Nghiên cứu tạo chế phẩm aspergillus niger không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc và độc tố ochratoxin a trên cà phê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --- --- ðÀO THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ASPERGILLUS NIGER KHÔNG SINH ðỘC TỐ ðỂ PHÒNG CHỐNG NẤM MỐC VÀ ðỘC TỐ OCHRATOXI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

ðÀO THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ASPERGILLUS NIGER KHÔNG

SINH ðỘC TỐ ðỂ PHÒNG CHỐNG NẤM MỐC VÀ ðỘC TỐ

OCHRATOXIN A TRÊN CÀ PHÊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Trần Thị Mai

TS Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM đOAN

Tôi xin cam ựoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ựược sử dụng ựể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ựoan mọi sự giúp ựỡ cho việc thực hiện luận văn ựã ựược cảm

ơn và các thông tin trắch dẫn luận văn ựã ựược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

đào Thị Hương

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ựã nhận ựược sự hướng dẫn, giúp ựỡ và góp ý nhiệt tình của anh chị em ựồng nghiệp tại Bộ môn nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch Ờ Viện Cơ ựiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch Và sự hướng dẫn, góp ý của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ Bộ môn Công nghệ vi sinh Ờ Khoa Công nghệ Sinh học Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ựến quý thầy cô Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, ựặc biệt là những thầy cô ựã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ựến TS Trần Thị Mai và TS Nguyễn Văn Giang ựã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS TS Nguyễn Thùy Châu và ThS Nguyễn Văn Nguyện - Viện Cơ ựiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch là chủ nhiệm ựề tài nghiên cứu và dự án ỘHoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ựể phòng chống nấm sinh ựộc tố và ựộc tố nấm mốc trên ngô, lạc, cà phêỢ cùng anh chị em ựồng nghiệp ựã tạo mọi ựiều kiện ựể tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn gia ựình và bạn bè ựã tạo rất nhiều ựiều kiện, giúp ựỡ tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Hà Nội, Ngày 03 tháng 04 năm 2013

Học viên

đào Thị Hương

2.1.1 ðại cương về cây cà phê Robusta 4

2.3 Sự tạo ñộc tố và sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản 11

2.3.1 Sự tạo ochratoxin A bởi nấm mốc 11

2.3.2 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A 12

2.3.3 Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm 14

2.3.4 Mức ñộ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và ñộc tố ochratoxin A trên

2.3.5 Sự tạo ñộc tố của A niger 17

2.4.1 Tình hình phòng chống ñộc tố ochratoxin A trên thế giới 21

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt nam 22

2.5.1 Biện pháp ngăn ngừa, hạn chế ñộc tố nấm mốc 22

2.5.2 Khử nhiễm ochratoxin A bằng hấp phụ sinh học 23

2.5.3 Phòng chống ochratoxin A phương pháp ñối kháng cạnh tranh 24

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu: 26

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích ochratoxin A 28

3.2.2 Phương pháp xác ñịnh mức ñộ nhiễm mốc trên cà phê 28

3.2.3 Phương pháp phân lập nấm mốc 29

3.2.5 Phương pháp ñịnh lượng mật ñộ Aspergillus niger trong cơ chất

nuôi cấy và trong chế phẩm 31

3.2.6 Phương pháp xác ñịnh nhanh chủng nấm sinh và không sinh ñộc

tố tiến hành theo phương pháp của K Yabe và cộng sự 32

3.2.7 Xác ñịnh sự tạo orchratoxin A của các chủng Aniger 32

3.2.8 Phương pháp phân tích ochratoxin A trong cà phê 32

3.2.9 Phương pháp xác ñịnh khả năng giảm ochratoxin A bằng các

chủng A niger không sinh ochratoxin A 36

3.2.10 Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger ở qui mô phòng thí nghiệm 36

3.2.11 Phương pháp sản xuất bào tử A niger ở qui mô 100kg/mẻ 36

3.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm AN 37

3.2.13 Phương pháp bố trí thí nghiệm với cà phê ngoài ñồng ruộng 37

3.2.14 Phương pháp theo dõi năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 38

3.2.15 Kiểm tra chất lượng chế phẩm mốc sau thời gian bảo quản 38

3.2.16 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38

4.1 Xác ựịnh khả năng sinh ựộc tố ochratoxin A của các chủng A niger 39

4.2 Nghiên cứu khả năng cạnh tranh, giảm ựộc tố của các chủng A niger

không sinh với các chủng sinh OTA hàm lượng cao 42

4.2.1 Hiệu quả giảm ựộc tố OTA của chủng sinh ựộc tố cao bằng các

4.2.2 đánh giá khả năng cạnh tranh của chủng A niger AN2 với chủng

A niger pec2 sinh ựộc tố ochratoxin A cao 44

4.3 Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi tạo chế phẩm AN chứa chủng

A niger AN2 phòng chống nấm mốc và ựộc tố ochratoxin A trên cà phê 45

4.3.1 điều kiện lên men và thời gian thu hồi sinh khối A niger AN2 45

4.3.2 Nghiên cứu công nghệ nuôi cấy bề mặt sản xuất bào tử chủng

A niger AN2 quy mô phòng thắ nghiệm 46

4.3.3 Nghiên cứu sản xuất bào tử A niger AN2 ở quy mô 100 kg/mẻ 50

4.3.4 Qui trình sản xuất chế phẩm AN từ chủng A niger AN2

ựể phòng chống nấm mốc và ựộc tố ochratoxin A nhiễm trên cà phê 52

4.5.1 Hiệu quả của chế phẩm AN ựến bệnh do nấm, sinh trưởng và

năng suất cà phê tại vùng thử nghiệm 56

4.5.2 Hiệu quả phòng chống nấm mốc và ựộc tố ochratoxin A trên cà

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 VSV: vi sinh vật

2 OTA: ochratoxin A

3 A niger: Aspergillus niger

4 KLPT: khối lượng phân tử

5 KPHð: không phát hiện ñược

DANH MỤC BẢNG

2.1 Thành phần hữu cơ, vô cơ và khoáng trong ñất trồng cà phê tại

2.2 Giới hạn nhiễm OTA cho phép trong 1 số sản phẩm 16

4.1 Khả năng sinh OTA của các chủng Aspergillus niger phân lập từ

cà phê và ñất trồng cà phê 39

4.2 Hiệu quả giảm OTA của chủng A niger pec2 bằng các chủng A

4.3 Mật ñộ bào tử của chủng A niger AN2 tạo ñược trên các môi

4.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới mật ñộ bào tử A niger AN2 50

4.8 Ảnh hưởng của ñộ dày khối ủ tới mật ñộ bào tử A niger AN2 51

4.9 Mật ñộ bào tử A niger AN2 trong chất mang ở các thời gian bảo

4.10 Tỉ lệ rụng quả và năng suất trên cây cà phê 57

4.11 Mật ñộ các vi sinh vật có khả năng sinh OTA trong ñất 58

4.12 Tỷ lệ nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và hàm lượng OTA trong hạt

cà phê sau thu hoạch và sau các thời gian bảo quản khác nhau 59

4.13 Kết quả phân tích chế phẩm bào tử mốc chủng A niger AN2 61

4.14 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản chế phẩm ñến mật ñộ bào tử

4.15 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản chế phẩm ñến hoạt tính giảm

4.1 Chủng A niger Pec2 và chủng A niger AN2 40

4.2 Xác ñịnh khả năng sinh ñộc tố của các chủng bằng phương pháp

4.3 Sắc kí ñồ HPLC chủng AN pec2 42

4.4 Sắc kí ñồ HPLC chủng AN2 42

4.5 Khả năng cạnh tranh của chủng A niger AN2 không sinh ñộc tố

và chủng A niger pec2 sinh ñộc tố OTA cao 45

4.6 ðường cong sinh trưởng của chủng A niger AN2 46

4.7 Hiệu quả thử nghiệm trên cà phê sau 12 tháng bảo quản 60

4.8 Sắc ký ñồ hàm lượng ochratoxin A cà phê trong lô thí nghiệm,

DANH MỤC ðỒ THỊ

4.1 Mật ñộ bào tử AN2 tạo ñược trên các môi trường khác nhau 72

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến khả năng tạo bào tử AN2 72

