Enzyme chìa khoá là nitrite oxidoreductase (NO2- OR), là một enzyme có chứa nhân Fe-S và trung tâm hoạt động chứa Mo. Trong tế bào vi khuẩn oxi hoá nitrite, cơ chế chung như sau:
NO2- + H2O NO3- + 2[H+ + e-] + 17,8 kcal/mol
Khác với quá trình oxi hoá ammonia, nguyên tử oxy dùng để oxi hoá NO2- được lấy từ H2O thay vì phân tử O2. Hai electron sinh ra từ quá trình oxi hoá NO3- được chuyển đến cytochrome c rồi đến cytochrome aa3 và kết hợp với oxy từ phân tử O2 để tạo thành nước trong nguyên sinh chất. Điều cần lưu ý là cytochrome aa3 còn hoạt động như một bơm proton, khi nó thực hiện khử O2 về nước thì cũng bơm H+ ra periplasm.
Ngoài ra, từ enzyme NO2- OR, 2 electron còn được chuyển qua cytochrome c550 và đến phức cytochrome bc1. Electron sau khi qua phức này sẽ kết hợp với ubiquinone để tạo thành ubiquinol, và đến lượt mình ubiquinol sẽ nhả điện tử và proton cho NAD+
để chuyển NAD+ thành NADH. Con đường này là ngược so với chiều vận chuyển điện tử thông thường của cytochrome bc1, để electron di chuyển được thì cần phải có tỉ lệ cytochrome c550 (dạng khử)/cytochrome c550 (dạng oxi hoá) và ubiquinol/ubiquinone đủ cao để đẩy H+
chuyển từ periplasm và cytoplasm thông qua phức cytochrome bc1, nhờ đó sẽ hút electron chuyển từ cytochrome c550 về phía ubiquinone. Tương tự như vậy, để electron chuyển từ ubiquinol đến enzyme NADH oxidoreductase (NADH de- hydrogenase) thì cần có tỉ lệ ubiquinol/ubiquinone và NAD+/NADH đủ cao để dẫn H+
30
từ periplasm và tạo nên dòng điện tử từ ubiquinol chuyển qua enzyme NADH dehy- drogenase, kết quả là sản sinh ra NADH. Tế bào sẽ sử dụng NADH sinh ra cho các hoạt động oxi hoá phosphoryl hoá ở chuỗi vận chuyển điện tử từ FMN đến cytoch- rome c560 đển tái tạo ATP, và dùng NADH cho chu trình Calvin nhằm cố định CO2.
Mặt khác, nếu so sánh với chiều di chuyển thông thường điện tử ở các vi khuẩn hoá năng vô cơ khác, thì sự chênh lệch mức điện thế giữa NADH/NAD+ và cyt c (dạng khử - Fe3+)/ cyt c (dạng oxi hoá - Fe2+) ắt hẳn phải nhỏ hơn mức chênh lệch thông thường đến mức thế điện hoá H+ (~200 mV) không cho sự di chuyển của H+ đi vào periplasm nếu electron có di chuyển từ NADH đến cytochrome c. Điều này có nghĩa, việc di chuyển điện tử từ cytochrome c đến NADH oxidoreductase nhằm khử NAD+ thành NADH tuy ngược với hướng vận chuyển thông thường thì ở vi khuẩn oxi hoá nitrite điều này vẫn xảy ra nhờ các bơm proton đặt trong các phức vận chuyển điện tử gắn trên màng.
Ngoài ra, thế điện hoá H+ ở hai bên màng không phải lúc nào cũng ổn định vì H+ ở periplasm vẫn bị thấm vào bên trong qua các lỗ nhỏ ở trên màng, điều này làm giảm gradient nồng độ H+ và tăng mật độ H+ bên trong tế bào chất, vi khuẩn oxi hoá nitrite giải quyết khó khăn này bằng cách đảo lại chiều tổng hợp ATP từ bên trong ra bên ngoài nhằm phục hồi lại gradient H+ ở periplasm luôn cao hơn cytoplasm [24].
