Nghiên cứu tạo chế phẩm hệ vi khuẩn nitrate hoá bằng phương pháp cố định trên giá thể bacterial cellulose và đá san hô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM HỆ VI KHUẨN NITRATE HOÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TRÊN GIÁ THỂ BACTERIAL CELLULOSE VÀ ĐÁ SAN HÔ CBHD: PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG SVTH: NGUYỄN TẤN ĐỨC MSSV: 60604107 LƯU HÙNG MINH TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 MSSV: 60601470 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài Luận văn Đại Học, nhận hỗ trợ tinh thần vật chất quý báu từ Thầy Cô, bạn bè gia đình Nhờ động viên, dẫn giúp đỡ người nên vượt qua khó khăn để hồn thành tốt đề tài Trước hết xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Thuý Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa TPHCM tạo điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo dõi sát tiến trình thí nghiệm Cơ giúp chúng tơi có cách tiếp cận tốt giải vấn đề trình phân lập giống thử nghiệm hoạt tính chế phẩm Xin cảm ơn ThS Lê Tiến Dũng, trường Trung học Thuỷ Sản TPHCM giúp chúng tơi nhiều hố chất dụng cụ q trình thực lên men hệ vi khuẩn nitrate hoá Trong thời gian thử nghiệm chế phẩm với Thầy Cần Giờ, chúng tơi có hội tiếp xúc với người ni tơm qua rút học quý báu việc ứng dụng chế phẩm vi sinh vào thực tế Chúng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cơ anh chị phụ trách Phịng Thí Nghiệm 102, 108 117 Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa TPHCM tận tình giúp đỡ, hướng dẫn hỗ trợ sử dụng trang thiết bị thuận lợi hiệu Chúng gửi lời tri ân chân thành sâu sắc đến Cha, mẹ anh chị em gia đình hỗ trợ nhiều tinh thần vật chất, giúp chúng tơi an tâm làm thí nghiệm thời gian vừa qua Ngồi ra, xin ghi nhận trân trọng hỗ trợ nhiệt tình anh chị làm luận văn Cao Học, bạn sinh viên lớp, bạn sinh viên khoá 07 08 việc hỗ trợ tài liệu, phụ giúp thí nghiệm trao đổi, tranh luận tiến trình thí nghiệm khả ứng dụng tương lai i TÓM TẮT Ở trại ương tôm giống, việc nuôi tôm mật độ cao với lượng thức ăn thừa không sử dụng làm tăng lượng ammonia tự (NH3) môi trường nước Điều dẫn đến ấu trùng tôm bị ngộ độc, làm giảm khả sinh trưởng phát triển, suất thu hoạch ô nhiễm môi trường Đề tài thực nhằm tạo loại chế phẩm vi sinh hiệu để xử lý ammonia nước nuôi tôm giống Các bước tiến hành sau: phân lập hệ vi khuẩn nitrate hoá từ chế phẩm thương mại; lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá; cố định vi khuẩn lên loại giá thể khác xác định hoạt tính chế phẩm Hai loại giá thể dùng để cố định Baterial Cellulose (BC) đại diện cho nhóm chất mang có chất hữu cơ; giá thể đá san hơ (CR) đại diện cho nhóm chất mang có chất vơ Kết cho thấy sau tháng theo dõi tỉ lệ xử lý 1/1000 nước biển, chế phẩm BC có mật độ vi khuẩn 92.1011 cfu/g có hiệu xử lý 35% hoạt tính trung bình 0,43 mg NNH4+/g/L.ngày Trong chế phẩm đá san hơ có mật độ vi khuẩn thấp hơn, khoảng 74.109 cfu/g hiệu xử lý đến 38% hoạt tính trung bình 0,45 mg N-NH4+/g/L.ngày Xét khả tái sử dụng chế