4.3 Ảnh hưởng ñộ ẩm môi trường ñến khả năng tạo bào tử A niger AN2 73

4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ñến mật ñộ bào tử A niger AN2 73

4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống ñến mật ñộ bào tử A niger AN2 74

4.6 Ảnh hưởng ñộ dày khối ủ ñến mật ñộ bào tử A niger AN2 74

4.7 Lựa chọn chất mang phù hợp cho sản xuất bào tử A niger AN2

ở thời gian bảo quản khác nhau 75

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Ở nước ta, cây cà phê ñược trồng rộng rãi ñóng vai trò trọng yếu và có giá trị kinh tế rất cao Theo Tổng cục thống kê, tính ñến năm 2005, diện tích trồng cà phê ở nước ta là khoảng 450 000 ha Thống kê của Hiệp hội cà phê cacao Việt Nam Vicofa cho biết hiện nay cả nước ta có khoảng 530 000 ha ñất trồng cà phê, tập trung chủ yếu tại các tỉnh Tây Nguyên trong ñó ðắc Lắc

là tỉnh có diện tích cà phê cao nhất nước khoảng 190.765 ha (Vicofa, 2005)

Với khí hậu nóng ẩm, là ñiều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây tổn thất lớn cho cà phê ở giai ñoạn sau thu hoạch và sinh ra các ñộc tố ñặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và ñộng vật kinh tế, trong ñó ñộc tố Ochratoxin A nhiễm phổ biến trên cà phê ðộc tố Ochratoxin A nhiễm ở mức

ñộ thấp, làm giảm sức ñề kháng, gây bệnh cho người, làm giảm năng suất vật nuôi, khi nhiễm ở mức ñộ cao có thể gây ung thư

Theo nghiên cứu của Z Ilic và cộng sự , kết quả cho thấy 93% các mẫu

cà phê nhiễm nấm mốc chủ yếu là A niger và 8,7% trong số ñó sinh ñộc tố

ochratoxin A (Z Ilic & cs, 2007) Nghiên cứu của S L Leong và cộng sự về

cà phê Việt Nam cũng cho thấy hầu hết các mẫu kiểm tra ñều nhiễm nấm mốc

trong ñó chủ yếu là nhiễm A niger (S.L.Leong & cs, 2004) Theo báo cáo của Nguyễn Văn Thường, hầu hết các mẫu cà phê nhiễm nấm mốc A niger, nhiều

mẫu kiểm tra phát hiện ochratoxin A ở mức 3-6ppb, tuy vậy hàm lượng ñộc tố này có thể sẽ tăng lên trong quá trình bảo quản (Nguyễn Văn Thường & cs, 2006) Nguyễn Thùy Châu và cộng sự ñã kiểm tra cà phê tại khu vực Tây

Nguyên sau 1 tháng bảo quản hầu hết nhiễm nấm mốc A niger sinh

ochratoxin A, 20% các mẫu khi phân tích chứa ochratoxin A với hàm lượng

từ 1-10ppb (Nguyễn Thùy Châu & cs, 2010)

Trên thế giới, việc nghiên cứu mức ñộ nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm

mốc trên lương thực, thực phẩm là vấn ựề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và các ựộng thực vật kinh tế Giới hạn về mức ựộ nhiễm Ochratoxin A ựã là một trong những tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các quốc gia

đã có nhiều phương pháp nghiên cứu, áp dụng ựể loại bỏ ochratoxin A bằng hóa chất, chiếu xạ Các phương pháp này mang lại hiệu quả nhưng làm tổn hại ựến chất lượng nông sản, dư lượng hóa chất sau xử lý cũng là một vấn

ựề gây mất an toàn thực phẩm Ngày nay, việc loại bỏ nấm mốc sinh ựộc tố và ựộc tố nấm mốc ngay từ trước thu hoạch bằng các chủng nấm mốc ựối kháng ựang ựược quan tâm Việc phòng chống nấm mốc sinh ochratoxin A ựã ựược nhiều nhà khoa học của các nước nghiên cứu Các tác giả như Ringot và

Bejaoui cho thấy chủng A niger không sinh ựộc tố ựã có khả năng ức chế chủng A niger, A ochraceus và Penicillium sinh ochratoxin A theo cơ chế

cạnh tranh Kết quả này ựã ựược cộng ựồng châu Âu công nhận và khuyến

cáo sử dụng chủng A niger không sinh ựộc tố ựể phòng chống ochratoxin A

trên ngô ở giai ựoạn ngoài ựồng (Ringot, 2006; Bejaoui , 2006)

Ở nước ta, công tác vệ sinh an toàn lương thực, thực phẩm ựã có những tiến bộ rõ rệt và ngày càng ựược chú ý nhưng các biện pháp phòng trừ ựộc tố mốc chủ yếu tập trung vào hoá chất Trong khi ựó, vấn ựề an toàn vệ sinh thực phẩm và ô nhiễm môi trường ựang trở thành mối quan tâm lớn Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm sinh học trong phòng chống nấm sinh ựộc

tố và ựộc tố nấm mốc là rất cấp thiết Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi

tiến hành ựề tài: ỘNghiên cứu tạo chế phẩm Aspergillus niger không sinh ựộc

tố ựể phòng chống nấm mốc và ựộc tố ochratoxin A trên cà phêỢ

1.2 Mục tiêu

đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm Aspergillus niger không sinh ựộc tố giảm mức nhiễm nấm mốc và ựộc tố nấm mốc ochratoxin A trên cà phê tới mức cho phép theo tiêu chuẩn của Tổ chức Lương thực thế giới và Tổ chức

Y tế thế giới, chất lượng sản phẩm thay ựổi không ựáng kể ựảm bảo vệ sinh

an toàn thực phẩm, giảm ô nhiễm môi trường

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu mức ựộ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A và xác ựịnh

khả năng tạo ựộc tố ochratoxin A các chủng phân lập trên cà phê và ựất trồng

cà phê ở các vùng trọng ựiểm

- Nghiên cứu khả năng cạnh tranh của các chủng Aspergillus niger

không sinh ochratoxin A với các chủng sinh ochratoxin A hàm lượng cao

- Nghiên cứu công nghệ nhân nuôi, tạo chế phẩm bào tử Aspergillus

niger ựối kháng không sinh ochratoxin A ở quy mô phòng thắ nghiệm và quy

mô pilot 100kg/mẻ

- đánh giá an toàn của chế phẩm tại Khoa Dược lý - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Ờ Bộ Y tế

- Thử nghiệm và ựánh giá hiệu quả chế phẩm chứa Aspergillus niger

không sinh ochratoxin A trên cà phê

2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu cây cà phê và ñất trồng cà phê

2.1.1 ðại cương về cây cà phê Robusta

Cà phê Robusta (hay còn gọi là cà phê Vối) tên khoa học: Coffea canephora hoặc Coffea robusta là cây quan trọng thứ hai trong các loài cà phê Khoảng 39% các sản phẩm cà phê ñược sản xuất từ loại cà phê này

Nước xuất khẩu cà phê Vối lớn nhất thế giới là Việt Nam Các nước xuất khẩu quan trọng khác gồm Coote d’Ivoire, Uganda, Brasil, Ấn ðộ

Ở Việt Nam, từ năm 1930, cây cà phê bắt ñầu ñược trồng thành những ñồn ñiền ñể khai thác nhân Từ ñó ñến nay, diện tích, năng suất và sản lượng

cà phê ở nước ta ñã không ngừng tăng lên

Những vùng trồng cà phê tập trung chính ở nước ta có ðắc Lắc, Lâm ðồng, ðồng Nai, Gia Lai, Bình Phước , một số tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn

2.1.2 ðặc ñiểm cây cà phê

2.1.2.1 ðặc tính sinh học cây cà phê

Cây cà phê có 3 loại rễ: Rễ cọc có ñộ dài từ 0,3-0,5 m, mọc từ thân chính;

rễ nhánh là những rễ nhánh mọc ra từ rễ cọc, ăn sâu xuống ñất tới 1,2- 1,5 m; rễ con hầu hết tập trung ở tầng ñất mặt (từ 0-30 cm) Cây cà phê thân gỗ, cành mọc

từ thân chính gọi là cành cơ bản (cành cấp 1), cành mọc từ cành cấp 1 gọi là cành thứ cấp (cành cấp 2) Trong ñiều kiện chăm sóc tốt, các cành cơ bản của cây cà phê bắt ñầu xuất hiện sau trồng 20 – 40 ngày Lá có tuổi thọ từ 7 – 10 tháng, lá, cành và thân cà phê là nơi dự trữ các nguồn dinh dưỡng ñể tạo hoa và nuôi dưỡng sự phát triển của quả Hoa cà phê mọc ra ở các chồi nách lá của cành

sơ cấp và cành thứ cấp cà phê Robusta thụ phấn theo hình thức giao phấn và không ra hoa lại ở những ñoạn cành (hoặc nách lá) ñã ra hoa năm trước

