o Phân loại
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
41
o Đặc điểm hình thái
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di
động và không sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy.
Hình 2-18. Hình thái tế bào Acetobacter xilinum [1].
o Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị biến
đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Chúng không sử dụng muối NH4+ làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose. Ngoài ra, A. xy-
linum tạo: (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O,
(3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào
chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy.
2.6.2 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum
A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Trong môi trường tự
nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose
42
được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng
A. xylinum sản xuất cellulose. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp
cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
2.6.3 Các đặc điểm cấu trúc BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000-75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000- 40.000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1-9 μm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hy- drogen. BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ poly- mer hóa từ 2.000-6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000-20.000, trong khi mức po- lymer hóa ở thực vật là 13.000-14.000. So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:
43
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song và vuông góc. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử. Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong. Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2μm) lớn hơn sợi S-BC (0,05 – 0,10μm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [1].
Hình 2-19. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b) [1].
2.6.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men tạo BC
o Phƣơng pháp lên men: Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau. Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng
44
hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam. Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các chủng đột biến Cel-một cách ngẫu nhiên sau thời gian lên men. Các chủng Cel-
này sẽ không còn khả năng sản sinh BC nữa, vì thế làm hiệu suất BC giảm đáng kể.
o Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn tổng hợp cellulose là 25-300C.
o Giá trị pH: Nhìn chung, khoảng pH tối ưu để sản sinh BC là 4-7. Theo Hestrin và Schramm (1954) cho rằng pH dưới 7 là quan trọng hơn cả. Còn Fiedler và cộng sự thì cho pH từ 5-7 thì tối ưu. Hầu hết pH bằng 5 hay 6 được dùng trong các nghiên cứu. Nhưng để sản xuất cellulose công nghiệp thì pH từ 4-4,5 thì cho kết quả ưu thế hơn do giảm sự tạp nhiễm. A. xylinum đồng thời cũng sản xuất ra 2 loại: enzyme cellulase và bacterial cellulose. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, tuy đồng thời cùng sản xuất 2 loại: cellulose và cellulase nhưng có thể khống chế độ pH của môi trường dinh dưỡng để điều chỉnh mức độ sản sinh ra 1 trong 2 loại này. Khi pH ở mức từ 4-4,5 thì lượng BC được sản sinh ra nhiều nhất, còn pH ở mức từ 5-5,5 thì lượng enzyme cellulase được sản sinh cao hơn. Theo S. Hestrin và M. Schramm (1954), HCl và NaOH thích hợp dùng để điều chỉnh pH môi trường.
o Nồng độ oxy: Nồng độ O2 liên quan trực tiếp đến việc sinh tổng hợp BC. Khi không khí giàu O2 (duy trì nồng độ lớn hơn 39%) được cho vào tại thời điểm 8h sau khi nuôi cấy thì sản lượng BC tăng lên 1,5 lần và năng suất BC tăng từ 11% lên đến 18%. Tuy nhiên, với nồng độ O2 như thế, nhưng cho vào từ khi bắt đầu nuôi cấy thì số lượng tế bào suy giảm một cách nhanh chóng và hầu như vi khuẩn không sản sinh BC nữa. Điều này tác giả giải thích vì số lượng tế bào sống sót tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy quá thấp nên không thể tìm thấy BC trong điều kiện nồng độ O2 hòa tan cao (vì trong điều kiện này đã làm ức chế vi khuẩn). Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, tại nồng độ O2 10% và 15% một vài chủng A. xylinum cho sản lượng BC cao hơn ở nồng độ O2 là 20%. Khi nồng độ O2 tăng đến 30% sẽ làm giảm đáng kể sản lượng BC trong khi sự tăng trưởng của tế bào vẫn tiếp tục duy trì.
o Nguồn dinh dƣỡng carbon: Những cơ chất được đánh giá là cho sản lượng BC cao, bao gồm: glucose, sorbitol và manitol. Glycerol, galactose, lactose, su- crose và maltose được xem là cơ chất thích hợp. Những cơ chất mà vi khuẩn này không có khả năng sử dụng để tạo màng cellulose là sorbose, mannose, cel-
45
lobiose, erythritol, ethanol và acetate. Nguồn carbon từ glucose được cho là thích hợp trong việc tăng hiệu suất khả năng sản sinh BC.
o Nguồn dinh dƣỡng nitrogen: Môi trường được dùng để nghiên cứu là môi trường có 0,5% cao nấm men và 0,5% pepton. Đối với một số dòng A. xylinum
lại cho thêm tryptophan, dịch chiết ngô vào trong môi trường. Tuy nhiên dịch chiết ngô cho hiệu quả hơn cả. Các acid amin như methionin, glutamate thì luôn cần phải có trong môi trường vì những acid amin này có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp cellulose. Người ta tìm ra ammo- nium dihydrogen phosphate có thể được sử dụng thay cho cao nấm men như một nguồn cung cấp nitơ và thêm vào một lượng nhỏ dịch chiết bột bắp (từ 0,125 tới 0,5 ml/L) thì gia tăng sản lượng BC.