phẩm đá san hô tốt mặt hiệu xử lý cấu trúc giá thể ổn định Chủng vi khuẩn dùng thí nghiệm Nitrosomonas mobilis Nitrobacter vulgaris phân lập từ chế phẩm thương mại Ngoài ra, chủng khác ghi nhận đặc điểm đại thể, vi thể đồng thời lưu trữ lại dùng cho nghiên cứu định danh giống vi khuẩn nitrate hoá sau ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC ĐỒ THỊ x CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu cần đạt 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Quy trình ni tôm giống 2.1.1 2.1.2 2.1.3 Yêu cầu chung môi trường nuôi Chu kỳ phát triển tôm giống Các yếu tố ảnh hưởng đến tôm giống .6 2.2 Hệ vi khuẩn nitrat hóa 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 Đặc điểm chung Vi khuẩn oxi hoá ammonia Vi khuẩn oxi hoá nitrite 17 Khả bám dính chất mang nhóm vi khuẩn nitrat hóa 23 2.3 Quá trình nitrate hoá 24 2.3.1 2.3.2 2.3.3 Quá trình oxi hố ammonia Nitrosomonas sp 27 Quá trình oxi hoá nitrite Nitrobacter sp 29 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình nitrate hố .33 2.4 Lên men thu sinh khối vi khuẩn 34 iii 2.5 Kỹ thuật cố định tế bào 37 2.5.1 2.5.2 2.5.3 Chất mang cố định tế bào .37 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 38 So sánh tế bào cố định tế bào tự 39 2.6 Giá thể hữu bacterial cellulose (BC) 40 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 40 Vai trò bacterial cellulose Acetobacter xylinum 41 Các đặc điểm cấu trúc BC 42 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tạo BC .43 2.7 Tổng quan đá san hô 45 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.4 Giới thiệu san hô 45 Cấu tạo san hô 46 Sinh sản san hô 47 San hô nhân tạo đá san hô 49 2.8 Các nghiên cứu liên quan 50 2.8.1 2.8.2 Cố định hệ vi khuẩn nitrate hoá lên bột gỗ .50 Cố định hệ vi khuẩn nitrat hóa đất sét .52 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 54 3.1 Vật liệu 54 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 Giống vi sinh vật 54 Dụng cụ thiết bị 54 Hoá chất 54 Các loại môi trường 54 3.2 Sơ đồ thí nghiệm 55 3.2.1 3.2.2 3.2.3 Xây dựng sưu tập giống 55 Tạo chế phẩm vi sinh xử lý ammonia nitrite .56 Giải thích sơ đồ 57 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 57 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 Khảo sát đặc điểm sinh học 57 Lên men thu sinh khối 61 Tạo giá thể 63 Phương pháp tạo chế phẩm vi sinh 67 Các phương pháp vi sinh 68 Các phương pháp hoá lý 70 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 76 iv 4.1 Kết xây dựng sƣu tập giống 76 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 Giống vi khuẩn CKL-1a 76 Giống vi khuẩn CKL-2a 77 Giống vi khuẩn PKL-2 78 Giống vi khuẩn PKL-3 79 Giống vi khuẩn PKL-5 79 Giống vi khuẩn PKL-6 80 Giống vi khuẩn NKL-1 80 Giống vi khuẩn NKL-2 81 4.2 Khảo sát trình cố định tạo chế phẩm 82 4.2.1 4.2.2 4.2.3 Giá thể BC 82 Giá thể đá san hô 85 Sơ kết trình cố định vi khuẩn 89 4.3 Thử nghiệm chế phẩm 89 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 4.3.5 Chế phẩm dạng lỏng .89 Chế phẩm BC 93 Chế phẩm đá san hô 97 Khả tái sử dụng 100 Sơ kết hiệu loại chế phẩm .104 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 106 5.1 Kết luận 106 5.1.1 5.1.2 Về sưu tập giống 106 Về khảo sát chế phẩm 106 5.2 Kiến nghị 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM 112 PHỤ LỤC CÁC ỨNG DỤNG CỦA BACTERIAL CELLULOSE 116 PHỤ LỤC PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN NITRATE HOÁ 118 v CÁC TỪ VIẾT TẮT AMO Ammonia monooxygenase NO2- OR Nitrite oxidoreductase HAO Hydroxylamine oxidoreductase ETC Electron transport chain RET Reverse electron transport PMF Proton motive force BC Bacterial cellulose CR Coral rock TAN Total ammonia nitrogen (NH3 + NH4+) cyt cytochrome vi DANH MỤC HÌNH Hình 1-1 Phương pháp dòng chảy qua lớp đệm Hình 1-2 Phương pháp dịng chảy chìm Hình 2-1 Vịng đời phát triển tơm sú Hình 2-2 Chu trình ammonia bể ni tơm Hình 2-3 Cây phát sinh lồi hệ vi khuẩn oxi hoá ammonia (màu xanh) oxi hoá nitrite (màu đỏ) dựa phân tích 16S rRNA Hình 2-4 Tế bào Nitrosomonas europaea kính hiển vi quang học điện tử 15 Hình 2-5 Tế bào Nitrosomonas eutropha kính hiển vi điện tử 16 Hình 2-6 Tế bào Nitrosomonas marina kính hiển vi điện tử 16 Hình 2-7 Tế bào Nitrosomonas mobilis kính hiển vi điện tử 17 Hình 2-8 Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky nhuộm Gram âm, có dạng que ngắn 21 Hình 2-9 Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau tháng nuôi cấy pH 10 21 Hình 2-10 Tế bào Nitrobacter alkalicus kính hiển vi điện tử Lớp vỏ bên (S) cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với 22 Hình 2-11 Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis nhuộm Gram âm, có dạng lê 22 Hình 2-12 Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp introcytoplasmic carboxysome 23 Hình 2-13 Hướng di chuyển electron dựa khử chất tế bào Những chất khử chất cho điện tử, chất oxi hố ln chất nhận điện tử 26 Hình 2-14 Hai giai đoạn q trình nitrate hố 27 Hình 2-15 Con đường vận chuyển điện tử Nitrosomonas 31 Hình 2-16 Con đường vận chuyển điện tử Nitrobacter 32 Hình 2-17 Kiểu sinh trưởng tế bào vi sinh vật nồi lên men theo mẻ Sáu pha chu trình sinh trưởng (1) thích nghi, (2) tăng tốc, (3) log, (4) chậm dần, (5) ổn định, (6) suy vong 35 Hình 2-18 Hình thái tế bào Acetobacter xilinum 41 Hình 2-19 BC tạo từ môi trường tĩnh (a) môi trường lắc (b) 43 Hình 2-20 Cấu tạo polip san hơ 47 Hình 2-21 Cấu trúc đá san hơ kính hiển vi điện tử (x 8500) 49 Hình 2-22 Chế phẩm sau cố định, kích thước 300-1500µm Thời gian cố định A: 6h, B: 12h, C: 24h D: 72h 51 Hình 2-23 Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L Sau ngày cố định, khả nitrate hoá chế phẩm đạt cao 51 Hình 2-24 Đồ thị thể hoạt lực nitrate hoá chế phẩm theo thời gian 51 Hình 2-25 Đồ thị thể hoạt lực phân giải ammonia chế phẩm (a) tỉ lệ 1:4000 (1 viên 4L nước thải), (b) tỉ lệ 1:10000 (1 viên 10L nước thải) 53 Hình 2-26 Cấu trúc lỗ xốp viên đất sét sử dụng để cố định vi khuẩn (a) bề mặt bên (x100), (b) cấu trúc lỗ bên (x600), (c) cấu trúc lỗ trung tâm hạt (x50) 53 Hình 3-1 Qui trình phân lập hệ vi khuẩn nitrate hoá 58 vii Hình 3-2 Lên men vi khuẩn nitrate hố bình có màu hồng nhạt bên trái lên men Nitrosomonas S1; bình cịn lại lên men Nitrobacter B1 63 Hình 3-3 BC xử lý tốt 66 Hình 3-4 Do môi trường bị ô nhiễm nhiệt độ tăng nên san hơ chết (dead coral) ngồi tự nhiên nhiều Ảnh chụp từ bãi biển Ninh Chử, tỉnh Ninh Thuận 66 Hình 3-5 Mẫu chuẩn độ từ vàng sang cam 71 Hình 3-6 Hố chất dùng để định lượng ammonia 72 Hình 3-7 Đường chuẩn N-NH4+ 73 Hình 3-8 Đường chuẩn NO2- 75 Hình 2-19 (a) Hệ vi sợi BC (b) thực vật, độ phóng đại x5000 117 viii DANH MỤC BẢNG Bảng Các môi trường khác dùng ni cấy vi khuẩn oxi hố ammonia Môi trường 1, đề xuất tương ứng Soriano Walker (1968), Watson (1971) Krinmel Harms (1982) vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường đề xuất Watson (1965) vi khuẩn phân lập từ biển môi trường đề xuất Koops cộng (1976) vi khuẩn phân lập từ nước lợ Tất môi trường cần g/l CaCO3 g/l HEPES chất đệm pH 11 Bảng Đặc điểm hình thái-sinh hố vi khuẩn oxi hoá ammonia 12 Bảng Các môi trường khác cho vi khuẩn oxi hố nitrite: mơi trường A (khống vơ cơ) đề xuất Bock (1893), phân lập vi khuẩn từ đất; môi trường B (khống vơ cơ) đề xuất Watson Waterbury (1971), phân lập vi khuẩn từ biển; môi trường C (hỗn hợp) đề xuất Bock (1983) môi trường C (hữu cơ) không cho NaNO2 Chỉnh pH sau hấp tiệt trùng, thường sử dụng NaHCO3 10% 18 Bảng Đặc điểm hình thái-sinh hố vi khuẩn oxi hố nitrite 19 Bảng Năng lượng thu từ q trình oxi hố hợp chất vô so với từ glucose (-686 kcal/mol) 24 Bảng Ưu nhược điểm số phương pháp cố định tế bào 39 Bảng Mơi trường ni cấy vi khuẩn nitrate hố phân lập từ bể ương 53 Bảng Kết khảo sát khả phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) giá thể BC 82 Bảng Kết khảo sát khả phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) giá thể đá san hô 85 Bảng 10 Kết phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) chế phẩm dạng lỏng 89 Bảng 10 Kết phân giải nitrite (mg NO2-/L) chế phẩm dạng lỏng 91 Bảng 12 Kết phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) chế phẩm BC 93 Bảng 12 Kết phân giải nitrite (mg NO2-/L) chế phẩm BC 95 Bảng 13 Kết phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) chế phẩm CR 97 Bảng 13 Kết phân giải nitrite (mg NO2-/L) chế phẩm CR 99 Bảng 10 Tiêu chuẩn hàm lượng cho phép ammonia, nitrite nitrate ao nuôi tôm giống tôm thương phẩm 113 Bảng 11 Hệ số chuyển đổi N-NH3 nước ứng với nhiệt độ pH 114 Bảng 12 Các trường hợp xảy phân lập giống theo cách 119 Bảng 13 Các trường hợp xảy phân lập giống theo cách 119 Bảng 14 So sánh ưu nhược điểm phương pháp phân lập giống 120 ix CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Về sƣu tập giống Chúng phân lập ni cấy giống vi khuẩn nitrate hố từ chế phẩm thương mại nước biển Trong đó:  Giống CKL-1a phân lập từ chế phẩm Eco-Bio, sau bước kiểm tra xác định thuộc dòng vi khuẩn oxi hoá ammonia Cùng với kết định danh Trung tâm phân tích Hải Đăng, giống CKL-1a Nitrosomonas mobilis Giống CKL-1a huấn