Sau khi thụ phấn, quả phát triển nhanh, thường quả cà phê có 1-2 nhân (tùy theo lượng nước tưới và chế ñộ dinh dưỡng) Thời gian sinh trưởng ñối với quả cà phê Vối thường từ 9-11 tháng (tuỳ theo ñiều kiện chăm sóc) Năng suất cà phê Robusta ñạt khá cao 2300 – 4000 kg hạt/ha; hàm lượng cafein 1,7 – 4,0 % (Vicofa, 2005)

2.1.2.2 Thu hoạch và bảo quản cà phê

Niên vụ cà phê Robusta ñược tính từ tháng 10 ñến hết tháng 9 dương lịch năm sau Thời gian thu hoạch tại các tỉnh Tây Nguyên thường kéo dài trong 4 tháng, tính từ cuối tháng 10 ñến hết tháng 1 Cà phê hái xong phải chế biến ngay Nếu không kịp phải tãi quả cà phê trên nền gạch thoáng mát, tầng không quá dày 30 – 40 cm Không ủ ñống cà phê làm cho cà phê lên men Không giữ cà phê hái về quá 24h Cà phê chỉ bảo quản khi ñạt ñộ ẩm khoảng 12,5% tránh sự xâm nhiễm của nấm mốc và ñộc tố nấm mốc

2.1.2.3 Tình hình sản xuất và xuất khẩu cà phê ở Việt Nam

Tổ chức Cà phê Quốc tế (ICO) trụ sở tại London cho biết sản lượng cà phê niên vụ 2011/12 của Việt Nam tăng lên mức 21 triệu bao 60kg, hay 15,8% của sản lượng toàn cầu

Số liệu và các sự kiện về sản lượng và xuất khẩu cà phê của Việt Nam

ñối với năm niên vụ hiện nay kết thúc vào tháng 9 Việt Nam là nhà sản xuất

cà phê lớn thứ hai thế giới sau Brazil và ñứng ñầu về sản lượng robusta

Xuất khẩu cà phê của Việt Nam lên mức kỷ lục gần 1,6 triệu tấn trong niên vụ 2011/12 sau khi ước tính 1,51 triệu tấn ñược xuất trong giai ñoạn tháng 10/2011 ñến tháng 8/2012 (Vicofa, 2005)

2.1.3 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê

2.1.3.1 Hệ vi sinh vật trong ñất trồng cà phê

Tại ðăc Lăc, phần lớn diện tích ñất là ñất ñỏ bazan nâu ñỏ hình thành

và phát triển trên các cao nguyên bazan phần lớn có ñộ dốc thấp, tầng ñất mịn dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khi ẩm, ñộ xốp trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt Rất thích hợp với các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao như cà phê

Hệ vi sinh vật chủ yếu trong ñất ñỏ bazan nâu ñỏ là hệ vi sinh vật phân giải lân trong ñó phải kể tới sự có mặt của các nấm mốc

Các nghiên cứu của Cục Khảo sát ñịa chất Hoa Kỳ cho thấy: các chủng

vi khuẩn ñặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus các chủng nấm thuộc loài Penicillium, Aspergillus có khả năng phân giải các phosphat khó tan

trong ñất nên chúng tồn tại khá phổ biến trong nguồn ñất ñỏ bazan (U.S Department of the Interior, 2001)

Sự có mặt của các loài nấm mốc ñặc biệt là Penicillium, Aspergillus

trong ñất là nguyên nhân dẫn tới sự nhiễm nấm mốc và ñộc tố nấm mốc trên

cà phê và ñất trồng cà phê Những nghiên cứu gần ñây cho thấy một số chủng

của chi Aspergillus và Penicillium có khả năng tạo ñộc tố ochratoxin trên cà phê (Dahman-levinson & cs, 2006)

2.1.3.2 ðặc ñiểm ñất trồng cà phê tại huyện Cư Kuin – ðắc Lắc

Bảng 2.1 Thành phần hữu cơ, vô cơ và khoáng trong ñất trồng cà phê

tại huyện Cư Kuin – ðắc Lắc

ðộ xốp,

55-80 1.20 2.69 59.5 33.2 5.4 15.5 24.4 54.7 80-105 1.11 2.70 59.1 40.4 31.7 29.1 17.6 21.6

Tổng số % Dễ tiêu,

mg/100g

ðộ chua, cmol(+)/kg pH

Cation trao ñổi, cmol (+)kg ñất CEC, cmol

Nguồn: Viện Nông hóa Thổ nhưỡng

2.2 ðộc tố Ochratoxin A

2.2.1 Nguồn gốc ñộc tố ochratoxin

Ochratoxin là nhóm ñộc tố ñược sinh ra bởi 1 số chủng nấm mốc thuộc

các chi Aspergillus và Penicillium và là loại ñộc tố có tiềm năng gây ung thu,

viêm thận cho người và ñộng vật ðộc tố này ñược phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau như ngũ cốc và các sản phẩm của chúng

Ochratoxin là một nephotoxin lần ñầu tiên ñược tìm thấy ở nấm mốc

Aspergillus ochraceus vùng Nam Phi, trên hạt lúa bị nhiễm mốc (van der Merwe & cs, 1965) Ở Anh chúng ñược tìm thấy ở ngô, bột ngô và bột cacao,

ở ðức tìm thấy ochratoxin trong thịt Tuy nhiên ở các nước nhiệt ñới Ochratoxin có nhiều trong cà phê

Nakajima năm 1997 ñã ghi nhận tỷ lệ 30% nhiễm hàm lượng ochratoxin A từ 0,1 – 17,4 µg/kg cà phê nhân ñược nhập vào Nhật Bản từ Châu Phi và các nước Asian Một số nhà nghiên cứu còn phân tích ñược ochratoxin trên và phê rang (H Tsubouchi 1988) và một số công trình cho biết rằng có thể loại bỏ 78% hàm lượng ochratoxin nhờ quá trình rang cà phê

ở 2000 C trong 20 phút

2.2.2 Các loại ñộc tố ochratoxin

Có 7 loại ñộc tố ochratoxin ñược phát hiện tuy nhiên có 3 loại ñược nghiên cứu nhiều là ochratoxin A, ochratoxin B và ochratoxin C

* Ochratoxin A: Công thức phân tử C20H18ClNO6; ochratoxin A ñộc là

do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân izocumarin khi phân hủy nó tạo ra dyhydro – izocumarin ñây là chất gây ñộc

* Ochratoxin B: Công thức phân tử C20H19NO6 là dẫn xuất dechloro ochratoxin A

* Ochratoxin C: Công thức phân tử C20H22ClNO6 là ethyl este của ochratoxin A

Trong các loại trên, ochratoxin A ñược nghiên cứu nhiều nhất do ñặc tính gây ung thư và viêm thận cũng như sự nhiễm phổ biến của nó trên ngũ cốc Ochratoxin A gây ñộc nhiều và mạnh hơn ochratoxin B và ochratoxin C

do ñó ñược xem là ñối tượng chính cho việc xác ñịnh ochratoxin (van der Merwe & cs, 1965)

2.2.3 Tính chất ochratoxin

Ochratoxin là hợp chất tinh thể màu trắng, ít tan trong nước, tan trong

các dung môi hữu cơ như benzen, clorofrom, axetonnitrin ; không tan trong các dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ethyl eter, eter dầu hỏa

Hầu hết ochratoxin phát huỳnh quang màu xanh ở bước sóng λ = 460

nm dưới ñèn tử ngoại UV Ochratoxin có thể bảo quản trong etanol ở nhiệt ñộ thấp trong vài năm mà không bị phân hủy (van der Merwe et al, 1965)

