3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Vật liệu nghiên cứu
3.2.8. Phương pháp phân tích ochratoxinA trong cà phê
3.2.8.1. Chiết tách ochratoxin A trong cà phê theo phương pháp của
Shimomura và Ishikuro.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 33
và 100ml toluene sau ñó lắc liên tục 60 phút trong tối ñể tránh Ochratoxin bị
phân hủy bởi ánh sáng mặt trời. Lọc lấy 50ml.
Phân tách lớp: 50ml của pha toluene chứa Ochratoxin cô quay lấy phần cặn , bổ sung 5ml Toluen rồi tinh sạch qua cột sep-park. Cột ñược làm sạch 02 lần với 10ml n-Hexan và 10ml acetone/toluene tỷ lệ 5/95 nhắc lại 2 lần. Cuối cùng 5ml toluene qua cột ñể thu hồi Ochratoxin.
Thu hồi Ochratoxin A: 15ml toluene / axit acetic tỷ lệ 90/10 nhắc lại 2 lần, hỗn hợp này ñược lắc 10 phút sau ñó phân tách lớp. Ochratoxin A có mặt
ở pha dung môi . Dung dịch này ñược axit hóa bởi thêm nồng ñộ HCL ñến pH bằng 2. CHCl3 thêm vào hỗn hợp và lắc 10 phút nhắc lại 2 lần, phân tách lớp và thu hồi pha dưới có chứa Ochratoxin A. Dung dịch ñược cô chân không lấy phần cặn, phần cặn ñược hòa tan vào 100µl metanol, giữ ở 40C cho ñến lúc tiến hành ñịnh tính và ñịnh lượng.
3.2.8.2. ðịnh tính ochratoxin A
Dùng micropipet (0,5-10 µl) nhỏ lên bản sắc kí lớp mỏng 2µl, 6µl và hai lần 10µl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch ñược chấm vào bản mỏng cách mép dưới của bản mỏng 2cm và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện với những lượng nhỏ sao cho các vết có ñường kính không quá 5 mm trên ñường bắt ñầu. Nhỏ 2, 6, 10 µl chuẩn với nồng ñộ
5µg/ml trên cùng một phiến bản mỏng. Hệ dung môi khai triển là chlorofom : axeton tỷ lệ 9:1
Giới hạn ñộ phát hiện của phương pháp là 5µg ochratoxin A/kg sản phẩm, hệ số dao ñộng là 0,3-0,5. Phát hiện ochratoxin A bằng sự phát quang của các vết trên bản mỏng ở buồng tối dưới ñèn cực tím ở bước sóng 365nm. Phát hiện bằng mắt thường trên sắc kí ñồ của mẫu chiết cường ñộ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc ñịnh lượng ochratoxin A.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 34
3.2.8.3. ðịnh lượng ochratoxin A
Ochratoxin A ñược phát hiện trong mẫu thử ñược ñịnh lượng bằng cách: Nhỏ 10µl chất chiết với ñường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới, bên phải của bản mỏng, 1,5cm cách mép. ở góc dưới bên trái 1,2 và 3cm cách mép và 1,5 từ mép dưới của bản mỏng, nhỏ 2µl, 4µl, 6µl theo thứ tự
dung dịch chuẩn ochratoxin A. Nhỏ 6µl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5 cách mép phiến mỏng.
Thực hiện sắc kí bản mỏng hệ dung môi chloroform : axeton (9:1) so sánh cường ñộ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên bản mỏng với các vết mẫu thử, bằng mắt thường ñịnh lượng ochratoxin A ở vết mẫu thử
theo công thức sau:
X : Hàm lượng ochratoxin A ứng với ñỉnh của mẫu trên sắc ký ñể tính theo
ñường cong chuẩn (ng)
V1: Lượng dung môi cloroform ñể chiết suất ochratoxin A của mẫu (ml) V2: Lượng dịch mẫu lấy ñể làm bay hơi ở máy cô chân không quay (ml) V3: Lượng metanol ñể hòa cắn (ml)
V4: Lượng mẫu dùng (ml)
M : Lượng mẫu ñể lấy phân tích (g)
Hàm lượng X (ng) x V3 x V1
ochratoxin A =
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 35