luyện thích nghi trở thành giống CKL-1b  Giống CKL-2a phân lập từ chế phẩm Eco-Bio, sau bước kiểm tra xác định thuộc dịng vi khuẩn oxi hố nitrite Cùng với kết định danh Trung tâm phân tích Hải Đăng, giống CKL-1a Nitrobacter vulgaris Giống CKL-2a huấn luyện thích nghi trở thành giống CKL-2b  Giống PKL-2, PKL-3, PKL-5 PKL-6 phân lập từ chế phẩm Pondprotect, kiểm tra bước đại thể vi thể nhằm tách thành giống riêng biệt để phục vụ cho bước kiểm tra hoạt tính nghiên cứu sau  Giống NKL-1 phân lập từ nước biển, kiểm tra bước đại thể vi thể nhằm tách thành giống riêng biệt để phục vụ cho bước kiểm tra hoạt tính nghiên cứu sau  Giống NKL-2 phân lập từ nước biển, có đặc điểm hình thái nhiều vi khuẩn cộng sinh với tạo thành lớp bao nhầy, khuẩn lạc có biểu hình khác biệt so với giống nitrate hố thơng thường, nên chúng tơi giữ giống lại để phục vụ cho nghiên cứu đặc điểm tổ hợp vi khuẩn 5.1.2 Về khảo sát chế phẩm Chúng tơi tóm tắt thơng số quan trọng q trình tạo chế phẩm sau:  Quá trình lên men thu hệ vi khuẩn nitrate hoá thực tuần, có sục khí, nhiệt độ 300C, pH từ 7,5-8,5 Mật độ vi khuẩn 22.109 cfu/ml  Để thực việc bẫy hấp phụ lên giá thể BC đá san hô, dùng dịch hỗn hợp vi khuẩn có tỉ lệ Nitrosomonas Nitrobacter 2:1 Qua khảo sát, thời gian bẫy hấp phụ 48 tỉ lệ giá thể dịch vi khuẩn 1/2 giá thể BC có hiệu xử lý ammonia tốt Tương tự, giá thể đá san hơ có thời gian bẫy hấp phụ 48 tỉ lệ giá thể dịch vi khuẩn 1/4 Giá thể sau thời gian để hấp phụ dịch, gắp ủ khô 48 trước đem xử lý ammonia 106 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Trong tỉ lệ xử lý (1/10, 1/50, 1/100, 1/500 1/1000) tỉ lệ 1/1000 chế phẩm tự do, giá thể BC đá san hô cho hiệu tốt Hiệu xử lý hoạt tính trung bình tương tự 35% 0,43 mg N-NH4+/g/L.ngày  Khả tái sử dụng đá san hô tốt BC thể hiệu xử lý cấu trúc ổn định giá thể tương tự ban đầu Trong giá thể BC thực tốt lần sử dụng  Đối với loại giá thể, kiểm tra độ lặp lại hiệu xử lý cách thực thông số bẫy hấp phụ tỉ lệ xử lý, chúng tơi ghi nhận hiệu hoạt tính chế phẩm tương đương  Đối với tỉ lệ xử lý 1/500 1/1000, sử dụng giá thể BC đá san hô bảo quản nhiệt độ 40C tháng Kết cho thấy giá thể BC đá san hơ có hiệu xử lý cao sau thời gian bảo quản Như vậy, giá thể đá san hô với ưu điểm rẻ, tái sử dụng nhiều lần, vừa giá thể vừa chất ổn định độ kiềm nước, đề nghị sử dụng đá san hô nguyên liệu để tạo chế phẩm xử lý ammonia nitrite bể ương ấu trùng tôm ao, hồ nuôi thuỷ sản khác 5.2 Kiến nghị Để chế phẩm đá san hô áp dụng vào thực tế, kiến nghị cần thực thêm nghiên cứu sau:  Khảo sát thông số bẫy hấp phụ khoảng nhỏ hơn, nhằm tối ưu hố q trình cố định lên đá san hô  Khảo sát lại tỉ lệ Nitrosomonas Nitrobacter dịch vi khuẩn theo hướng tăng lượng vi khuẩn oxi hoá nitrite giảm lượng vi khuẩn oxi hoá ammonia để giá thể sau q trình cố định có hoạt tính phân giải ammonia cao không khả phân giải nitrite Nitrobacter giá thể  Thực thí nghiệm trực tiếp bể nuôi tôm Cần Giờ, với giá thể đá san hô cố định vi khuẩn CKL-1b CKL-2b dòng huấn luyện thích nghi để kiểm