ðặc tính lý hóa của các ochratoxin

Ochratoxin KLPT λ max

hấp thu

ðiểm nóng chảy ( 0 C)

ε (l.mol -1 Cm -1 )

Ánh sáng huỳnh quang

Thận là cơ quan nhạy cảm nhất ñối với ochratoxin A như có thể gây ra thương tổn cấp tính cũng như mãn tính cho thận Thêm vào ñó, tác dụng của ñộc tố ñối với hệ miễn dịch và tác dụng gây quái thai của ochratoxin cũng ñã ñược xác ñịnh Ochratoxin A cũng là một chất có khả năng gây ung thư Thí nghiệm cho chuột uống ochratoxin A trong hai năm ở các liều từ 3500-6000 µg/kg trọng lượng cơ thể chuột cái và 70µg/kg trọng lượng cơ thể/ ngày ở chuột ñực, ñã kích thích tạo các u ở thận (Abbas Z & cs, 2013)

Tác dụng ñầu tiên của ochratoxin A vào cơ thể là ức chế sinh tổng hợp protein Tác dụng là ñặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin tRNAPhe là quá trình cần thiết cho các bước acyl hoá axit amin cơ bản trong sinh tổng hợp protein

Khi phân tích huyết thanh người, nhận thấy ochratoxin A ñạt tới 40 mg/ml huyết thanh Sự dao ñộng ở mức ñộ nhiễm ñã liên quan tới ñịa lý, mùa,

sự thay ñổi hàng năm của hàm lượng ochratoxin A ở các sản phẩm thực phẩm Bệnh thận ñịa phương của vùng Balkan là một bệnh nghiêm trọng, chẳng hạn như vùng Vratza ở Bungary, với cách bảo quản truyền thống, ñã là vùng có tỷ lệ này rất cao (T Petkova-Bocharova & cs, 2003)

Ochratoxin A ñộc là do sự ghép một nhân phenylalanin và một nhân izocumarin khi phân hủy tạo ra chất dehydroizocumarin ñây là chất gây ñộc (Harris và Mantle, 2001) Tác dụng của ñộc tố này ảnh hưởng ñến sức khỏe con người và gây tổn thất trong chăn nuôi gia súc Ochratoxin A tác ñộng lên thận gây

ra các ñợt bộc phát bệnh thận ở ñộng vật và là tác nhân gây tổn thất về mặt kinh tế Ochratoxin A là loại ñộc tố nguy hiểm nhất cho người và vật nuôi

Liều ñộc cấp tính LD50 của Ochratoxin A ñối với vịt con 1 ngày tuổi là

25 µg/con theo ñường miệng, với chuột ñực là 22 mg/kg và chuột cái là 20 mg/kg, ñối với lợn 1,0-6,0 mg / kg Gà bị nhiễm ochratoxin A ở nồng ñộ thấp chậm thành thục sinh dục và ñẻ ít trứng, ở nồng ñộ cao gây rối loạn gan thận

và làm chết gà ðối với vịt khi bị nhiễm ochratoxin A sẽ bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận Ochratoxin A gây sẩy thai ở cả ñộng vật thí nghiệm và ñộng vật chăn nuôi như lợn, bò (O'Brien và Dietrich, 2005)

2.3 Sự tạo ñộc tố và sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản

2.3.1 Sự tạo ochratoxin A bởi nấm mốc

Ochratoxin A thu ñược ñầu tiên từ Aspergillus ochraceus, nhưng những

nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và

Penicillium có thể tạo các ochratoxin

- Các nấm mốc tạo ochratoxin ở chi Aspergillus gồm: A ochraceus, A

alliaceus, A elegans, A fresenii, A melleus, A ostianus, A petrakii, A screotium, A Sulphureus (Pardo et al, 2005) Sản sinh ochratoxin chủ yếu trên

các loại hạt, ñậu phộng khô, ñậu, hạt tiêu, hạt cà phê xanh và hoa quả khô

- Các nấm mốc tạo ochratoxin ở chi Penicillium gồm: P verrucosum, P

viridicatum, P chrysogenum, P conmune, P cyclopium, P expansum, P palitans, P purpurescence, P nordiceum, P Variable (Pitt et Hocking, 1997), chủ yếu gây ô nhiễm trên hạt ngũ cốc

- Ochratoxin A ñược sinh ra bởi các loài nấm mốc Aspergillus niger chủ

yếu nhiễm trên ngũ cốc, hạt có dầu, thức ăn chăn nuôi và cà phê (Abarca et al Năm 1994; Belli et al, 2004.)

Việc phòng chống nấm mốc A niger và A ochraceus sinh ochratoxin A

trên ngô và cà phê ñã ñợc nhiều nhà khoa học của các nước như Brazin, Pháp,

Mỹ nghiên cứu Fernado E và Francisco ñã phát hiện rằng trong số 11 chủng

Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo ochratoxin

A là P brevicompactum, P crustosum , P olsonii and P Oxalicum (Fernando,

Francisco, 2006)

Ochratoxin ñược tạo ở nhiệt ñộ tối thích từ 20°C ñến 30°C và hoạt tính 0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt ñộ thấp 15°C, hàm ẩm yêu cầu cao hơn aw= 0.997 hay 52% hàm lượng nước Các

loài nấm mốc Penicillium thường tạo ochratoxin trong ñiều kiện nhiệt ñộ thấp, chẳng hạn P viridicatum có khả năng tạo ochratoxin A ở 5°C – 10°C Trong khi ñó, các loài thuộc Aspergillus tạo ochratoxin ở nhiệt ñộ cao hơn

2.3.2 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A

Dựa trên một mô hình ñồng phân hóa học theo cấu trúc của OTA một con ñường sinh tổng hợp ñã ñược ñề xuất trước ñây, theo ñó phần dị vòng OTA là cấu trúc tương tự mellein Vì vậy mellein ñã ñược ñề xuất như một tiền chất của OTA Ngược lại, (Harris , Mantle, 2001) ñã mô tả trong các thí nghiệm với các tiền chất ñánh dấu phóng xạ của OTA mellein dường như ñóng một vai trò không quan trọng trong con ñường sinh tổng hợp OTA Tuy nhiên, việc thí nghiệm ñánh dấu phóng xạ bằng cách sử dụng cả hai tiền chất ñánh dấu phóng xạ là 14C và 13C- cho thấy rằng phân nửa phenylalanine bắt

nguồn từ con ựường shikimate và phân nửa dihydroisocoumarin từ con ựường pentaketide Bước ựầu tiên trong tổng hợp polyketide isocoumarin bao gồm

sự ngưng tụ của một ựơn vị acetate (acetyl-CoA) ựến bốn ựơn vị malonate (Hình 2.1)

Dữ liệu gần ựây cho thấy bước này ựòi hỏi hoạt ựộng của một tổng hợp polyketide (OỖCallaghan et al, 2003) Hơn nữa, các bảng mã tổng hợp gene

polyketide xuất hiện rất khác nhau giữa các loài Penicillium and Aspergillus

(OỖ Callaghan & cs, 2003;)

đã có nhiều nghiên cứu về sản phẩm cuối cùng trong con ựường sinh tổng hợp polyketide theo một phương pháp phản ứng cơ bản Chìa khóa xây dựng các bước phản ứng này là ngưng tụ decarboxylative tương tự như bước kéo dài chuỗi các quá trình sinh tổng hợp acid béo trước ựây (Kao & cs, 1994) Trong quá trình sinh tổng hợp của hầu hết các chất chuyển hóa polyketide, kế tiếp bước ngưng tụ tiền thân carbon của axit ựược xúc tác bởi một nhóm các hệ thống ựa chức năng enzyme ựược gọi là polyketide synthases (PKSs), (Metz & cs, 2001)

Một PKS ựiển hình của nấm (Hình 2.1) bao gồm ketosynthetase (KS), acyltransferase (AT) và acyl hóa protein (ACP) và có thể có dehydratase (DH), enoyl reductase (ER), ketoreductase (KR) và thioesterase (TE) (Graziani & cs, 2004) Sự hiện diện hay vắng mặt của các phản ứng trong một PKS quyết ựịnh về loại polyketide hình thành PKSs sản xuất cao giảm polyketides có thể tùy chọn trong những KR, DH và ER; PKSs sản xuất một phần polyketides giảm chứa KR hoặc DH, trong khi PKSs sản xuất polyketides không giảm thì không hề chứa các dạng này (Fujii & cs, 2001)