31
32
33
2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nitrate hoá
Các vi khuẩn hoá năng vô cơ nói chung sở hữu những cơ chế sinh hoá đặc biệt giúp chúng tồn tại và phân bố trong một khoảng không gian rất rộng ở mặt đất và dưới nước. Người ta cũng phân lập được chúng trong cát và nước mưa. Do là vi sinh vật tự dưỡng, nên chúng có khả năng tự tổng hợp sinh khối nhờ có cơ chế sinh hoá chứa đủ hệ enzyme phân giải các chất vô cơ, ví dụ như một số loài có thể đồng thời oxi hoá urea và methane cùng lúc với dị hoá rất nhiều loại hydrocarbon khác nhau. Hơn nữa, các tế bào này có khả năng duy trì sự sống trong điều kiện thiếu nguồn cơ chất bằng nhờ giảm hoạt động hô hấp nội bào và đồng hoá xuống mức thấp nhất. Cần lưu ý là hệ vi khuẩn nitrate hoá bị ức chế bởi ánh sáng, do vậy sống phân bố chủ yếu trong bùn hoặc giá thể vô cơ chứ ít khi ở dạng tự do [23].
o Nồng độ ammonia
Theo nghiên cứu của Anthonisen và cộng sự (1976) khi hàm lượng ammonia vượt quá từ 10 đến 150 mg/L thì sẽ ức chế quá trình oxi hoá ammonia. Quá trình oxi hoá nitrite nhạy cảm hơn, nếu ammonia vượt hơn mức 0,1 đến 1 mg/L thì vi khuẩn oxi hoá nitrite đã bị ức chế. Đối với nồng độ ion NO2- thì từ 0,22 đến 2,8 mg/L sẽ ức chế quá trình oxi hoá nitrite. Hiện chưa có nghiên cứu nào ghi nhận nồng độ NO3- ở mức nào sẽ ức chế quá trình oxi hoá nitrite.
o Nồng độ oxy hoà tan (DO)
Tuy hệ vi khuẩn nitrate hoá là loài hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong thời gian dài ở điều kiện thiếu oxy dưới các tầng nước phía đáy hồ, trong các bể xử lý nước thải và bùn hoạt tính. Người ta đã ghi nhận được mật độ 102 tế bào/ml vi khuẩn oxi hoá ammonia trong một bể xử lý kị khí có nồng độ TAN 52 mg/L. Ở các bể xử lý nước thải liên tục thì nồng độ vi khuẩn oxi hoá ammonia đạt tối ưu ở nồng độ oxi hoà tan khoảng 0,2 mg/L. Quá trình oxi hoá ammonia vẫn xảy ra ở mức độ oxi hoà tan thấp 0,05 mg/L khi phân giải được một lượng đáng kể ammonia. Việc phát triển các bể xử lý hiếu khí kín có một vài khu vực kị khí cục bộ cho phép tiến hành đồng thời quá trình nitrate hoá và phản nitrate hoá, chuyển từ ammonia ra đến N2 (Davidson và cộng sự, 1986). Nồng độ oxi hoà tan tối ưu cho hệ vi khuẩn oxi hoá nitrite phát triển tốt là 3-4 mg/L O2 (Prosser, 1989).
o Nhiệt độ
Vi khuẩn nitrate hoá là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát triển trong khoảng 25-300C. Đối với quá trình oxi hoá ammonia vẫn diễn ra ở nhiệt độ từ 7-350C trong khi quá trình oxi hoá nitrite thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn từ 5-420C.
34
o pH dung dịch
Hầu hết các vi khuẩn nitrate hoá có giá trị pH tối ưu dao động trong khoảng 7,5- 8,0. Tại giá trị pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 10 thì quá trình oxi hoá nitrite diễn ra rất chậm và bị ức chế. Quá trình oxi hoá ammonia thì làm giảm tính kiềm của môi trường, vì thế độ đệm của pH của môi trường là rất quan trọng, trong một số trường hợp cần bổ sung kiềm để giữ pH. Vi khuẩn Nitrosomonas thì hoạt động trong khoảng pH 6,7- 9,2 trong khi vi khuẩn Nitrobacter thì hoạt động trong khoảng pH 8-9,2. Sự thích nghi của vi khuẩn đối với giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều đòi hỏi phải có một khoảng thời gian. Trong nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn tự dưỡng có thể thích nghi được ở cả giá trị pH rất thấp như 3-4 hoặc giá trị pH rất cao 11-12. Trong các nguồn nước thải thường có pH nằm trong dải trung tính và kiềm nhẹ, vì thế quá trình nitrate hoá vẫn diễn ra thuận lợi mà ít cần sự tác động chỉnh pH về pH tối thích.