2.7 Tổng quan về đá san hô 2.7.1 Giới thiệu về san hô 2.7.1 Giới thiệu về san hô
San hô là các sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa tồn tại dưới dạng các thể polip nhỏ giống hải quỳ, thường sống thành các quần thể gồm nhiều cá thể giống hệt nhau. Các cá thể này tiết ra CaCO3 để tạo bộ xương cứng, xây nên các rạn san hô tại các vùng biển nhiệt đới.
Một "đầu" san hô thực tế được tạo từ hàng ngàn cá thể polip có cấu tạo gen giống hệt nhau, mỗi polip chỉ có dường kính vài milimet. Sau hàng ngàn thế hệ, các polip này để lại một khung xương là đặc trưng về loài của chúng. Mỗi đầu san hô phát triển nhờ sự sinh sản vô tính của các polip. San hô còn sinh sản hữu tính bằng các giao tử, được giải phóng đồng thời trong một thời kì từ một đến vài đêm liên tiếp trong kì trăng tròn.
Tuy san hô có thể dùng các tế bào châm (nematocyst) tiết chất độc tại các xúc tu để bắt phù du, loại động vật này thu nhận phần lớn dưỡng chất từ loại tảo đơn bào cộng sinh có tên tảo vàng đơn bào (zooxanthella). Do đó, hầu hết san hô phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời và phát triển ở các vùng nước trong và nông, thường ở độ sâu không tới 60 m. San hô có thể đóng góp lớn cho cấu trúc vật lý của các rạn san hô phát triển ở những vùng biển nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới, chẳng hạn như rạn san hô Great Barrier ở ngoài khơi bang Queensland, Úc. Các loại san hô khác không cần đến tảo và có thể sống ở vùng nước sâu hơn, chẳng hạn các loài trong chi Lophelia nước lạnh sống được tới độ sâu 3000m ở Đại Tây Dương. San hô còn được tìm thấy ở ngoài khơi bang Washington và quần đảo Aleutian ở Alaska, Mỹ.
San hô nằm trong lớp Anthozoa và được chia thành hai phân lớp, tùy theo số xúc tu (tua cảm) hoặc những đường đối xứng, và một loạt các bộ tương ứng với kiểu
46
xương ngoài, loại tế bào châm và phân tích di truyền ti thể. Phân lớp san hô với 8 xúc tu được gọi là san hô tám ngăn (Octocorallia) hay san hô mềm (Alcyonaria) và bao gồm các bộ san hô mềm (Alcyonacea), san hô sừng (Gorgonacea) và san hô lông chim (Pennatulacea). Những loài có nhiều số xúc tu lớn hơn 8 và là bội của 6 được gọi là san hô sáu ngăn (Hexacorallia) hay san hô tổ ong (Zoantharia). Nhóm này bao gồm các loài san hô đá (san hô tạo rạn) (Scleractinia), san hô tổ ong (Zoanthidea) và hải quỳ [36].
2.7.2 Cấu tạo san hô
Tuy một đầu san hô trông như một cơ thể sống, nhưng nó thực ra là đầu của nhiều cá thể giống nhau hoàn toàn về di truyền, đó là các polip. Các polip là các sinh vật đa bào với nguồn thức ăn là nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù du tới các loài cá nhỏ.
Polip thường có đường kính một vài milimet, cấu tạo bởi một lớp biểu mô bên ngoài và một lớp mô bên trong giống như sứa được gọi là ngoại chất. Polip có hình dạng đối xứng trục với các xúc tu mọc quanh một cái miệng ở giữa-cửa duy nhất tới xoang vị (hay dạ dày), cả thức ăn và bã thải đều đi qua cái miệng này.
Dạ dài đóng kín tại đáy polip, nơi biểu mô tạo một bộ xương ngoài được gọi là đĩa nền. Bộ xương này được hình thành bởi một vành hình khuyên chứa calci ngày càng dầy thêm. Các cấu trúc này phát triển theo chiều thẳng đứng và thành một dạng ống từ đáy polip, cho phép nó co vào trong bộ xương ngoài khi cần trú ẩn.
Polip mọc bằng cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc, đôi khi chia thành vách ngăn để tạo một đĩa nền mới cao hơn. Qua nhiều thế hệ, kiểu phát triển này tạo nên các cấu trúc san hô lớn chứa calci, và lâu dài tạo thành các rạn san hô.
Sự hình thành bộ xương ngoài chứa calci là kết quả của việc polip kết lắng aragonit khoáng từ các ion Ca2+
thu được từ trong nước biển. Tuy khác nhau tùy theo loài và điều kiện môi trường, tốc độ kết lắng có thể đạt mức 10 g/m² polip/ngày. Điều này phụ thuộc mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp hơn 90% so với giữa trưa.
Các xúc tu của polip bẫy mồi bằng cách sử dụng các tế bào châm được gọi là nematocyst. Đây là các tế bào chuyên bắt và làm tê liệt các con mồi như sinh vật phù du, khi có tiếp xúc, nó phản ứng rất nhanh bằng cách tiêm chất độc vào con mồi. Các chất độc này thường yếu, nhưng ở san hô lửa, nó đủ mạnh để gây tổn thương cho con