Hình 2.1 Con ñường sinh tổng hợp ochratoxin A

2.3.3 Sự nhiễm ochratoxin A trên nông sản thực phẩm

Ochratoxin A ñã ñược tìm thấy trên các loại nông sản như ngô, lạc, lúa

mì, ñại mạch, cà phê, bia, nho, các loại thức ăn gia súc Ochratoxin A ñã tìm thấy trong máu của người ở các nước như Bulgari, Hungari, Nhật bản,

Canada Sự cộng nhiễm aflatoxin B1, fumonisin, ochratoxin A và zearalenon trên các loại ngũ cốc và lạc ở Cordivoir Kết quả cho thấy trong 30 mẫu phân tích, 86% mẫu nhiễm cả 4 loại ñộc tố Các tác giả cũng ñã nghiên cứu sự nhiễm ochratoxin A trên lúa miến, ngô, gạo và lạc ở Cordivoir từ năm 1998 ñến 2002 Kết quả cho thấy trong 33 mẫu ngô, 10 mẫu gạo và 10 mẫu lạc phân tích, loại trừ 4 mẫu lạc, tất cả các mẫu ñã nhiễm ochratoxin A từ 3 ñến

1738 µg/ kg, trong ñó hàm lượng ochratoxin A trong lúa miến dao ñộng từ 17- 204 µg/ kg, trong ngô từ 3-1738 µg/ kg, trong gạo từ 9- 92 µg/ kg và trong lạc từ 0,6 – 64µg/ kg

Gần ñây, Bộ nông nghiệp Anh ñã khảo sát cà phê ở một vài nước ñã tìm thấy phạm vi nhiễm ochratoxin A và mức ñộ nhiễm ochratoxin A trên các mẫu khảo sát là gần giống nhau

Pihet và cộng sự 1996 ñã khảo sát sản phẩm cà phê ở nước Anh ñã kết luận rằng một cốc cà phê sẽ cung cấp xấp xỉ 2,2mg ochratoxin A hay 0,03ng/kg trọng lượng cơ thể, các tác giả ñã giải thích rằng lượng ochratoxin A ít hơn 160 lần trọng lượng cơ thể là an toàn (Pihet & cs, 1996)

Jorgensen ñã xem xét mức ñộ nhiễm ochratoxin A ở các mẫu cà phê rang

ở các cửa hàng bán lẻ tại ðức và ñã tìm thấy ở tất cả các mẫu ñều bị nhiễm ở mức ñộ thấp (Jorgensen, Jacobsen, 2002) Gần ñây, năm 2002 Fazekas và cộng sự ñã khảo sát mức ñộ nhiễm ochratoxin A của cà phê Hungari Nồng ñộ trung bình của ochratoxin A trong 50 mẫu cà phê là: cà phê rang 0,5µg/kg, cà phê pha 0,72 µg/kg và tất cả các mẫu hỗn hợp 0,57 µg/kg Các mức ñộ nhiễm ochratoxin A này thấp hơn nhiều so với mức ñộ cho phép tối ña là 10 µg/kg trong cà phê rang ở Hungary (Fazekas & cs, 2002) Theo Taniwaki và cộng

sự năm 2003 ñã báo cáo mức ñộ nhiễm ochratoxin A trong các mẫu cà phê màu anh ñào và mầu ñậm từ 4 vùng Brazil Phần lớn các mẫu ñều nhiễm ochratoxin A ở mức ñộ thấp hơn giới hạn cho phép (Taniwaki & cs, 2003)

Chính vì sự nguy hiểm của ochratoxin A mà tổ chức lương thực thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) ñã có những chương trình khuyến cáo

về phòng chống ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc

và ñưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A Các quốc gia trên thế giới cũng ñã ñưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A trên lương thực thực phẩm và thức ăn gia súc cho quốc gia của mình và ñối với thực phẩm cho người giới hạn cho phép là 5 µg/kg Mức nhiễm Ochratoxin A cũng ñã trở thành một trong những chỉ tiêu xuất khẩu nông sản của các hợp ñồng thương mại quốc tế (FAO/WHO/UNEP, 1999)

Bảng 2.2: Giới hạn nhiễm OTA cho phép trong 1 số sản phẩm

mùa sinh trưởng, các mẫu mua từ thị trường, các cửa hàng, các hộ gia ñình và các nhà cung cấp cung cấp Kết quả cho thấy có tới 93% các mẫu cà phê

nhiễm nấm mốc và chủ yếu là nấm Aspergillus niger, Kết quả phân tích HPLC cho thấy trong ñó có tới 8,7% là các chủng A niger sinh ñộc tố

ochratoxin A (Z Ilic & cs, 2007) Nghiên cứu của S L Leong và cộng sự về

cà phê Việt Nam cũng cho thấy hầu hết các mẫu kiểm tra ñều nhiễm nấm mốc

trong ñó chủ yếu là nhiễm A niger (S L Leong & cs, 2004)

Theo báo cáo của Nguyễn Văn Thường và cộng sự tại dự án ñặc biệt của FAO về cà phê trang trại tại 6 huyện tỉnh ðắc Lắc-Việt Nam niên vụ 2003-2004, kết quả cho thấy hầu hết các mẫu cà phê ñều nhiễm nấm mốc và

chủ yếu là chủng Aspergillus niger Nhiều mẫu kiểm tra phát hiện ochratoxin

A ở mức 3-6ppb, tuy vậy không có gì ñảm bảo hàm lượng ñộc tố này sẽ

không tăng lên trong quá trình bảo quản (Nguyễn Văn Thường & cs, 2006)

Theo nghiên cứu, khảo sát Nguyễn Thùy Châu và cộng sự, hầu hết các mẫu cà phê tại khu vực Tây Nguyên kiểm tra sau 1 tháng bảo quản ñều nhiễm nấm mốc và hầu hết các mẫu hạt kiểm tra nhanh bằng phương pháp UV ñều

chứa chủng A niger sinh ochratoxin A 20% các mẫu khi phân tích chứa

ochratoxin A với hàm lượng từ 1-10ppb (Nguyễn Thùy Châu và cs, 2010)

2.3.5 Sự tạo ñộc tố của A niger

2.3.5.1 ðặc ñiểm hình thái A niger

A niger hình thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc màu vàng trên khuẩn lạc có bào từ màu ñen - bào tử nấm sinh sản vô tính tập trung ở phía trung tâm của khuẩn lạc Mặt sau có các rãnh ñồng tâm Hệ sợi nấm hoặc sợi mảnh, sợi nấm ñều ñược chia bởi một vách ngăn và thấy rõ khi nhìn qua kính hiển vi Các cuống bào tử ñính (nấm bào tử sinh sản vô tính) của A niger thường dài khoảng từ 400-3000 µm và chứa hình cầu các túi cầu khác nhau có ñường kính từ 30-75 µm Mỗi túi hình cầu ñược che chở bởi các thể bình từ hệ sợi

của A niger (Nguyễn Lân Dũng & cs, 1989)

Những thể bình ñi ra từ các nhánh thứ cấp tại ñây một tế bào nảy chồi ñược tạo ra Các thể bình ñi qua một quá trình từ gốc nảy chồi tạo bào tử lưỡng bội hình cầu, có ñường kính khoảng từ 3 ñến 5 micromet

2.3.5.2 Yêu cầu sinh thái và ñiều kiện lên men của A niger

A niger thường ñược tìm thấy trong môi trường chung như ñất ñai,

thực vật, và môi trường không khí kèm theo A niger không yêu cầu khắt khe

ñộ ẩm do ñó có thể phát triển ở ñiều kiện ẩm ướt hoặc ñiều kiện khô nhưng cũng là một sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt ñộ cao Mặt khác phổ

nhiệt của A niger khá rộng từ nhiệt ñộ cao ñến ñóng băng Aspergillus là loài

hiếu khí và ñược tìm thấy trong hầu hết tất cả các môi trường giàu oxy, thường phát triển trên bề mặt của chất nền