o Sự có mặt của các chất độc
Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. đều nhạy cảm với một vài hợp chất độc
thường gặp trong nước thải. Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm của Nitrosmonas sp. thường cao hơn với Nitrobacter sp., các hợp chất này gây ngừng quá trình oxi hoá nitrite vì ức chế các hệ enzyme trên màng của tế bào. Hầu hết các hợp chất diệt khuẩn đều tác động nghiêm trọng đến hoạt động sống của vi khuẩn oxi hoá nitrite (điều này giải thích vì sao các trang trại nuôi trồng thuỷ sản có nguồn nước thải bị ô nhiễm hữu cơ quá cao vì trong quá trình nuôi, người ta đã sử dụng chất diệt khuẩn để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh cho động vật nuôi trồng, đồng thời diệt luôn hệ vi khuẩn có lợi, làm cho khả năng tự làm sạch tự nhiên của ao nuôi bị mất tác dụng). Có thể liệt kê một vài hợp chất gây ức chế vi khuẩn oxi hoá nitrite như sau: nitrapyrin (2-chloro-6-trichloromethyl- pyridine), allylthiourea (2-propenyl-thiourea), sodium azide (NaN3), DIECA (diethyl- dithiocarbamate), Acetylen (C2H2), sodium chlorate (NaClO3).
2.4 Lên men thu sinh khối vi khuẩn
Các vi sinh vật có thể nuôi trong môi trường nuôi cấy theo mẻ, theo mẻ có bổ sung, hoặc nuôi cấy liên tục. Trong quá trình thu nhận sinh khối vi khuẩn nitrate hoá, chúng tôi sử dụng phương pháp lên men theo mẻ (thời gian 1 tuần), dựa vào sự thay đổi pH ở dịch lên men mà chúng tôi bổ sung KOH 10% vào để chỉnh pH về 8. Trong phần trình bày dưới đây, sẽ điểm qua những điểm quan trọng của kĩ thuật lên men theo mẻ (batch) nhằm thu được sinh khối ở mật độ cao.
Trong lên men theo mẻ, môi trường nuôi vô trùng được cấy một lượng vi sinh vật thích hợp và không bổ sung môi trường nuôi cấy mới trong quá trình lên men. Đồng
35
thời oxy (thường được cung cấp ở dạng không khí vô khuẩn), chất chống tạo bọt, và acid hoặc base được đưa vào bình lên men nếu cần thiết.
Vi sinh vật được nuôi cố định trong bình lên men với một thể tích môi trường xác định. Vi sinh vật phát triển theo giai đoạn và tạo ra các sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta tiến hành các công đoạn cần thiết để thu lấy sản phẩm. Phương pháp lên men theo mẻ được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như acid amin, các chất kháng sinh.
Trong quá trình lên men theo mẻ, thành phần môi trường nuôi, nồng độ vi sinh vật, thành phần hóa học bên trong của vi sinh vật, hàm lượng protein hoặc chất chuyển hóa đích, tất cả đều thay đổi do kết quả của các giai đoạn sinh trưởng tế bào, chuyển hóa tế bào, và sự có mặt của các chất dinh dưỡng. Dưới những điều kiện đó, người ta thường quan sát thấy sáu pha điển hình của quá trình sinh trưởng: pha thích nghi, pha tăng tốc, pha log, pha chậm dần, pha ổ định, và pha chết [2].
Hình 2-17. Kiểu sinh trưởng tế bào vi sinh vật ở một nồi lên men theo mẻ. Sáu pha của chu trình sinh trưởng là (1) thích nghi, (2) tăng tốc, (3) log, (4) chậm dần, (5) ổn định, và (6) suy vong.
Thông thường không có sự tăng lập tức số lượng tế bào sau khi cấy chủng vào môi trường nuôi đã khử trùng. Giai đoạn khởi đầu này gọi là pha thích nghi, tế bào vi sinh vật thích nghi với các điều kiện môi trường mới. Các tế bào phải điều chỉnh tới một pH khác hoặc tới một nồng độ dinh dưỡng mới. Như là một phần đáp ứng thích nghi, một số con đường chuyển hóa chưa biểu hiện trước đó có thể được cảm ứng. Pha thích nghi thường xuất hiện khi tế bào của dung dịch cấy được lấy từ môi trường đã ngừng sinh trưởng (bước vào pha ổn định) do sự hạn chế cơ chất hoặc sự kiềm hãm của sản phẩm. Các tế bào này cần thời gian để khởi động lại các hệ thống chuyển hóa để phù hợp với môi trường mới. Độ dài pha thích nghi tương ứng với thời gian mà các tế bào cấy vào đã ở pha ổn định và các thông số mà môi trường nuôi cấy trước đó của tế bào khởi đầu khác với môi trường nuôi cấy mới. Trái lại, khi dung dịch cấy là môi
36
trường tế bào của quần thể tế bào đang sinh trưởng ở pha log, thì gần như không xảy ra pha thích nghi và sự tăng sinh có thể bắt đầu ngay lập tức. Sau pha thích nghi, là giai đoạn ngắn khi tốc độ sinh trưởng tế bào tăng cho đến khi đạt được sự tăng trưởng pha log được gọi là pha tăng tốc.