tra hiệu xử lý nào, ảnh hưởng hệ vi sinh vật địa đến giá thể so với chế phẩm đối chứng (cố định CKL-1a CKL-2a)  Tăng tỉ lệ xử lý lên 1/5000 1/10000 để kiểm tra hoạt tính phân giải ammonia giá thể thay đổi theo xu hướng Ở tỉ lệ xử lý vậy, nên rút ngắn thời gian khảo sát từ 27 ngày xuống ngày để tránh yếu tố sai số biến động ammonia hệ vi sinh tự gây nên  Thử nghiệm mơi trường có hàm lượng muối khác để tăng phạm vi áp dụng chế phẩm điều kiện nuôi cụ thể 107 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Tiếp tục theo dõi số lần tái sử dụng bể ni thực tế Vì thử nghiệm quy mô PTN, không tính khả hệ vi khuẩn nitrate hố địa cố định giá thể tăng sinh, dẫn đến tăng cường hoạt lực giá thể sau vụ nuôi  Giá thể đá san hô có giá thành 5000 VND/kg mua từ cửa hàng cá cảnh Tuy nhiên mở rộng quy mơ lớn bị hạn chế nguồn cung cấp Vì cần thiết phải tạo loại giá thể có chất tương tự đá san hơ Ngồi ra, lâu dài, chúng tơi kiến nghị cần thực thêm thí nghiệm sau nhằm tăng khả thương mại hoá chế phẩm:  Cơ sở sinh hóa q trình nitrate hóa, phản nitrate hóa, anammox  Phân lập định danh dòng vi khuẩn nitrate hóa trại ni tơm  Tối ưu hóa q trình thu nhận sinh khối vi khuẩn nitrate hóa: chế độ batch, fed-batch, liên tục  Rà sốt loại giá thể có diện tích riêng bề mặt lớn độ ổn định cao môi trường nước để cố định hệ vi khuẩn khác  Khảo sát số lần tái sử dụng chất mang giải pháp tái hoạt hoá chế phẩm sau lần sử dụng  Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm nhằm đảm bảo hoạt tính đến tay người tiêu dùng  Lên men thu sinh khối vi khuẩn nitrate hóa mơi trường rẻ tiền: nước thải nuôi tôm, nước biển  Sản xuất chế phẩm qui mơ pilot khắc phục thối hoá giống mẻ lên men  Khảo sát cơng ty sản xuất chế phẩm nitrate hóa thị trường: thị phần, công nghệ tiềm lực phát triển 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC [1] Đào Ngọc Châu, Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật Đại học Bách Khoa TPHCM: 2008 [2] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh - tập NXB Đại học Quốc Gia TPHCM: 2006 [3] Nguyễn Đức Lượng cộng sự, Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học - tập - Thí nghiệm Vi sinh vật học NXB Đại học Quốc Gia TPHCM: TPHCM, 2006 [4] Lương Đình Phẩm cộng sự, Cơ sở khoa học Công nghệ bảo vệ môi trường - tập - Cơ sở vi sinh Công nghệ bảo vệ môi trường NXB Giáo Dục: Hà Nội, 2009 [5] Lê Xuân Phương, Vi sinh vật công nghiệp NXB Xây Dựng: Hà Nội, 2001 [6] Nguyễn Thanh Phương cộng sự, Kĩ thuật sản xuất giống nuôi giáp xác Trường Đại học Cần Thơ, khoa Thuỷ Sản: 2009 [7] Nguyễn Thị Thu Vân cộng sự, Thí nghiệm phân tích định lượng NXB Đại học Quốc Gia TPHCM: 2006 TÀI LIỆU NGOÀI NƢỚC [8] Ameel, J.; Ruzycki, E.; Axler, R P., Ammonium nitrogen, low level Manual Salicylate method University of Minnesota 1998 [9] APHA, 4500-NH3 F Phenate method In Standard Methods for Examination of Water and Wastewater: 1999 [10] Arp1, D J.; Stein, L Y., Metabolism of Inorganic N Compounds by AmmoniaOxidizing Bacteria Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 