A niger sinh trưởng ñược ở nhiệt ñộ tối thiểu là 6 – 80C và tối ña là 45 -470C, tối ưu ở 28 -350C trong môi trường ẩm tối thiểu là 23% ðộ ẩm môi

trường thích hợp ñể lên men A niger là 60 – 65%, nó chỉ sinh trưởng và phát

triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4 – 6,5, tuy nhiên theo (Patt, 1981) cũng có

những chủng A niger sinh trưởng ñược ở pH 2 Sự thay ñổi pH môi trường nuôi cấy từ 3 – 6,5 làm thay ñổi ñáng kể hình thái của A niger

Trên môi trường thạch Czapek – dox, A niger mọc thưa, ñường kính

khuẩn lạc khoảng 40 mm Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm

khuẩn lạc A niger mọc tốt và to hơn, ñạt ñường kính trung bình khoảng 60 mm

(Patt, 1981)

2.3.5.3 Khả năng sinh ñộc tố của A niger

A niger là tương ñối vô hại so với các loại nấm sợi khác Nhưng trên thực tế cho thấy, ñã có một số trường hợp y tế ñã ñược ghi nhận, chẳng hạn như viêm phổi hoặc nhiễm trùng tai ở bệnh nhân có một hệ thống miễn dịch suy yếu, hoặc một hệ thống miễn dịch ñã bị suy giảm bởi một căn bệnh hoặc ñiều trị y tế Trong trường hợp các bệnh nhiễm trùng tai, A niger xâm nhập vào ống tai ngoài có thể gây thiệt hại cho da ðây là loài nấm sợi sản xuất các chất chuyển hóa trung gian, một trong những chất quan trọng nhất là ochratoxin A Ochratoxin A là một mycotoxin gây ô nhiễm thực phẩm, con người tiếp xúc với chất ñộc này thông qua sử dụng thực phẩm mà không ñược bảo quản một cách thích hợp Tuy nhiên, các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng ít hơn

10% của các chủng A niger ñã ñược thử nghiệm dương tính ochratoxin A

trong ñiều kiện có lợi cho nấm mốc phát triển (Bejaoui & cs, 2006)

2.3.5.4 Các phương pháp thu hồi bào tử Aspergillus niger

Theo Krishna và cộng sự, có hai phương pháp ñể thu hồi bào tử A niger

là phương pháp sử dụng nước và phương pháp khô nhờ công nghệ hút bào tử Phương pháp thứ nhất là sử dụng nước cất thanh trùng và ñã thu hồi ñược 4-7x109CFU/ml bằng cách bổ sung nước, lắc tách bào tử và lọc qua giấy lọc Whatman No.1, quá trình lọc rửa diễn ra trong khoảng 30 phút (Krishna, 1954)

Theo Chabra và cộng sự, bào tử nấm A niger sau khi nuôi cấy trên môi

trường PDA ñặc sau 4-6 ngày bào tử ñược thu hoạch bằng nước muối chứa 0,1% Tween 80 và lắc Tween 80 bổ sung ñể tạo huyền phù bào tử, tránh kết lắng (Aru Chhabra & cs, 1996)

Tương tự, Jaivel và công sự cũng sử dụng nước cất thanh trùng ñể thu

hoạch bào tử nấm: bào tử nấm Aspergillus sau khi nuôi cấy trên môi trường

PDA sau 7 ngày ở 300C ñược thu hồi bằng nước cất thanh trùng với một lượng vừa ñủ, làm sạch bằng giấy lọc và ly tâm (Jaivel, Marimuthu, 2010)

2.3.5.5 Tạo chế phẩm A niger bằng phương pháp nhân nuôi bề mặt

A niger thuộc nấm sợi nên phát triển tốt trên môi trường xốp và nuôi cấy bề mặt Những ưu ñiểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt như:

- Dễ thực hiện, quy trình công nghệ ñơn giản

- Thu ñược lượng bào tử lớn

Quá trình nuôi cấy A niger trên môi trường xốp bằng phương pháp

nhân nuôi bề mặt trải qua các giai ñoạn sau

* Giai ñoạn I: Giai ñoạn này kéo dài từ 10 – 14 giờ kể từ thời gian bắt ñầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt ñầu trương nở và hô hấp Ở giai ñoạn này có nhiều biến ñổi: - Nhiệt ñộ tăng chậm

- Sợi nấm bắt ñầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa

- Khối môi trường còn rời rạc và thành phần dinh dưỡng bắt ñầu có

* Giai ñoạn III: giai ñoạn này kéo dài 10 -12 giờ, lúc này nhiệt ñộ môi trường giảm dần do cường ñộ hô hấp của nấm giảm rõ rệt Màu sắc của sợi nấm bắt ñầu thay ñổi và thể hiện màu ñặc trưng (Nguyễn ðức Lượng, 2002)

2.4 Phòng chống nấm mốc sinh ñộc tố và ñộc tố nấm mốc ochratoxin A trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình phòng chống ñộc tố ochratoxin A trên thế giới

Bên cạnh việc kiểm tra, giám sát mức nhiễm ochratoxin A trên nông sản, việc phòng chống ochratoxin A trên nông sản ñã ñược nhiều quốc gia trên thế giới ñề cập ñến trong chiến lược của mình Những biện pháp sau ñây ñã ñược

Bộ Nông nghiệp Mỹ và cộng ñồng châu Âu khuyến cáo nhằm phòng chống các mycotoxin nói chung và ochratoxin A nói riêng, ñó là

- Phát triển các cây trồng có khả năng ñề kháng nấm

- Kiểm soát sự nhiễm các loài nấm sinh ñộc tố trên cây trồng ở ngoài ñồng

- Xác ñịnh ñúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu cho cây trồng

- Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản

- Bảo quản các nông sản ở nhiệt ñộ thấp nếu có thể

- Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản ñể ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc

Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử

dụng các chất diệt côn trùng

Christensen Clyde nhà khoa học Mỹ ñã có những nghiên cứu công phu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản Tác giả cho thấy, ñất là nơi phát sinh ñầu tiên của các nấm mốc Các nấm này ñã nhiễm vào

rễ của cây trồng rồi từ ñó nhiễm nội sinh vào cây trồng và tiếp ñó nhiễm vào bên trong các hạt lương thực Chính vì những kết quả nghiên cứu này mà ông ñã ñề

ra phương pháp xác ñịnh hệ nấm mốc nhiễm bên trong hạt lương thực ñể ñánh giá mức ñộ nhiễm các loài nấm mốc chính huỷ hoại các hạt lương thực trong quá trình bảo quản Kết quả nghiên cứu của Christensen ñã cho thấy việc phòng chống các nấm mốc sinh ñộc tố trên nông sản phải bắt ñầu ngay từ giai ñoạn cây trồng còn trên ñồng ruộng (Christensen Clyde M, 1969)

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt nam

Trong khuôn khổ của ñề tài cấp Bộ Nông nghiệp, của dự án với quỹ khoa học Quốc tế và hợp tác với Viện nghiên cứu thực phẩm Quốc gia Nhật bản, Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự ñã nghiên cứu mức ñộ nhiễm nấm mốc

và một số mycotoxin trên nông sản ở Việt nam Kết quả nghiên cứu ochratoxin A trên ngô miền Bắc Việt nam cũng cho thấy ngô bột của miền Bắc Việt nam năm 1994 ñã nhiễm 50% ochratoxin A với hàm lượng trung bình là 14,7 ppb Các mẫu ngô hạt nhiễm 88% ochratoxin A với hàm lượng trung bình là 10 ppb (Nguyễn Thùy Châu, 1996)

Nguyễn Thùy Châu và cộng sự ñã nghiên cứu mức ñộ nhiễm mycotoxin trên cà phê và một số nông sản khác của Việt Nam Kết quả nghiên cứu trong

44 chủng A niger phân lập từ cà phê và ñất trồng cà phê ñã có 28 chủng có

khả năng sinh ochratoxin A ( bằng 63% số mẫu phân tích), hàm lượng ochratoxin A trong các mẫu này dao dộng từ 0-13ppb và 16 chủng không có

khả năng tạo ochratoxin A 22 chủng Penicillium phân lập ñược thì có 12

chủng có khả năng sinh ochratoxin A và 10 chủng không có khả năng tạo ochratoxin A ( bằng 54,5% các mẫu phân tích), hàm lượng ochratoxin A trong các mẫu này dao dộng từ 0,5- 10 ppb Kết quả này cho thấy tỷ lệ các chủng sinh ochratoxin A trong các mẫu cà phê và ñất trồng cà phê là khá cao Kết quả này cho thấy cần có biện pháp phòng chống sự nhiễm các chủng nấm

mốc A niger và Penicillium sinh ochratoxin A ñối với cây cà phê ở giai ñoạn

ngoài ñồng (Nguyễn Thùy Châu & cs, 2010)

