức thí nghiệm, thể cơng thức thí nghiệm ảnh hƣởng khơng đồng đến kết nghiên cứu Nuôi cấy mẫu giống Keo lai BV75 môi trƣờng nhân chồi MS* đƣợc bổ sung phối hợp 1,5 mg/l BAP 1,0 mg/l NAA cho số chồi/cụm 7,8 chồi/cụm, chất lƣợng chồi sinh trƣởng tốt Bảng Ảnh hƣởng tổ h p kinetin v NAA đến khả nhân chồi Kinetin (mg/l) NAA (mg/l) Số chồi/ cụm TB Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi 0 4,3 ± 0,2 3,0 ± 0,12 ++ 1,5 0,5 4,68 ± 0,04 3,3 ± 0,12 ++ 1,5 1,0 4,94 ± 0,05 3,2 ± 0,08 ++ 1,5 1,5 4.42 ± 0,07 3,4 ± 0,12 ++ Ghi chú: (+) chồi sinh trưởng kém; (++) chồi sinh trưởng trung bình; (+++) chồi sinh trưởng tốt Nuôi cấy mẫu giống Keo lai BV75 môi trƣờng nhân chồi MS* đƣợc bổ sung phối hợp 1,5 mg/l kinetin 1,0 mg/l NAA cho hệ số nhân chồi số chồi/cụm lần lƣợt 1,9 lần - 4,94 chồi/cụm (đạt giá trị cao nhất) nhƣng không cho chất lƣợng chồi sinh trƣởng tốt So sánh ảnh hƣởng tổ hợp đến khả nhân nhanh chồi Keo lai dòng BV75 phƣơng pháp in vitro cho kết thể bảng Bảng Ảnh hƣởng số tổ h p cytokinin auxin đến khả nhân chồi Keo lai dòng BV75 BAP (mg/l) 1,5 1,5 1,5 0 1,5 1,5 1,5 0 Kinetin (mg/l) 0 0 1,5 1,5 1,5 0 1,5 1,5 1,5 NAA (mg/l) 0,5 1,5 0,5 1,5 0 0 0 IAA (mg/l) 0 0 0 0,5 1,5 0,5 1,5 HSNC (lần) 4,30 7,10 7,80 6,80 4,68 4,94 4,42 6,05 2,97 1,68 4,46 3,04 0,82 Kết thể bảng cho thấy, tổ hợp BAP kinetin với NAA cho kết cao so với kết hợp với IAA Đồng thời việc bổ sung auxin vào môi trƣờng nuôi cấy thích hợp với nồng độ thấp Các cơng thức với nồng độ auxin cao cho kết hệ số nhân chồi thấp nhiều, điều cho thấy nồng độ auxin cao mơi trƣờng ni cấy có sẵn cytokinin khơng khơng kích thích mà cịn kìm hãm khả tạo chồi Keo lai dòng BV75, số mẫu có thấy xuất tạo mơ s o, tƣơng tự với số nghiên cứu trƣớc đ [5; tr.381-368] TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 Kết bảng cho thấy mơi trƣờng MS* có bổ sung 1,5 mg/l BAP 1,0 mg/l NAA tạo đƣợc số chồi c đủ tiêu chuẩn phục vụ cho giai đoạn rễ in vitro KẾT LUẬN Cytokinin N6 - benzylaminopurine (BAP) cho khả kích thích nhân chồi Keo lai dòng BV75 với hệ số nhân chồi cao (7,7 chồi/cụm) nồng độ 1,5mg/l môi trƣờng MS* Khi kết hợp cytokinin auxin nhân nhanh chồi tổ hợp phù hợp để nhân chồi 1,5mg/l BAP 1,0mg/l NAA môi trƣờng MS* (đạt 7,8 chồi/cụm, chiều cao chồi 4,5 cm, chồi sinh trƣởng tốt) Đây môi trƣờng cho chất lƣợng chồi tốt để phục vụ cho giai đoạn nghiên cứu tiếp theo, rễ Nhƣ vậy, môi trƣờng phù hợp cho nhân giống Keo lai dòng BV75 MS* + 1,5mg/l BAP 1,0mg/l NAA TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] Aitken-Christie, J., Kozai, T., Smith, M.A.L., (1995), Automation and Environmental Control in Plant Tissue Culture Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p 574 G Vengadesan, A Ganapathi, S Amutha, N Selvaraj (2002), In vitro propagation of Acacia species/a review, Plant Science, 163 Kha, L.D (2001), Studies on the use of natural hybrids between Acacia mangium and Acacia auriculiformis, Vietnam, Agricultural Publishing House, Hanoi, Vietnam Kha, L.D (2006), Role of Acacia hybrids in the reforestation programme in Vietnam, Research Centre for Forest Tree Improvement, Forest Science Institute of Vietnam, Hanoi, Vietnam Rashmi Nanda, Premananda Das, Gyana Rout (2004), In vitro clonal propagation of Acacia mangium Willd, and its evaluation of genetic stability through RAPD marker, Annals of Forest Science, Springer Verlag/EDP Sciences, 61 (4) THE STUDY OF THE AFFECTION OF PLANT GROWTH REGULATORS ON SHOOT MULTIPLICATION OF ACACIA HYBRID BV75 SUBSPECIES BY IN VITRO METHOD Nguyen Thanh Binh, Nghiem Thi Huong ABSTRACT With the outstanding advantages of Acacia hybrid compared to other forest species, this species currently occupies a large part of Vietnam's afforestation area However, propagation by traditional methods such as cuttings and seeding does not meet the demand for disease-free seedlings, uniform in quality Breeding technology by tissue culture method is considered the leading technology solution to maintain the genetic quality of seedlings 10 TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 49.2020 Plant Growth Regulators are an important factor in increasing shoot multiplier Cytokinin N6-benzyladenine (BAP) has the ability to stimulate the Acacia hybrid BV75subspecies shoot buds with high shoot multiplier (7.7 shoots/clump, shoot multiplier is 2.96 times) at 1.5mg/L in MS * media When using Cytokinin and Auxin combination, the most suitable combination for multiplication is 1.5mg/L BAP and 1.0mg/L NAA in MS * medium (7.8 buds/clump and multiplier buds 3.0 times, bud height is 4.5 cm, buds grow well) This is also the environment for the best quality shoots to serve the next phase of research, rooting Keywords: Acacia hybrid, in vitro method, plant growth regulator, cytokinin, auxin * Ngày nộp bài: 8/7/2019; Ngày gửi phản biện: 19/7/2019; Ngày duyệt đăng: 4/3/2020 11 ... ĐỨC - SỐ 49.2020 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng số cytokinin đến khả nhân nhanh Keo lai dòng BV75 Cytokinin chất kích thích sinh trƣởng đƣợc dùng phổ biến nhân giống in vitro Chúng... loại chất nồng độ phù hợp chất điều tiết sinh trƣởng cho hệ số nhân chồi cao nhân giống in vitro keo lai dòng BV75 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chồi Keo lai in vitro. .. cytokinin khác đƣợc sử dụng để đánh giá khả kích thích nhân chồi Keo lai dòng BV75 Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng kinetin để kích thích nhân chồi keo lai Các nghiên cứu chứng minh, mô