2003 [11] Bergey, D H.; Murray, E G D.; Smith, N R., Bergey's Manunal of Determinative Bacteriology ed.; The William and Wilkins company: 1957 [12] Bothe, H.; Ferguson, S J.; Newton, W E., Biology of the Nitrogen Cycle 2007 [13] Brenner, D J.; Krieg, N R.; Staley, J T.; Garrity, G M., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology-Part C ed.; Springer: 2005 [14] Brenner, D J.; Krieg, N R.; Staley, J T.; Garrity, G M., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology-Part A ed.; Springer: 2005 [15] Capone, D G.; Bronk, D A.; Mulholland, M R.; Carpenter, E J., Nitrogen in the marine environment ed.; Elsevier Inc.: 2008 [16] Chawla, P R.; Bajaj, I B.; Survase, S A.; Singhal, R S., Microbial Cellulose: Fermentative Production and Applications Food technology and biotechnology 2009, 47 (2), 107–124 109 [17] Chena, J.-C.; Liua, P.-C.; Leia, S.-C., Toxicities of ammonia and nitrite to Penaeus monodon adolescents National Taiwan Ocean University 1990 [18] Colliver, B B.; Stephenson, T., Production of nitrogen oxide and dinitrogen oxide by autotrophic nitrifiers Biotechnology Advances 2000, 219-232 [19] Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E., Ecophysiology and Biochemistry ed.; Springer: 2006; Vol 2, p 1156 [20] Dworkin, M.; Falkow, S.; Rosenberg, E.; Schleifer, K.-H.; Stackebrandt, E., Proteobacteria: Alpha and Beta Subclasses ed.; Springer: 2006; Vol 5, p 964 [21] FAO, Improving Penaeus monodon hatchery practices Manual based on experience in India Fisheries technical paper 2007 [22] Francis-Floyd, R.; Watson, C.; Petty, D.; Pouder, D B., Ammonia in Aquatic Systems 1990 [23] Guerrero, M A.; Jones, R D., Photoinhibition of marine nitrifying bacteria Marine Ecology Progress Series 1996 [24] Hagopian, D S.; Riley, J G., A closer look at the bacteriology of nitrification Aquacultural Engineering 1998 [25] Lazur, A., Growout Pond and Water Quality Management JIFSAN Good Aquacultural Practices Program 2007 [26] Lin, Y.-C.; Chen, J.-C., Acute toxicity of nitrite on Litopenaeus vannamei (Boone) juveniles at different salinity levels Aquaculture 2003 [27] Manju, N J.; Deepesh, V.; Achuthan, C.; Rosamma, P.; Singh, I S B., Immobilization of nitrifying bacterial consortia on wood particles for bioaugmenting nitrification in shrimp culture systems Aquaculture 2009, 294, 65-75 [28] Prescoot, L M., Microbiology ed.; McGraw−Hill: New York, 2002 [29] Shan, H.; Obbard, J P., Ammonia removal from prawn aquaculture water using immobilized nitrifying bacteria Applied Microbiology and Biotechnology 2001 [30] Sorokin, D Y.; Muyzer, G.; Brinkhoff, T.; Kuenen, J G.; Jetten, M S M., Isolation and characterization of a novel facultatively alkaliphilic Nitrobacter species, N alkalicus sp nov Archives of Microbiology 1988, (170), 345–352 [31] Starkenburg, S R.; Chain, P S G.; Sayavedra-Soto, L A.; Hauser, L.; Land, M L.; Larimer, F W.; Malfatti, S A.; Klotz, M G.; Bottomley, P J.; Arp, D J.; Hickey, W J., Genome Sequence of the Chemolithoautotrophic Nitrite-Oxidizing Bacterium Nitrobacter winogradskyi Nb-255 Applied and environmental Microbiology 2006, 72, (3), 2050-2063 [32] Tsai, S.