2.5 Các phương pháp phòng chống giảm nhiễm Ochratoxin A

2.5.1 Biện pháp ngăn ngừa, hạn chế ñộc tố nấm mốc

Có nhiều công trình nghiên cứu về hạn chế ñộc tố nấm mốc trong lương thực cũng như thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều loại thuốc diệt nấm trên ngô, lúa mì, lạc và gạo có tác dụng tốt trong hạn chế sự phát triển của nấm mốc trên các cây này Một số tác giả nghiên cứu ảnh

hưởng của thành phần tỷ lệ chất dinh dưỡng trong ñất nhằm hạn chế sự tấn công của nấm mốc ñối với các loại lương thực Một số công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm mốc ñi theo hướng khác ñó là tạo ra giống cây trồng có khả năng ức chế và chống lại sự phát triển của nấm mốc ðối với các nước ñang phát triển, việc áp dụng các biện pháp luân canh cây trồng trên cùng một ñơn vị diện tích là một trong những biện pháp khá phổ biến nhằm hạn chế tác hại của nấm mốc Tuy nhiên, biện pháp này chỉ có tác dụng trong những năm ñầu tiên, sau ñó bào tử nấm thích ứng và có thể tồn tại rất lâu trong ñất, vì vậy việc luân canh không còn tác dụng nữa ðể bảo quản lương thực, thực phẩm ñược tốt thì việc áp dụng nhiều biện pháp như thu hoạch ngũ cốc ñúng thời gian, không làm hỏng hoặc hoặc trầy xước lớp vỏ bảo vệ, phơi khô ñúng ñộ

ẩm cho phép và bảo quản trong phòng có hệ thống hút ẩm là cần thiết và chi phí thấp nhất

Trong bảo quản lương thực, có nhiều nghiên cứu và ứng dụng các phương pháp hạn chế sự phát triển của nấm mốc bằng hóa chất Tuy nhiên, kết quả ứng dụng các loại hóa chất diệt nấm trong thực phẩm rất hạn chế vì chúng có thể gây ñộc Vì vậy, việc bảo quản lương thực, thực phẩm cũng như các loại thức ăn chăn nuôi khỏi sự tấn công của nấm mốc còn gặp nhiều khó khăn

2.5.2 Khử nhiễm ochratoxin A bằng hấp phụ sinh học

Theo các nghiên cứu của Pohland và cộng sự, một vài carbonhydrate phức tạp khó tiêu (cellulose, polysaccharides trong thành tế bào của nầm men

và vi khuẩn như glucomannans, peptidoglycans, và một số dạng khác) cùng một số polyme tổng hợp như cholestryamine và polyvinylpyrrolidone có thể hấp phụ các mycotoxin (Pohland & Wood, 1987)

Kết quả phân tích thành tế bào nấm men cho thấy có sự kết hợp với một vài mycotoxin như aflatoxin, ochratoxin và T2-toxin, dạng ñơn lẻ hoặc kết hợp (Raju, Devegowda 2002)

ðể thủy phân OTA có thể dùng hoạt lực của các enzyme proteolyric

Hai con ựường có thể phân giải OTA vi sinh vật, ựầu tiên OTA bị phân giải vi sinh thông qua thủy phân liên kết amid, tạo các phân tử L-β-phenylalanine và OTα, hai phân tử này không ựộc hại Cơ chế này có thể coi là cơ chế phân giải ựộc tố Thứ hai, OTA có thể bị phân giải nhờ thủy phân vòng lacton tạo thành lactone opened OTA (OP-OTA) (Karlovsky, 1999) đã có những công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng enzyme thủy phân từ vi sinh vật phân giải OTA trong thức ăn chăn nuôi Các báo cáo ựầu tiên protease có khả năng thủy phân OTA là carboxypeptidase A (CPA) (EC 3.4.17.1) từ tuyến tụy bò

(Pitout, M.J, 1969); Việc tách chiết enzyme thô lipase, protease từ A niger có

khả năng phá vỡ liên kết các amit của OTA (Stander, 2000), ngoài ra enzym

carboxypeptidase Y (CPY) (EC 3.4.16.1) từ S cerevisiae hoạt ựộng ở pH 5,6

và 370C có khả năng thủy phân trên 52% OTA (Abrunhosa & cs, 2007)

2.5.3 Phòng chống ochratoxin A phương pháp ựối kháng cạnh tranh

Do sự nguy hiểm của ochratoxin A ựối với sức khoẻ của người và ựộng vật, trong những năm gần ựây, các nhà khoa học trên thế giới ựã có nhiều nỗ lực trong việc nghiên cứu các biện pháp khử nhiễm ochratoxin A trong nông sản thực phẩm Các giải pháp sinh học ựược chứng minh là các phương pháp

hứa hẹn nhất Bejaui và cộng sự ựã phân lập ựược 40 chủng Aspergillus thuộc nhóm Aspergillus niger như A carbonazius, A niger, A japonicus từ các quả

nho Pháp và ựã ựánh giá khả năng phân huỷ ochratoxin A trên môi trường canh thang chất chiết nấm men và trên môi trường dịch nho tổng hợp có nhiễm ochratoxin A ở nồng ựộ 2 mg/l Kết quả cho thấy rằng ở cả hai môi trường các nấm này ựã có khả năng phân huỷ ochratoxin A thành ochratoxinalpha Tuy nhiên, có sự khác nhau giữa các môi trường và giữa các loài nấm ựược thử Ở môi trường dịch quả nho và môi trường chất chiết nấm men 77% và 44% các chủng phân lập ựã có khả năng phân huỷ trên 80%

ochratoxin A A niger ựược ựánh giá là loài có hiệu quả cao nhất ựối với quá trình khử ochratoxin A, tiếp theo là A Japonicus (Bejaoui & cs, 2006)

Varga và cộng sự ñã nghiên cứu sự phân huỷ ochratoxin A và các ñộc tố

nấm mốc khác (mycotoxin) bằng các chủng Rhizopus Kết quả cho thấy ochratoxin A ñã ñược phân huỷ một cách hiệu quả bằng nấm Rhizopus

stolonifer, R microsporus, R homothallicus và hai chủng R oryae và bằng bốn chủng Rhizopus chưa ñược ñịnh loại khác ðộng học của sự khử ñộc tố ochratoxin A của các chủng Rhizopus chọn lọc ñã ñược nghiên cứu Kết quả cho thấycác chủng Rhizopus phân lập có thể phân huỷ trên 95% ochratoxin A trong vòng 16 ngày Rhizopus stolonifer có thể phân huỷ ochratoxin A trên

lúa mì ẩm (Varga & cs, 2000; 2005)

Các chủng A niger không sinh ñộc tố và Rhizopus stolonifer cũng ñã

ñược cộng ñồng châu Âu khuyến cáo ñể khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực nhiễm ñộc tố này ở mức quá giới hạn cho phép

Ringot và Bejaoui, 2006 cho thấy chủng A niger không sinh ñộc tố ñã

có khả năng ức chế chủng A niger, A ochraceus và các Penicillium sinh ñộc

tố theo cơ chế cạnh tranh trên cùng môi trường dinh dưỡng Kết quả này ñã ñược cộng ñồng châu Âu công nhận và khuyến cáo sử dụng chủng A niger không sinh ñộc tố ñể phòng chống ochratoxin A trên ngô ở giai ñoạn ngoài ñồng Sử dụng vi sinh vật cạnh tranh với chủng sinh ñộc không ñể lại dư lượng các chất hóa học ñộc hại trên nông sản Phương pháp này mang lại hiệu quả phòng chống ochratoxin A cao ngay từ giai ñoạn ngoài ñồng và kéo dài trong quá trình bảo quản (Ringot , 2006; Bejaoui, 2006)

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu:

- Bộ chủng giống A niger sinh và không sinh ñộc tố ochratoxin A của

Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch – Viện Cơ ñiện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