Trong pha tăng trưởng log, sinh khối tế bào trải qua vài lần nhân đôi và tốc độ sinh trưởng đặc hiệu của môi trường là không đổi. Với cơ chất dư và không có sự kìm hãm sinh trưởng bởi một hợp chất có trong môi trường nuôi, tốc độ tăng trưởng riêng độc lập với nồng độ cơ chất. Những thay đổi này và các bước liên quan khác có thể được biểu diễn dưới dạng toán học, giúp cho các kỹ sư có thể lập mô hình chính xác và sau đó nâng quy mô nuôi cấy tế bào vi sinh vật một cách dễ dàng hơn. Trong trường hợp này, tốc độ tăng sinh khối tế bào theo thời gian dX/dt, là tích số của tốc độ sinh trưởng riêng µ và nồng độ cơ chất X:
dX/dt = µX
Tương tự, tốc độ tăng số lượng tế bào dN/dt, là tích số của tốc độ sinh trưởng riêng µ và số lượng tế bào N:
dN/dt = µN
Tốc độ sinh trưởng riêng µ, là hàm của nồng độ cơ chất giới hạn S (nguồn carbon hoặc nitơ), tốc độ sinh trưởng tối đa µmax, và hằng số cơ chất đặc hiệu Ks. Cả S và K, được biểu diễn theo nồng độ, tức gam hoặc mol/L.
µ = µmaxS/(Ks+S)
Đôi khi, các nhà khoa học quan tâm đến thời gian nhân đôi hay thời gian thế hệ t, của vi sinh vật nuôi cấy hơn là tốc độ sinh trưởng riêng µ của chúng, với t = ln2/µ. Thời gian thế hệ nuôi cấy là thời gian, dưới các điều kiện xác định, để số lượng tế bào hay sinh khối tế bào tăng gấp đôi. Đối với vi sinh vật thường được nuôi trong môi trường nuôi cấy, giá trị của µmax thay đổi từ 2,1 đến 0,086h-1, tương ứng với thời gian nhân đôi khoảng 20 phút đến 8 giờ [2].
Khi có dư cơ chất (tức S>>Ks), thì µ = µmax và ta có tốc độ sinh trưởng pha log tối đa của nuôi cấy. Trong thực tế, giá trị của Ks thường thấp nên nồng độ cơ chất tương đương với Ks hiếm khi gặp trong sinh trưởng pha log.
Sau khi sử dụng hết cơ chất sinh trưởng chủ yếu trong môi trường hoặc sự tích tụ của các sản phẩm trao đổi chất cuối kìm hãm sự sinh trưởng, sự tăng sinh khối tế bào thậm chí dừng lại và tế bào bước vào pha ổn định. Trong pha này, mặc dù số lượng sinh khối không đổi nhưng sự chuyển hóa tế bào thường thay đổi mạnh; trong một
37
trường hợp, các hợp chất (chất chuyển hóa thứ cấp) được tổng hợp có thể là sản phẩm thương mại quan tâm. Ví dụ, các kháng sinh thường được sản sinh trong pha ổn định của chu trình sinh trưởng vi sinh vật. Độ dài của pha ổn định phụ thuộc vào sinh vật cụ thể và các điều kiện sinh trưởng.
Ở pha suy vong, năng lượng dự trữ của tế bào bị cạn kiệt và các hoạt động trao đổi chất dừng lại. Đa số các quy trình thương mại, phản ứng lên men dừng lại, tế bào được thu hồi trước khi pha chết bắt đầu.
2.5 Kỹ thuật cố định tế bào
Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật được định nghĩa là kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào nguyên vẹn vào một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn. Hiện tượng cố định là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên khi các tế bào có thể phát triển trên bề mặt và bên trong các cấu trúc tự nhiên.
Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước, tế bào sau khi sử dụng có thể được tái sử dụng nhiều lần, không bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn.
2.5.1 Chất mang cố định tế bào
Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng [5].
Điều kiện lựa chọn chất mang:
Giá thành chất mang phải rẻ.
Có tính chất cơ lý bền vững nên chịu được khuấy trộn, áp lực.
Chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng.