3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu nghiên cứu
3.2.3. Phương pháp phân lập nấm mốc
3.2.3.1. Phân lập nấm mốc trên ñất trồng cà phê
Tiến hành theo (Rapper và Fennel, 1965): Cân 20 gam mẫu ñất trồng cà phê vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng. Lắc trên máy lắc 200 vòng/phút trong 30 phút, ñể lắng ở nhiệt ñộ phòng. Phân phối môi trường ra các ñĩa Petri ñã vô trùng. Khi môi trường ñã ñông và nguội, dùng micropipet
ñã vô trùng hút 30- 40 µl dịch mẫu và trang ñều trên bề mặt thạch bằng que trang. Dùng giấy gói kín các ñĩa Pettri và ñem nuôi cấy ở 280 C, sau 24 hoặc 48 giờ lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc nấm mốc riêng lẻ cấy sang môi trường thạch nghiêng, sau ñó ñược tinh sạch theo phương pháp bào tử ñơn. Các bào tử ñược tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này ñược pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10, trộn cẩn thận bằng máy Voltex trong 1 phút. Một ml từ hai hay ba các ñộ pha loãng ñược chọn, tuỳ theo mật
ñộ của hỗn dịch ban ñầu ñược cho vào hộp petri. Rót vào mỗi ñĩa pettri 15ml môi trường ñã ñun nóng chảy (giữở 450C). Từ khi bắt ñầu pha loãng cho ñến khi rót môi trường không quá 15 phút. Trộn bào tử và môi trường thật ñồng
ñều bằng cách ñảo hộp lồng theo bốn hướng: thẳng ñứng, cùng chiều kim
ñồng hồ, nằm ngang và ngược chiều kim ñồng hồ, mỗi hướng 5 lần rồi ñể cho thạch ñông lại. ðổ một ñĩa ñể kiểm tra ñộ vô khuẩn của môi trường cũng bằng 15ml môi trường và thao tác tương tự nhưng không có dịch cấy. Các hộp này
ñược ủ trong tủ ấm 280C trong 48 - 72 giờ. Việc phân lập ñược làm từ những hộp có số lượng giới hạn những khuẩn lạc riêng biệt ñồng ñều.
3.2.3.2. Phương pháp phân lập nấm mốc nhiễm bên trong hạt cà phê: ñược
tiến hành theo phương pháp của Christensen
Mẫu hạt ñược khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạt bằng dung dịch NaClO 3% (cũng có thể rửa hạt với dung dịch H2O2 trong 5 phút hoặc bằng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30
AgCl 1% trong 2 phút), lắc mạnh và ñều. Sau ñó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. ðể ráo hạt và ñặt hạt vào hộp Petri có môi trường thạch - PDA nhằm phân lập các loại nấm mốc của hai chi Aspergillus và Penicillium ,
Fusarium và một số các chi khác.
3.2.3.3. Phương pháp làm tiêu bản quan sát nấm mốc
Nhỏ một giọt cồn : nước theo tỉ kệ 2 : 1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên sau ñó nhỏ một xanhmetylen, ñậy lamen lên sau ñó quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ñiện tửở vật kính 40.
3.2.3.4. Phương pháp phân loại các loài nấm mốc
Các loài nấm mốc phát triển trên các hạt lương thực trong quá trình phân lập, ñược phân lập riêng biệt vào môi trường Czapek - Dox và PDA ở các ống thạch nghiêng. Sau ñó ñược tinh sạch theo phương pháp bào tử ñơn. Có thể
thực hiện việc phân lập bào tửñơn theo 2 bước.
+ Phương pháp pha loãng hàng loạt
Các bào tử ñược tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này ñược pha loãng bằng nước cất vô trùng theo các bậc: 1: 10. Một ml từ hai hay ba các ñộ
pha loãng ñược chọn, tuỳ theo mật ñộ của hỗn dịch ban ñầu, ñược cho vào hộp petri. Sau ñó thạch ñun chảy ở nhiệt ñộ gần 45oC ñược cho vào các hộp này và hộp petri quay vòng ñể trộn ñều các bào tử ñược pha loãng. Các hộp này ñược ủ và việc phân lập ñược làm từ những hộp có số lượng giới hạn những khuẩn lạc riêng biệt ñồng ñều.
+ Sử dụng các khoá phân loại
Vì hầu hết các nấm mốc nhiễm trên lương thực là những nấm bất toàn (Fungi imperfecti) nên trong quá trình phân loại ñến các chi chúng tôi ñã sử
dụng tài liệu của Barnett (1960).
ðể phân loại ñến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng tài liệu Raper và Fennell.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 31
Sàng lọc các chủng A. niger sinh ochratoxin theo phương pháp 2.2.6.