- Mẫu cà phê và ñất trồng cà phê tại một số vùng trọng ñiểm của Việt Nam: ðắc Lắc, ðắc Nông…

- Chế phẩm phòng chống nấm sinh ñộc tố và ñộc tố nấm mốc ochratoxin A trên cà phê

3.1.2 Hóa chất

- Tất cả các loại hóa chất dùng cho phân tích ochratoxin A ñều ñạt mức

ñộ tinh khiết phù hợp và ñáp ứng yêu cầu thí nghiệm

- Na2SO4 khan (Trung Quốc), NaHClO (Nhà máy hóa chất Việt Trì), Các dung môi cloroform, toluel, methanol, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc), Các chuẩn ñộc tố ochratoxin A (Sigma), Silicagel 60 F245 (Merck), sắc

ký lớp mỏng (ðức), glucoza, NaNO3, KCl, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O , ZnSO4.7H2O, CuSO4.7H2O …

- Mẫu ngô, cà phê sạch ñã ñược kiểm tra không bị nhiễm nấm mốc sinh ñộc tố và ñộc tố ochratoxin A

3.1.3 Môi trường

3.1.3.1 Môi trường PDA (g/l):

Glucoza 20g; khoai tây 200g; thạch 20g; nước 1l; pH= 6 hấp khử trùng

1210C trong 20 phút

* Chuẩn bị nước chiết khoai tây: cân 200g khoai tây ñã gọt vỏ, rửa sạch

và thái nhỏ, thêm 1000ml nước, ñun sôi trong 1 giờ sau ñó lọc bỏ bã khoai, bổ sung nước cho ñủ 1000ml

3.1.3.2 Môi trường Czapek - Dox (CZ) (g/l):

NaNO3 3g, KCl 0,5g, MgSO4.7H2O 0,5g, FeSO4.7H2O 0,01g, ZnSO4.7H2O 0,01g, CuSO4.7H2O 0,005g, thạch 20g, nước cất 1l, pH = 5,0 hấp khử trùng 1210C trong 20 phút

3.1.3.3 trường Czapek - Dox (CZ) cải tiến (g/l):

(NH4) H2PO4 10g, K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 0,5g, KCl 0,5g, FeSO4.7H2O 0,01g, sucrose 30g, Corn steep liquor: 0,5g, agar 20g, nước cất 1l, pH = 5,0 hấp khử trùng 1210C trong 20 phút

3.1.3.4 Môi trường cà phê ( ký hiệu: CP):

Cà phê ựược làm ẩm với ựộ ẩm khoảng 60 - 65%

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ

- Máy nghiền ựồng thể polytron, Cộng hòa liên bang đức

- Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc

- Kắnh hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật

- Phễu chiết

- Ống hút tự ựộng 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc

- Bơm tiêm vi lượng Hamilton

- Máy cô chân không

- đèn cực tắm 254 nm Ờ 366nm Camag (Thụy Sỹ)

- Máy ựánh sóng siêu âm

- Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh

- Máy cất quay chân không (đức)

- Tủ cấy vô trùng (đức)

- Nồi hấp tự ựộng (đài Loan)

- Máy ựánh vovtex

- Các loại máy khuấy thắ nghiệm (khuấy từ, khuấy thường) (IKA, đức)

- Máy nghiền khô nguyên liệu

- Nồi hấp thanh trùng tự ñộng (Trung Quốc)

- Tủ sấy (Việt Nam)

- Tủ cấy vô trùng tự ñộng Ehret (ðức)

- Tủ nuôi cấy ñiều chỉnh nhiệt ñộ Sanyo (Nhật Bản)

- Tủ lạnh (Nhật Bản)

- Cân phân tích Ohous( Thụy ðiển)

- Máy lắc ổn nhiệt (ðức, Kính hiển vi Olympus (Nhật Bản 0

- Máy ño pH, Máy nghiền, máy ñóng gói, máy dán túi,

Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: hộp pettri, ống nghiệm, pipet, que cấy, que trang, ñèn cồn, bình tam giác, ống ñong, micropipet các loại từ 100 µl ñến 1000µl, giấy bán thấm, giấy lọc, hộp carton,…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích ochratoxin A

Theo phương pháp lấy mẫu của FAO:

* Mẫu ñất: Dùng dụng cụ lấy mẫu chuyên dụng cho khoảng 50g mẫu ñất ở gốc cây cà phê với ñộ sâu 5cm – 15cm cách mặt ñất cho vào túi nilon, ghi ký hiệu mẫu, tên mẫu, ñịa ñiểm lấy mẫu ở bên ngoài

* Mẫu cà phê hạt: Mẫu ñại diện trộn ñều (10kg), chia 4 theo phương

pháp hình chéo rồi tiếp tục chia 4 rồi lấy 1 kg làm mẫu ñại diện phụ Mẫu ñại diện phụ ñược xay nhỏ bằng máy xay phòng thí nghiệm rồi trộn ñều, chia 4, lấy một phần rồi lại trộn ñều, chia 4, và lấy 100g làm mẫu phân tích

3.2.2 Phương pháp xác ñịnh mức ñộ nhiễm mốc trên cà phê

Lấy ñại diện khoảng 50 hạt theo phương pháp lấy mẫu trên, cho vào bình tam giác Hạt ñược ngâm với H2O2 4% trong 5 phút ñể rửa sạch Sau ñó rửa sạch với nước cất 3-5 lần ðặt ñều 10 hạt vào hộp Petri có sẵn môi trường PDA Nuôi tủ 300C trong 2 ngày và ñọc kết quả nhiễm mốc

Mức ñộ xâm nhiễm của các loài nấm mốc trên cà phê nghiên cứu ñược ñánh giá bằng ñại lượng X, là phần trăm hạt nhiễm mốc trung bình của một

loài trong các mẫu khảo sát Những loài có giá trị X cao trong các mẫu khảo sát ñược coi là những loài chính nhiễm trên mẫu lương thực khảo sát

3.2.3 Phương pháp phân lập nấm mốc

3.2.3.1 Phân lập nấm mốc trên ñất trồng cà phê

Tiến hành theo (Rapper và Fennel, 1965): Cân 20 gam mẫu ñất trồng

cà phê vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng Lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 30 phút, ñể lắng ở nhiệt ñộ phòng Phân phối môi trường ra các ñĩa Petri ñã vô trùng Khi môi trường ñã ñông và nguội, dùng micropipet

ñã vô trùng hút 30- 40 µl dịch mẫu và trang ñều trên bề mặt thạch bằng que trang Dùng giấy gói kín các ñĩa Pettri và ñem nuôi cấy ở 280 C, sau 24 hoặc

48 giờ lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc nấm mốc riêng lẻ cấy sang môi trường thạch nghiêng, sau ñó ñược tinh sạch theo phương pháp bào tử ñơn Các bào tử ñược tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này ñược pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10, trộn cẩn thận bằng máy Voltex trong 1 phút Một ml từ hai hay ba các ñộ pha loãng ñược chọn, tuỳ theo mật

ñộ của hỗn dịch ban ñầu ñược cho vào hộp petri Rót vào mỗi ñĩa pettri 15ml môi trường ñã ñun nóng chảy (giữ ở 450C) Từ khi bắt ñầu pha loãng cho ñến khi rót môi trường không quá 15 phút Trộn bào tử và môi trường thật ñồng ñều bằng cách ñảo hộp lồng theo bốn hướng: thẳng ñứng, cùng chiều kim ñồng hồ, nằm ngang và ngược chiều kim ñồng hồ, mỗi hướng 5 lần rồi ñể cho thạch ñông lại ðổ một ñĩa ñể kiểm tra ñộ vô khuẩn của môi trường cũng bằng 15ml môi trường và thao tác tương tự nhưng không có dịch cấy Các hộp này ñược ủ trong tủ ấm 280C trong 48 - 72 giờ Việc phân lập ñược làm từ những hộp có số lượng giới hạn những khuẩn lạc riêng biệt ñồng ñều

3.2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc nhiễm bên trong hạt cà phê: ñược tiến hành theo phương pháp của Christensen

Mẫu hạt ñược khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạt bằng dung dịch NaClO 3% (cũng có thể rửa hạt với dung dịch H2O2 trong 5 phút hoặc bằng