-J.; Chen, J.-C., Acute toxicity of nitrate on Penaeus monodon juveniles at different salinity levels Aquaculture 2002, 213, 163-170 [33] Wallace, W.; Nicholas, D J D., The biochemistry of nitrifying microorganisms Biotechnology Review 1969, 44, 359-391 110 [34] Wickins, J F.; Lee, D O C., Crustacean Farming Ranching and Culture ed.; 2002 TÀI LIỆU INTERNET [35] Biofiltration for aquaculture http://www.biofilters.com/webfilt.htm [36] San hô http://wapedia.mobi/vi/San_hô [37] San hô tự nhiên http://vi.wikipedia.org/wiki/San_hô [38] Sera ammonium/ ammonia Test http://www.sera.de/nc/us/products/gardenpond/pond-water-analysis/single-water-test-kits/sera-ammonium-ammoniatest.html?sword_list[0]=ammonium [39] Water quality requirements for Penaeus monodon culture in Malaysia www.fishdept.sabah.gov.my 111 PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM Một chế phẩm vi sinh cố định dùng xử lý ammonia nitrite cần đạt tiêu chí sau: 1) Làm giảm ammonia nitrite xuống mức cho phép so với tiêu chuẩn hành 2) Biểu điều 1) đồ thị theo dõi biến động ammonia nitrite suốt thời gian ni thực tế Ngồi ra, tiêu khác góp phần đánh giá hiệu chế phẩm: 3) Ứng với gam chế phẩm có hiệu suất phân giải ammonia (N-NH4+/L.ngày) hay nitrite (NO2-/L.ngày) dùng để tính tốn lượng chế phẩm phù hợp với lượng nước cần xử lý 4) Biến động vi sinh vật đích bể nuôi giá thể nhằm đánh giá khả thích nghi trì hoạt lực chế phẩm điều kiện vùng miền khác 5) Số lần tái sử dụng chế phẩm mức độ tổn thất chế phẩm sau lần sử dụng Việc giúp đưa phương pháp hiệu nhằm tái thu hồi giá thể tái hoạt hoá khả phân giải Như vậy, chúng tơi trình bày thơng tin sau để đóng góp thêm số liệu cụ thể nhằm giúp đánh giá xác hoạt lực chế phẩm vi sinh 1.1 Hàm lƣợng cho phép ammonia, nitrite nitrate có bể ni 1.1.1 Các tiêu chuẩn hành Hiện có nhiều tiêu chuẩn nồng độ cho phép ammonia nitrite bể nuôi tôm, chọn tài liệu sau: Tài liệu kĩ thuật nuôi tôm sú (Penaeus monodon) tổ chức FAO, 2007 Tiêu chuẩn GAP (Good Aquacultural Practices) quản lý chất lượng nước ao nuôi tôm, 2007 Kĩ thuật sản xuất giống nuôi giáp xác trường Đại học Cần Thơ, 2009 Và số báo ghi nhận ngưỡng gây độc ammonia nitrite tơm sú Tuy có khác mức khuyến cáo cho phép ammonia nitrite có mặt ao ni, nhìn chung tài liệu khẳng định diện ammonia 112 nitrite gây bất lợi lớn cho phát triển tôm bên cạnh tác động loại vi sinh vật gây bệnh hay thơng số hố lý mơi trường khơng phù hợp khác Ngồi đơn vị mg/L để biểu hàm lượng, số tác giả dùng đơn vị %, ppt, ppm, ppb, mol/m3, kg/ha Cần lưu ý chuyển đổi qua lại đơn vị Bảng 16 Tiêu chuẩn hàm lượng cho phép ammonia, nitrite nitrate ao nuôi tôm giống tôm thương phẩm Chỉ tiêu Nhiệt độ (0C) pH Độ mặn (‰) TAN hay N-NH4+ (mg/L) Khí ammonia N-NH3 (mg/L) NO2- (mg/L) NO3- (mg/L) Ngƣỡng tối ƣu 28-31 [21] 26-30 [25] 7,8-8,2 [21] 7,0-8,5 [25] 29-34 [21] 15-32 [25]